El diagnóstico de brucelosis bovina se ve dificultado por la presencia de anticuerpos inducidos por la vacuna Cepa 19, ya sea usada en forma tradicional o como alternativa de vacunación en dosis reducida en animales adultos, para áreas de alta prevalencia (Alton y Corner, 1981; Pinochet y col., 1991). Las pruebas serológicas convencionales (aglutinación y fijación de complemento) e incluso pruebas de enzimo-inmunoensayo (ELISA) que detectan anticuerpos contra el lipopolisacárido liso (s-LPS) de Brucella, no tienen la capacidad de establecer una clara diferencia entre los animales infectados en forma natural y aquellos reactores debidos a una vacunación reciente con Cepa 19 (Sutherland y Searson, 1990).
Desde hace algunos años se han obtenido antígenos solubles de Brucella, que utilizados en pruebas de inmunodifusión, tienen la capacidad de descartar las respuestas postvacunales a Cepa 19 (Díaz y col., 1979; Díaz y col., 1981; Cherwonogrodzky y Nielsen, 1988; Pinochet y col., 1990).
Trabajos posteriores han demostrado que básicamente en todos estos antígenos, la capacidad de diferenciar bovinos infectados de vacunados está dada por la reactividad en contra de la cadena O-polisacárida que compone el s-LPS de la estructura externa de la bacteria (Cherwonogrodzky y col., 1990).
El mecanismo en que se basa esta capacidad de diferenciación, se refiere a la diferente especificidad y cantidad de los anticuerpos producidos por los bovinos infectados o vacunados frente a epítopes multivalentes del largo de la cadena O-polisacárida y en contra del epítope inmunodominante del extremo distal de esta misma (Cherwonogrodzky y col., 1990). Debido a las limitaciones que presentan las técnicas de ID respecto a su sensibilidad y por utilizar mayor cantidad de antígeno, es que se han desarrollado pruebas de ELISA que posibilitan acomodar la técnica a los requerimientos de cada laboratorio (Nielsen y col., 1989; Wright y col., 1990).
En nuestro laboratorio hemos producido y normalizado un antígeno soluble de Brucella a través de una metodología simple y de bajo costo que cumple con las características descritas anteriormente cuando es usado en una prueba de inmunodifusión en agarosa (ID) (Pinochet y col., 1990). El objetivo de este trabajo es adherir este antígeno a una fase sólida y luego desarrollar un ELISA indirecto, verificando si el antígeno mantiene su cualidad de discriminar entre animales vacunados con Cepa 19 y aquellos infectados con cepas de campo.
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Trabajo financiado por proyecto FONDECYT 91/1184 y por aportes de Agencia Internacional de Energía Atómica (IAEA). |
A. Establecimiento de la fase sólida
1. Preparación de antígeno soluble
Se preparó un antígeno soluble polisacárido (PS) de Brucella abortus 1119-3 siguiendo las recomendaciones de Pinochet y col. (1990), con una concentración final de hexosas de 230 μg/ml. Este antígeno contiene menos de 0,01 % de ácido 2-keto-3-deoxyoctulosónico (KDO) y por lo tanto se considera libre de s-LPS, y contiene menos de 0,5% de proteínas del grupo 3 de membrana externa[1].
2. Alternativas consultadas
a) Tipo de placa: uso de 3 tipos de placas, NUNC 269620, NUNC MaxiSorp y Dynatech Immulon2, todas de poliestireno y con diferentes capacidades de adsorción según indicaciones del fabricante.
b) Tampón de sensibilización (TS): para sensibilizar las placas con el antígeno, éste fue diluido en diferentes tampones; solución acetato 0,2M, pH 4,2; solución salina fosfatada (PBS) 0,01 M, pH 7,40+/–0,20, solución carbonato/bicarbonato 0,05M, pH 9,60+/–0,05.
c) Dilución del antígeno: el antígeno PS normalizado, fue utilizado en las diluciones 1:10 (23μg/ml), 1:50 (4,6 μg/ml) 1:100 (2, 3 μg/ml) y 1:200 (1,15 μg/ml).
La sensibilización se realizó a temperatura ambiente durante 18 horas aproximadamente.
En esta etapa de determinación de la alternativa que ofreciera las condiciones óptimas para la fase sólida se utilizaron dos grupos de 4 sueros cada uno, diluidos 1:200 en PBS con Tween 20, 0,05% v/v y que correspondían a:
Sueros bovinos positivos a diferentes pruebas tradicionales, siendo uno de ellos un suero de referencia para diagnóstico de brucelosis bovina mediante ELISA-s-LPS y otros 3 sueros de animales infectados naturalmente con Brucella, comprobados por cultivo bacteriológico. Sueros bovinos provenientes de áreas libres de la enfermedad y donde no se utiliza la Cepa 19 y que fueron negativos a pruebas tradicionales de diagnóstico de brucelosis.3. Desarrollo de la técnica
En cada una de las alternativas utilizadas, el desarrollo de la técnica se realizó en las siguientes condiciones:
El volumen de trabajo, en todas las etapas, fue de 50 μg/mlpor cada pocillo de la placa.
Se realizó un ciclo de 3 lavados con una solución PBS 0,002M, pH 7,40+/–0,20 y Tween 20, 0,05% v/v, mediante un lavador de microplacas Immunowash NUNC, previo a la aplicación de los sueros, que fueron incubados a 37°C por 1 hora.
Luego de otro ciclo de lavados se añadió un conjugado de peroxidasa anti-IgG bovina obtenido en conejo, con actividad frente a cadenas livianas y pesadas de inmunoglobulinas bovinas, del cual se probaron las diluciones 1:1.600, 1:3.200 y 1:4.800 preparadas en PBS.
Luego de una segunda incubación y un ciclo de lavados se procedió a añadir una solución de sustrato compuesto por 1 mM de ABTS[2] y 4.4mM de H2O2 en tampón citrato de sodio/ácido cítrico 0,05M, pH 4,50+/–0,05. Se dejó reaccionar durante 15 minutos, después de los cuales la reacción se detuvo con una solución de azida de sodio 1 mM (IAEA/FAO, 1989; IAEA/FAO, 1992).
La lectura de las reacciones se realizó en un equipo IMMUNOSKAN Plus BDSL con un filtro de 405 nm que entrega lecturas de densidades ópticas (OD).
Para determinar las concentraciones óptimas de antígeno y conjugado (se consideró como concentración óptima a la mínima cantidad de reactivo que entregara una OD cercana a 1,000, al usar un suero positivo de referencia) se realizó una titulación del tipo 'chekerboard' para cada tipo de microplaca y solución de sensibilización.
El criterio que se utilizó para seleccionar las mejores alternativas respecto de tipo de placa y TS, fue lo que se denominó Razón de Adsorción (RA) y que corresponde a la razón entre el promedio de densidades ópticas (OD) de los 4 sueros positivos y los 4 sueros negativos utilizados en esta etapa.
RA = | Promedio OD (+)Promedio OD (-) |
Se consideraron como útiles aquellas combinaciones de tipo de placa y TS que tuvieron un RA ≥ 6, o sea que la razón entre los promedios de OD de sueros positivos y negativos fuese igual o mayor de seis veces (IAEA/FAO, 1989).
Para la evaluación del ELISA-PS se seleccionaron, en esta etapa, los dos tipos de placas, el TS y las diluciones de antígeno y conjugado con que se obtuvieron los mayores RA.
B. Evaluación de ELISA-PS
l. Desarrollo de la prueba
Considerando el material y la metodología seleccionados en la etapa anterior fueron sometidos a la prueba de ELISA los siguientes grupos de sueros:
Sueros positivos: este grupo reunió 48 sueros de bovinos positivos a pruebas tradicionales como seroaglutinación en placa (SAP), Rosa de Bengala (RB) y fijación de complemento (FC), además de ID, y procedentes de bovinos con cultivo bacteriológico de Brucella abortus. Sueros negativos: este grupo reunió 78 sueros bovinos negativos a SAP, RB, FC e ID, que provenían de animales de zonas donde no se aplica Cepa 19. Sueros positivos por vacunación: se reunieron 120 sueros de bovinos, obtenidos entre 3 y 9 meses después de ser vacunados tradicionalmente con Cepa 19. Estos sueros eran reaccionantes a pruebas tradicionales, pero negativos a la prueba de ID.Se utilizó como controles a los siguientes sueros:
Control positivo (+) 1: 'pool' de sueros de 10 animales con cultivo bacteriológico, reaccionantes a SAP, RB, FC, ID y ELISA s-LPS. Control positivo (+) 2: suero positivo de referencia obtenido del Laboratorio Central Veterinario (CVL) de Weybridge, Inglaterra. Control negativo (–): suero negativo de referencia de la misma procedencia que el anterior. Todos los sueros fueron probados en duplicado y para su evaluación se obtuvo el promedio de sus dos lecturas de OD.2. Interpretación de las lecturas
Para comparar a todos los sueros en una misma base las OD obtenidas fueron transformadas en un índice o valor 'i' de base 100, referido al valor de OD del suero control (+) 1 de cada placa (Alton y col., 1988; Ábalos y col., 1990), donde:
i = |
OD suero problema OD Control (+) 1 |
X 100 |
El punto de diferenciación positivo/negativo o corte +/-fue calculado, fijándose para cada tipo de placa, duplicando el promedio de los valores 'i' de los controles (–) y sueros reconocidos como negativos por su origen, según recomendaciones de IAEA/FAO (1989; I992) y modificación de Ábalos y col. (1990), donde:
Corte +/– = Promedio 'i'(–) x 2 |
Se realizó una distribución de los valores “i”, anotando el máximo y mínimo y se calculó posteriormente el promedio y su desviación estándar (DE), en cada grupo de animales.
Finalmente, se evaluó la prueba de ELISA-PS respecto de su sensibilidad y especificidad y su capacidad de discriminar frente a animales vacunados e infectados naturalmente.
__________
Notas
1 |
Estos análisis fueron una gentileza del Prof. Ignacio Moriyón (Universidad de Navarra, Pamplona, España). volver |
2 |
Ácido [2,2'- Azinobis(3-Azinobis (3-ethybenz-thiazolinesulfónico)] volver |
A. Establecimiento de la fase sólida
Las placas Dynatech Immulon2 y NUNC 269620 mostraron mejores niveles de adsorción y fijación del antígeno, alcanzando RA promedios de 9 y 13 respectivamente, siendo este RA para las placas NUNC Maxisorp sólo de 3. Los valores de OD promedio para sueros positivos y negativos en la placa Dynatech Immulon2 fueron 1,250 y 0,140 respectivamente; para la placa NUNC 269620 fueron 0,850 y 0,065. Con la placa NUNC Maxisorp se obtuvieron valores de OD de 0,110 para sueros positivos y de 0,035 para sueros negativos.
El TS con el cual se obtuvo los mejores RA en las placas Dynatech Immulon2 y NUNC 269620 fue el PBS pH 7,4+/–0,20.
La dilución óptima de antígeno fue de 1:50 lo que corresponde a una concentración de 4,6 μg/ml de hexosas.
La dilución de conjugado con la cual se obtuvo mejores resultados fue de 1:1.600.
B. Evaluación de ELISA–PS
Resultados utilizando la placa Dynatech Immulon2 (D2)
1. Distribución de los valores de 'i '
Los valores de 'i' para la placa D2 en cada grupo de animales se aprecia en el cuadro 1.
CUADRO 1 VALORES DE 'i' PARA TRES GRUPOS DE SUEROS BOVINOS OBTENIDOS EN ELISA-PS UTILIZANDO PLACAS DYNATECH IMMULON2
Valor de 'i' |
Sueros de bovinos |
||
Infectados |
Negativos |
Vacunados |
|
Rango |
15-112 |
2-48 |
1-83 |
Promedio |
77 |
14 |
14 |
D.E. |
27 |
7 |
8 |
2. Determinación de niveles de sensibilidad y, especificidad
El corte +/– para la placa D2 se estableció en el valor 'i' igual a 28 y respecto de éste se clasificaron los grupos previamente definidos como infectados o positivos, y no infectados o negativos, para calcular la sensibilidad y especificidad, como se muestra en el cuadro 2. Con estos valores se calculó una sensibilidad de 89,5% y una especificidad de 94,8%.
CUADRO 2 RESULTADOS DE ELISA-PS AL UTILIZAR PLACAS DYNATECH IMMULON2
Prueba de ELISA-PS |
Sueros bovinos |
|
Positivos |
Negativos |
|
(+) |
43 |
4 |
(-) |
5 |
4 |
TOTAL |
48 |
78 |
3. Respuesta frente a sueros de animales vacunados
El 95,8% de los sueros de animales vacunados estudiados, que eran positivos a pruebas tradicionales de diagnóstico, resultaron negativos a la prueba de ELISA-PS utilizando la placa D2.
Resultados de la placa NUNC 269620 (N3)
1. Distribución de los valores de 'i '
Los valores de 'i' para la placa N3 en cada grupo de animales se aprecian en el cuadro 3.
CUADRO 3 VALORES DE 'i' PARA TRES GRUPOS DE SUEROS BOVINOS OBTENIDOS EN ELISA-PS UTILIZANDO PLACAS NUNC 269620
Valor de 'i' |
Sueros de bovinos |
||
Infectados |
Negativos |
Vacunados |
|
Rango |
13-111 |
1-12 |
1-21 |
Promedio |
71 |
7 |
7 |
D.E. |
26 |
2 |
4 |
2. Determinación de niveles de sensibilidad y especificidad
El corte +/– para la placa N3 se estableció en el valor 'i' igual a 14 y respecto de éste se clasificaron los grupos definidos previamente como infectados o positivos, y no infectados o negativos, como se aprecia en el cuadro 4. Estos valores nos entregan una sensibilidad de 95,8% y una especificidad de I00%.
CUADRO 4 RESULTADOS DE ELISA-PS AL UTILIZAR PLACAS NUNC 269620
Prueba de ELISA-PS |
Sueros bovinos |
|
Positivos |
Negativos |
|
(+) |
46 |
0 |
(-) |
2 |
78 |
TOTAL |
48 |
78 |
3. Respuesta frente a sueros de animales vacunados
El 88,3% de los sueros de animales vacunados estudiados, positivos a pruebas diagnósticas tradicionales, fueron negativos a la prueba de ELISA–PS al utilizar la placa N3.
El objetivo básico de establecer una fase sólida con un antígeno soluble de Brucella abortos 1119-3 se logró satisfactoriamente. Se comprobó que la preparación de este antígeno, siendo sencilla es segura, obteniendo un buen rendimiento y un producto con las características funcionales de la cadena O y el Hapteno Nativo (NH), cuya pureza frente a proteínas es muy alta (0,5%). Preparaciones de cadena O obtenidas de B. abortus 11193 con métodos mucho más sofisticados consideran óptimo contaminaciones de proteínas de 1 % (Cherwonogrodzky y Nielsen, 1988). También se considera importante la escasa cantidad de KDO que no sobrepasó del 0,01 %, ya que en experiencias en que se preparó NH de B. melitensis 16M muy purificado mediante métodos también sofisticados, los niveles de 0,05 a 0,06% fueron considerados óptimos (Alonso-Urmeneta y col., 1988).
Las placas originalmente seleccionadas para este trabajo cubrieron un amplio espectro de capacidad de adsorción. Nielsen (1991), recomienda probar varios tipos de placas y TS para maximizar la capacidad de unión del antígeno. Esta unión, que es de tipo hidrofóbica, es más estable para los PS cuando se utilizan placas denominadas de rango medio de adsorción (Wright y col., 1990). Esto se comprobó al verificar que la placa NUNC Maxisorp que según el fabricante posee una alta capacidad de adsorción, no lo demostró en este caso frente a nuestro antígeno PS, sin embargo las placas Dynatech IMMULON2 (D2) y NUNC 269620 (N3) que se consideran de adsorción mediana, dieron mejores resultados. Esto está demostrado por los RA alcanzados por D2 y N3 que son alrededor de 50% (9) y 100% (13) mayores respectivamente, del valor mínimo (6) considerado para aceptar una placa como válida, mientras el RA de la placa NUNC Naxisorp sólo alcanzó a la mitad (3) de este valor.
El TS PBS pH 7,2-7,6 resultó ser el más adecuado para el establecimiento de la fase sólida, lo que concuerda con lo descrito por Nielsen y col. (1983), quienes también encuentran que el acetato pH 4,2 no permite una buena adsorción del antígeno independientemente del tipo de placa que se utilice. El TS carbonato/bicarbonato pH 9,6 también favoreció la adsorción del antígeno y ha sido recomendado por algunos autores (Nielsen y col., 1983; Alonso-Urmeneta y col., 1988; Nielsen y col., I989).
Trabajando con cadena O de B. abortus 11193 en el desarrollo de pruebas de ELISA, se han obtenido fases sólidas estables en poliestireno (Nielsen y col., 1989; Wright y col., I990). Otros autores reportan dificultades para absorber antígenos, que funcionalmente son similares al nuestro y que se conocen como Poly B y NH (Díaz y col., 1984; AlonsoUrmeneta y col., 1988), aunque con modificaciones basadas en nuestro protocolo, últimamente han logrado establecer fases sólidas más estables utilizando diferentes antígenos PS purificados (Moriyón, 1992)*.
La capacidad del PS de absorberse al poliestireno es el resultado de la calidad de éste, del adecuado pH del TS y de la concentración utilizada. La escasa contaminación con s-LPS y proteínas del polisacárido utilizado en este trabajo, hace pensar que posee una capacidad propia de absorbieres al plástico cuando se dan las condiciones apropiadas.
Respecto a otros materiales, como clase de conjugado o sustrato, y metodología que constituyen el resto de la prueba y que no fueron motivo de análisis en este trabajo, se puede decir que funcionaron adecuadamente.
Existen varios métodos de calcular el punto de diferenciación entre sueros positivos y negativos o corte +/-, como son: el valor 'i' promedio del grupo negativo más tres desviaciones estándar; el valor 'i' promedio del centésimo percentil o el doble del valor 'i' promedio, también del grupo negativo. Se eligió este último método por ser el más sencillo, considerando que los valores de corte +/, determinado por los tres métodos resultan muy similares según IAEA/FAO, (1992).
En la evaluación de la prueba, los niveles de sensibilidad y especificidad para los dos tipos de placas seleccionados fueron altos, si se le compara con aquellos entregados por otras pruebas de diagnóstico de brucelosis. La placa en que se aprecian los mejores niveles de sensibilidad (95,8%) y especificidad (I00%) fue la NUNC 269620 (N3), resultado levemente superior en cuanto a sensibilidad de aquel obtenido por Pinochet y col. (1990), de 92,3%, con el uso del antígeno en pruebas de ID.
La capacidad de discriminar los animales vacunados, que eran positivos a otras pruebas de diagnóstico se aprecia al observar los cuadros 1 y 3, donde los valores de 'i' promedios de animales negativos y vacunados son muy semejantes y difieren manifiestamente de los de animales infectados.
Esta capacidad de discriminar se considera muy buena pues la placa D2 da como negativos a un 95,8% y la placa N3 a un 88,3% de los animales vacunados. Wright y col. (I990) utilizando cadena O como antígeno y en un ELISA competitivo que tiene la cualidad de amplificar la diferenciación en la respuesta de vacunados e infectados que entrega un ELISA indirecto, obtienen un 85% de reacciones negativas en animales vacunados.
Es conveniente señalar que los valores de 'i' de los sueros de animales vacunados con resultado positivo, son muy bajos y están ligeramente por encima del valor de corte +/, a excepción de un solo animal que resultó francamente positivo. Esto último podría deberse a que el animal fue muestreo en el momento máximo de producción de anticuerpos o también a la posible presencia de una infección concomitante (Wright y col., 1990). Referente a lo anterior puede suceder que algún animal vacunado estuviera iniciando una infección natural no pesquisada por la prueba de ID, que es de una sensibilidad analítica mucho menor que ELISA, o bien porque normalmente animales vacunados poseen algún grado de reactividad frente a epítopes específicos del largo de la cadena O, en etapas tempranas postvacunación durante el momento máximo de producción de anticuerpos (Wright y col., 1990).
La prueba de ELISA desarrollada en este estudio, capaz de discriminar entre animales vacunados con Cepa 19 y aquellos naturalmente infectados por cepas de campo, tiene altos niveles de sensibilidad y especificidad y estudios posteriores deben tender a probar alternativas respecto de otros tipos de conjugados y de ensayos en la modalidad de competición, para así optimizar las cualidades del antígeno polisacárido.
__________
Nota
* | Comunicación personal, 1992. volver |
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