INTRODUCCIÓN

Los primeros trabajos de fecundación in vitro en bovinos utilizaron ovocitos recuperados de hembras superovuladas y espermatozoides capacitados en el útero de conejas (Iritani y Niwa, 1977; Hanada y Nagase,1981). Estudios posteriores han utilizado ovocitos madurados en condiciones in vitro, así como espermatozoides seleccionados y capacitados en medio de cultivo (Greve y col., 1987; Xu y col., 1987; Goto y col., 1988; 1989; Kim y col., 1990; Bavister y col., 1992; Lonergan y col., 1997).

in vivo se inicia después de las 20 horas desde el peak preovulatorio de gonadotrofina (Hyttel y col, 1997), donde se inician una serie de procesos bioquímicos en el gameto conducentes a cambios morfológicos y funcionales (Downs, 1993). A nivel nuclear, el ovocito reinicia la meiosis detenida en la etapa de dictiateno de la primera profase meiótica, para alcanzar el estado de metafase de la segunda división meiótica, siendo ovulado en este estado, conocido como metafase II (Wassarman, 1994). La maduración in vitro implica por tanto, no sólo el reinicio de la meiosis, sino además que el ovocito adquiera competencia para ser fecundado y competencia de desarrollo. Sin embargo, la tasa de desarrollo in vitro de ovocitos madurados y fecundados in vitro ha sido baja en comparación a los madurados in vivo (Greve y col., 1987; Thibault y col., 1987; Hawk y col., 1992; Brackett y Zuelke, 1993; Im y Park, 1995). Esta baja tasa de éxito se debe en parte, a que las características y condiciones apropiadas que conducen al desarrollo in vitro, no son aún bien conocidas.

Una fuente importante de ovocitos la constituyen ovarios obtenidos de vacas de matadero, los cuales proporcionan una abundante cantidad de ovocitos, pudiendo ser madurados y fecundados in vitro. Existe, sin embargo, una gran variación en la apariencia de estos ovocitos bovinos inmaduros (Leifried y First, 1979; Hyttel y col., 1986; de Loos y col., 1989; Madison y col., 1992; Hazeleger y col., 1995). La adecuada selección de los ovocitos para ser madurados en el laboratorio es crucial para el éxito de la fecundación y el desarrollo embrionario subsecuente. Las características morfológicas del ovocito a madurar son importantes (Leifried y col. (1986), ya que de ello dependerá, que pueda reiniciar la meiosis (Moor, 1990; Wassarman, 1994), así como la maduración citoplasmática (Barros, 1987); Por esta razón, el objetivo del presente trabajo fue establecer un patrón de clasificación no invasivo (mediante microscopía de luz) de ovocitos de bovino, estableciendo categorías que permitan identificar mejor a aquellos gametos que se vayan a utilizar y puedan tener mejores probabilidades de manipulación y maduración en cultivo, logrando optimizar de esa forma, los protocolos para la fecundación in vitro en esta especie.

 

MATERIAL Y MÉTODOS

Obtención y preparación de las muestras

Se trabajó con 1206 ovocitos provenientes de ovarios de hembras bovinas en diferentes estados fisiológicos sacrificadas en mataderos locales. Los ovarios se transportaron en una solución salina de NaCl (0,9%) a temperatura ambiente suplementada con antibióticos (100 mg/ml de estreptomicina y 100 U.I/ml o 60 mg/ml de penicilina sódica) (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) (De los Reyes, 1992).

Se utilizaron ovocitos obtenidos de los folículos antrales de 2 - 6 mm de diámetro según las técnicas descritas por De los Reyes y col. (1996), los cuales se lavaron a través de pipeteo suave 3 - 4 veces en medio TCM 199 (Gibco, Grand Island NY # 380-2340) suplementado con de 10% de suero fetal bovino inactivado (Gibco).

Clasificación de los ovocitos

Antes de iniciar el cultivo para inducir la maduración, los ovocitos obtenidos se clasi­ficaron en un microscopio estereoscópico, en seis categorías según sus características cito­plasmáticas y de cubiertas ovocitarias (células del cúmulo) (Cuadro 1) (Leibfried y First, 1979; de Loos y col.,1989).

Control de la Viabilidad

Después de la clasificación de los ovocitos, se hicieron controles de viabilidad a un 10% de la población de huevos, mediante el fluorocromo diacetato de fluoresceína (FDA), según la técnica descrita por Barros y col. (1982). En breve, consistió en la preparación de una solución de FDA, diluída 1:1000 (10 mg/ m1 de acetona), donde se colocaron lo ovocitos por 5 minutos previo a su observación en el microscopio de epifluorescencia. Sólo se consideraron viables aquellos ovocitos que presentaron una fluor­escencia muy brillante.

Maduración in vitro de los ovocitos

Cada categoría ovocitaria se maduró in vitro en forma separada, depositando aproxima­damente 10 ovocitos en gotas de 50 ¡al de medio de cultivo cubiertas con aceite mineral estéril (Squibb®) dentro de cápsulas Falcon # 3001. El medio de cultivo utilizado fue el TCM 199 (Gibco®) (Sirard y col., 1988; Lim y col., 1992), suplementado al momento de usarlo con 10% de suero fetal bovino (Gibco®), 0,2 mM de piruvato de sodio (Sigma®), 5 mg/ml (0,005 U/ml) de FSH-P (Sigma®) (De los Reyes, 1992) y 1 mg/ml de gentamicina (Sigma®). El medio de maduración se esterilizó por filtración a través de membranas Millipore de 0,22.im estériles.

La maduración in vitro de los ovocitos se hizo a 39°C (Lenz y col., 1983) en una atmósfera de 5% de CO2 con 98% de humedad, por un período de 24 horas (Lim y col., 1992)

Evaluación de la Maduración

Luego de completar el período de maduración, los ovocitos de cada categoría se lavaron en medio TALP- bicarbonato (Parrish y col., 1988) eliminándose las células del cúmulo mediante agitación por 5 minutos en vortex. Los ovocitos desnudos se montaron en portaojetos y se fijaron en ácido acético - etanol (1:3) por 24 horas antes de la tinción, la que se hizo con aceto-orceina (1% de orceina y 45% de ácido acético) (Shamsuddin y col., 1993). Los ovocitos se evaluaron en un microscopio de contraste de fase, usando como criterio de maduración, los siguientes estados:

Análisis de los resultados

Se realizó un total de 10 réplicas experimentales. En cada oportunidad se trabajó con 100 a 150 ovocitos. Se hicieron análisis de varianza utilizando la prueba de Student-Newman-Keuls (SNK) para determinar diferencias estadísticas entre las distintas categorías (Sokal y Rohlf, 1981).

 

RESULTADOS

Un total de 1206 ovocitos de hembras bovinas se maduraron in vitro por 24 horas en medio TCM 199 suplementado. Los ovocitos se clasificaron en distintas categorías (Cuadro 1; Figura 1); los porcentajes de maduración obtenidos en las seis diferentes categorías se presentan en la Cuadro 2.

La categoría de los ovocitos que mantenían las células del cúmulo (1, 2 y 3) mostraron, a la observación por lupa estereoscópica, expansión (mucificación) de éstas luego de la maduración in vitro por 24 horas (Figura 2a). La maduración completa de los ovocitos se evidenció en aquellos huevos que habían reiniciado la meiosís, quedando sus cromosomas en la segunda placa metafásica, con eliminación del primer corpúsculo polar (Figura 2b).

De la población de ovocitos (1206), los correspondientes a la (287), es decir a aquellos con citoplasmas homogéneo y totalmente cubierto por una masa compacta de células del cúmulo oosfero, 75,3% llegaron al estado de metafase II, valor significativamente diferente (p < 0,05) a las otras cinco categorías de ovocitos (Figura 3)

Las categorías 3 y 6, que correspondieron a los ovocitos con citoplasma homogéneo o polarizado respectivamente, pero desprovistos

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de las células del cúmulo, tuvieron los valores más bajos de maduración (34,9% y 31% respectivamente) en relación a las otras categorías (p < 0,05), sin encontrarse di­ferencias significativas respecto a los porcentajes de maduración en cultivo entre estos dos tipos de gametos (p < 0,05) (Cuadro 2). Los ovocitos de las categorías 2, 4 y 5 en cambio, obtuvieron los porcentajes intermedios de maduración ovocitaria (64,4%, 55,5% y 47,2% respectivamente), registrándose dife­rencias estadísticas (p < 0,05) entre estos valores (Cuadro 2).

La sobrevida de los ovocitos pre maduración, evaluada mediante la tinción FDA, mostró ovocitos viables, evidenciando fluorescencia a la observación con el microscopio (Figura 4). En este trabajo, se obtuvo 80,7% de viabilidad previo a la maduración y 77,1% post maduración in vitro .

 

DISCUSIÓN

La disponibilidad de ovocitos viables y competentes pera continuar el desarrollo, ha sido crítico para el progreso de la fecundación in vitro, como también para el cultivo de embriones y biotecnologías reproductivas asociadas. La posibilidad de seleccionar los ovocitos previo a su maduración, fue examinada en bovinos inicialmente por Leibfried y First (1979) y Leifried y col. (1986), cuyos resultados demostraron que la capacidad de experimentar maduración nuclear in vitro no dependía del tamaño del folículo ni de la etapa del ciclo estral en que se encontraba la hembra, pero sí adquirirían importancia las características morfológicas de los gametos para su maduración en cultivo.

En este trabajo los ovocitos bovinos inma­duros en estado de vesícula germinativa (V.G), se categorizaron morfológicamente. La clasificación de los ovocitos a través del microscopio de disección, en base a carac­terísticas citoplasmáticas (homogeneidad) y cubiertas foliculares (células del cúmulo y de la corona radiada), puedieron utilizarse satis­factoriamente para seleccionar aquellos ovocitos inmaduros y relacionarlo a su capacidad de maduración en cultivo. De acuerdo a ello, se obtuvieron los mejores resultados de maduración en los gametos que conservaban intactas sus cubiertas ovocitarias previo a la incubación y por el contrario, los porcentajes de maduración más bajos se observaron en aquellos que se encontraban desprovistos de las células del cúmulo . Estos resultados confirman lo descrito en otros estudios (Sirard y First, 1988; Madison y col., 1992), donde se señala que la remoción de todas las células de la corona y del cúmulo en bovinos, previo a la incubación in vitro, estaría relacionado a una posterior disminución del reinicio meiótico. La masa de células del cúmulo jugaría un rol importante en la regulación de la actividad del ovocito. Ovocitos porcinos desprovistos de las cubiertas ovocitarias, también presentan porcentajes bajos de maduración (Toyoda y col., 1992). La suplementación con células foliculares al cultivo de ovocitos inmaduros, compensa la falta de células somáticas durante la maduración, logrando un efecto positivo en el desarrollo embrionario posterior in vivo (Xu y col., 1987; Lu y col., 1989) e in vitro (Fukui y Ono, 1988; Younis y col., 1989; Fukui, 1990; Hyttel y col., 1997). La relación entre el ovocito y las células foliculares se modifica durante el período de maduración como resultado de cambios en la membrana del ovocito y el sistema de señales intercelulares (Thiboult, 1977; Moor,1990; Wassarman, 1994). Los ovocitos denudados de las células del cúmulo serían incapaces de responder a la LH y FSH, ya que estas células son las mediadoras del efecto de las gona­dotrofinas sobre el huevo (Ball y col.,1983; 1984; Brackett y col., 1989; Zuelke y Brackett, 1990; Sirard y col., 1992); además, una comunicación extensa y directa entre las células foliculares y el ovocito facilitaría la producción de nutrientes y su transporte hacia el huevo (Moor, 1990).

La maduración de ovocitos de bovino ha sido estudiada mediante microscopía de luz y electrónica, bajo condiciones in vivo e in vitro (Hyttel y col, 1986; Xu y col., 1986; Suzuki y col., 1994). Estudios a nivel de la ultra-estructura de los ovocitos de bovino muestran variaciones entre los ovocitos con cubierta folicular compacta y aquellos con una cubierta menos compactada. Estas diferencias se manifestarían en las características cito­plasmáticas, como son la distribución y organización de los diferentes organelos (de Loos y col.,1989). Sin embargo, a pesar de estas variaciones, estos investigadores encontraron diferencias en la competencia meiótica en sólo uno de los diferentes tipos de ovocitos madurados in vitro, lo que difiere con los resultados de este trabajo. No obstante lo anterior, esas diferencias a nivel ultra-estructural encontradas por estos autores, podrían estar relacionadas a la capacidad de desarrollo posterior de los ovocitos.

Los ovocitos cuyos citoplasmas tenían características no homogenea, presentando aspecto granular (categorías 4, 5 y 6), tuvieron porcentajes menores en la maduración nuclear respecto a aquellos ovocitos con el citoplasma homogéneo (categorías 1, 2 y 3). Estas diferencias que se observaron podrían estar relacionadas a procesos de atresia. Se ha descrito que los ovocitos de bovino provenientes de folículos atrésicos tendrían, entre otras características, menor homogeneidad en su citoplasma (Kruip y col., 1983; Leibfried y col., 1989), presentando una coloración más oscura que estaría relacionada a depósitos de lípidos y agrupación de organelos (de Loos y col., 1989). En trabajos previos, se señala que aproxi­madamente el 80% de los folículos presentes en un ovario de vaca, en cualquier momento del ciclo, estarían en proceso de atresia (Hazeleger y col. 1995). En el presente estudio se obtuvo un 77,2% de viabilidad celular posterior al cultivo y 56,4% de maduración nuclear (ovocitos en metafase II) considerando todos los ovocitos de las diferentes categorias, lo que indica un porcentaje menor de ovocitos atrésicos al momento de la maduración in vitro. No obstante, es posible que un porcentaje importante de ellos, especialmente aquellos desprovistos de las células del cúmulo, estuvieran iniciando un proceso degenerativo.

En el proceso de maduración normalmente el espacio entre las células del cúmulo aumenta, perdiéndose las uniones intercelulares debido al depósito de glicosaminoglicanos (principalmente ácido hialurónico) y piruvato a la matriz extracelular (Ball y col., 1983; 1984). Este fenómeno de expansión del cúmulo, conocido como mucificación, al igual que el reinicio meiótico, pudieron ser inducidos in vitro durante la maduración en cultivo en las ca­tegorías de ovocitos que conservaron las células del cúmulo (categorías 1, 2 y 3). Factores importantes en la mucificación serían el aporte de la hormona folículo estimulante (FSH) al medio de maduración, la que estimula la síntesis de ácido hialurónico; el suero fetal bovino que retendría el ácido hialurónico en la matríz (Leibfried y col., 1986; Fenton y col., 1993; Kito y Bavister, 1997), como también factores solubles, aún no bien identificados bioquí­micamente, producidos por los ovocitos y que iniciarían y estimularían la síntesis de ácido hialurónico (Kito y Bavister, 1997). Sin embargo, hay que considerar que la sóla expansión y reinicio meiótico de los huevos no implica que sean funcionalmente maduros y aptos para ser fecundados.

Los datos de este trabajo confirman la gran variación en el aspecto de los ovocitos de vaca, previa maduración en cultivo, y la diferente capacidad de maduración in vitro de estos distintos tipos de ovocitos. Sin embargo, la influencia de estas diferencias en el proceso de maduración ovocitaria para el uso de la tec­nología in vitro, sólo serían factibles de evaluar con la fecundación in vitro y desarrollo posterior de los embriones derivados de estos gametos.

 

REFERENCIAS