Introducción

El diagnóstico de brucelosis bovina se ve dificulta­do por la presencia de anticuerpos inducidos por la vacuna Cepa 19, ya sea usada en forma tradicional o como alternativa de vacunación en dosis reducida en animales adultos, para áreas de alta prevalencia (Alton y Corner, 1981; Pinochet y col., 1991). Las pruebas serológicas convencionales (aglutinación y fijación de complemento) e incluso pruebas de en­zimo-inmunoensayo (ELISA) que detectan anti­cuerpos contra el lipopolisacárido liso (s-LPS) de Brucella, no tienen la capacidad de establecer una clara diferencia entre los animales infectados en forma natural y aquellos reactores debidos a una vacunación reciente con Cepa 19 (Sutherland y Searson, 1990).

Desde hace algunos años se han obtenido antíge­nos solubles de Brucella, que utilizados en pruebas de inmunodifusión, tienen la capacidad de descartar las respuestas postvacunales a Cepa 19 (Díaz y col., 1979; Díaz y col., 1981; Cherwonogrodzky y Niel­sen, 1988; Pinochet y col., 1990).

Trabajos posteriores han demostrado que básica­mente en todos estos antígenos, la capacidad de diferenciar bovinos infectados de vacunados está dada por la reactividad en contra de la cadena O-po­lisacárida que compone el s-LPS de la estructura externa de la bacteria (Cherwonogrodzky y col., 1990).

El mecanismo en que se basa esta capacidad de diferenciación, se refiere a la diferente especificidad y cantidad de los anticuerpos producidos por los bovinos infectados o vacunados frente a epítopes multivalentes del largo de la cadena O-polisacárida y en contra del epítope inmunodominante del extre­mo distal de esta misma (Cherwonogrodzky y col., 1990). Debido a las limitaciones que presentan las técnicas de ID respecto a su sensibilidad y por utilizar mayor cantidad de antígeno, es que se han desarrollado pruebas de ELISA que posibilitan aco­modar la técnica a los requerimientos de cada labo­ratorio (Nielsen y col., 1989; Wright y col., 1990).

En nuestro laboratorio hemos producido y nor­malizado un antígeno soluble de Brucella a través de una metodología simple y de bajo costo que cumple con las características descritas anterior­mente cuando es usado en una prueba de inmunodi­fusión en agarosa (ID) (Pinochet y col., 1990). El objetivo de este trabajo es adherir este antígeno a una fase sólida y luego desarrollar un ELISA indi­recto, verificando si el antígeno mantiene su cuali­dad de discriminar entre animales vacunados con Cepa 19 y aquellos infectados con cepas de campo.

__________

 Trabajo financiado por proyecto FONDECYT 91/1184 y por aportes de Agencia Internacional de Energía Atómica (IAEA).

Material y métodos

A. Establecimiento de la fase sólida

1. Preparación de antígeno soluble

Se preparó un antígeno soluble polisacárido (PS) de Brucella abortus 1119-3 siguiendo las recomenda­ciones de Pinochet y col. (1990), con una concentra­ción final de hexosas de 230 μg/ml. Este antígeno contiene menos de 0,01 % de ácido 2-keto-3-deox­yoctulosónico (KDO) y por lo tanto se considera libre de s-LPS, y contiene menos de 0,5% de proteí­nas del grupo 3 de membrana externa[1].

2. Alternativas consultadas

a) Tipo de placa: uso de 3 tipos de placas, NUNC 269620, NUNC MaxiSorp y Dynatech Immulon2, todas de poliestireno y con diferentes capacidades de adsorción según indicaciones del fabricante.

b) Tampón de sensibilización (TS): para sensibi­lizar las placas con el antígeno, éste fue diluido en diferentes tampones; solución acetato 0,2M, pH 4,2; solución salina fosfatada (PBS) 0,01 M, pH 7,40+/–0,20, solución carbonato/bicarbonato 0,05M, pH 9,60+/–0,05.

c) Dilución del antígeno: el antígeno PS norma­lizado, fue utilizado en las diluciones 1:10 (23μg/ml), 1:50 (4,6 μg/ml) 1:100 (2, 3 μg/ml) y 1:200 (1,15 μg/ml).

La sensibilización se realizó a temperatura am­biente durante 18 horas aproximadamente.

En esta etapa de determinación de la alternativa que ofreciera las condiciones óptimas para la fase sólida se utilizaron dos grupos de 4 sueros cada uno, diluidos 1:200 en PBS con Tween 20, 0,05% v/v y que correspondían a:

Sueros bovinos positivos a diferentes pruebas tradicionales, siendo uno de ellos un suero de refe­rencia para diagnóstico de brucelosis bovina me­diante ELISA-s-LPS y otros 3 sueros de animales infectados naturalmente con Brucella, comproba­dos por cultivo bacteriológico. Sueros bovinos provenientes de áreas libres de la enfermedad y donde no se utiliza la Cepa 19 y que fueron negativos a pruebas tradicionales de diag­nóstico de brucelosis.

3. Desarrollo de la técnica

En cada una de las alternativas utilizadas, el desarro­llo de la técnica se realizó en las siguientes condicio­nes:

El volumen de trabajo, en todas las etapas, fue de 50 μg/mlpor cada pocillo de la placa.

Se realizó un ciclo de 3 lavados con una solución PBS 0,002M, pH 7,40+/–0,20 y Tween 20, 0,05% v/v, mediante un lavador de microplacas Immuno­wash NUNC, previo a la aplicación de los sueros, que fueron incubados a 37°C por 1 hora.

Luego de otro ciclo de lavados se añadió un conjugado de peroxidasa anti-IgG bovina obtenido en conejo, con actividad frente a cadenas livianas y pesadas de inmunoglobulinas bovinas, del cual se probaron las diluciones 1:1.600, 1:3.200 y 1:4.800 preparadas en PBS.

Luego de una segunda incubación y un ciclo de lavados se procedió a añadir una solución de sustra­to compuesto por 1 mM de ABTS[2] y 4.4mM de H2O2 en tampón citrato de sodio/ácido cítrico 0,05M, pH 4,50+/–0,05. Se dejó reaccionar durante 15 minutos, después de los cuales la reacción se detuvo con una solución de azida de sodio 1 mM (IAEA/FAO, 1989; IAEA/FAO, 1992).

La lectura de las reacciones se realizó en un equipo IMMUNOSKAN Plus BDSL con un filtro de 405 nm que entrega lecturas de densidades ópti­cas (OD).

Para determinar las concentraciones óptimas de antígeno y conjugado (se consideró como concen­tración óptima a la mínima cantidad de reactivo que entregara una OD cercana a 1,000, al usar un suero positivo de referencia) se realizó una titulación del tipo 'chekerboard' para cada tipo de microplaca y solución de sensibilización.

El criterio que se utilizó para seleccionar las mejores alternativas respecto de tipo de placa y TS, fue lo que se denominó Razón de Adsorción (RA) y que corresponde a la razón entre el promedio de densidades ópticas (OD) de los 4 sueros positivos y los 4 sueros negativos utilizados en esta etapa.

RA = Promedio OD (+)Promedio OD (-)

Se consideraron como útiles aquellas combina­ciones de tipo de placa y TS que tuvieron un RA ≥ 6, o sea que la razón entre los promedios de OD de sueros positivos y negativos fuese igual o mayor de seis veces (IAEA/FAO, 1989).

Para la evaluación del ELISA-PS se selecciona­ron, en esta etapa, los dos tipos de placas, el TS y las diluciones de antígeno y conjugado con que se ob­tuvieron los mayores RA.

B. Evaluación de ELISA-PS

l. Desarrollo de la prueba

Considerando el material y la metodología seleccio­nados en la etapa anterior fueron sometidos a la prueba de ELISA los siguientes grupos de sueros:

Sueros positivos: este grupo reunió 48 sueros de bovinos positivos a pruebas tradicionales como se­roaglutinación en placa (SAP), Rosa de Bengala (RB) y fijación de complemento (FC), además de ID, y procedentes de bovinos con cultivo bacterio­lógico de Brucella abortus. Sueros negativos: este grupo reunió 78 sueros bovinos negativos a SAP, RB, FC e ID, que prove­nían de animales de zonas donde no se aplica Cepa 19. Sueros positivos por vacunación: se reunieron 120 sueros de bovinos, obtenidos entre 3 y 9 meses después de ser vacunados tradicionalmente con Cepa 19. Estos sueros eran reaccionantes a pruebas tradicionales, pero negativos a la prueba de ID.

Se utilizó como controles a los siguientes sueros:

Control positivo (+) 1: 'pool' de sueros de 10 animales con cultivo bacteriológico, reaccionantes a SAP, RB, FC, ID y ELISA s-LPS. Control positivo (+) 2: suero positivo de refe­rencia obtenido del Laboratorio Central Veterinario (CVL) de Weybridge, Inglaterra. Control negativo (–): suero negativo de referen­cia de la misma procedencia que el anterior. Todos los sueros fueron probados en duplicado y para su evaluación se obtuvo el promedio de sus dos lecturas de OD.

2. Interpretación de las lecturas

Para comparar a todos los sueros en una misma base las OD obtenidas fueron transformadas en un índice o valor 'i' de base 100, referido al valor de OD del suero control (+) 1 de cada placa (Alton y col., 1988; Ábalos y col., 1990), donde:

i =

OD suero problema OD Control (+) 1

X 100

El punto de diferenciación positivo/negativo o corte +/-fue calculado, fijándose para cada tipo de placa, duplicando el promedio de los valores 'i' de los controles (–) y sueros reconocidos como negati­vos por su origen, según recomendaciones de IAEA/FAO (1989; I992) y modificación de Ábalos y col. (1990), donde:

Corte +/– = Promedio 'i'(–) x 2

Se realizó una distribución de los valores “i”, anotando el máximo y mínimo y se calculó poste­riormente el promedio y su desviación estándar (DE), en cada grupo de animales.

Finalmente, se evaluó la prueba de ELISA-PS respecto de su sensibilidad y especificidad y su capacidad de discriminar frente a animales vacuna­dos e infectados naturalmente.

__________

Notas

1

Estos análisis fueron una gentileza del Prof. Ignacio Moriyón (Universidad de Navarra, Pamplona, España). volver

2

Ácido [2,2'- Azinobis(3-Azinobis (3-ethybenz-thiazolinesulfónico)] volver

Resultados

A. Establecimiento de la fase sólida

Las placas Dynatech Immulon2 y NUNC 269620 mostraron mejores niveles de adsorción y fijación del antígeno, alcanzando RA promedios de 9 y 13 respectivamente, siendo este RA para las placas NUNC Maxisorp sólo de 3. Los valores de OD promedio para sueros positivos y negativos en la placa Dynatech Immulon2 fueron 1,250 y 0,140 respectivamente; para la placa NUNC 269620 fue­ron 0,850 y 0,065. Con la placa NUNC Maxisorp se obtuvieron valores de OD de 0,110 para sueros positivos y de 0,035 para sueros negativos.

El TS con el cual se obtuvo los mejores RA en las placas Dynatech Immulon2 y NUNC 269620 fue el PBS pH 7,4+/–0,20.

La dilución óptima de antígeno fue de 1:50 lo que corresponde a una concentración de 4,6 μg/ml de hexosas.

La dilución de conjugado con la cual se obtuvo mejores resultados fue de 1:1.600.

B. Evaluación de ELISA–PS                

Resultados utilizando la placa Dynatech Immulon2 (D2)

1. Distribución de los valores de 'i '

Los valores de 'i' para la placa D2 en cada grupo de animales se aprecia en el cuadro 1.

CUADRO 1 VALORES DE 'i' PARA TRES GRUPOS DE SUEROS BOVINOS OBTENIDOS EN ELISA-PS UTILIZANDO PLACAS DYNATECH IMMULON2

Valor de 'i'

Sueros de bovinos

Infectados

Negativos

Vacunados

Rango

15-112

2-48

1-83

Promedio

77

14

14

D.E.

27

7

8

2. Determinación de niveles de sensibilidad y, especificidad

El corte +/– para la placa D2 se estableció en el valor 'i' igual a 28 y respecto de éste se clasificaron los grupos previamente definidos como infectados o positivos, y no infectados o negativos, para calcular la sensibilidad y especificidad, como se muestra en el cuadro 2. Con estos valores se calculó una sensi­bilidad de 89,5% y una especificidad de 94,8%.

CUADRO 2 RESULTADOS DE ELISA-PS AL UTILIZAR PLACAS DYNATECH IMMULON2

Prueba de ELISA-PS

Sueros bovinos

Positivos

Negativos

(+)

43

4

(-)

5

4

TOTAL

48

78

3. Respuesta frente a sueros de animales vacunados

El 95,8% de los sueros de animales vacunados estu­diados, que eran positivos a pruebas tradicionales de diagnóstico, resultaron negativos a la prueba de ELISA-PS utilizando la placa D2.

Resultados de la placa NUNC 269620 (N3)

1. Distribución de los valores de 'i '

Los valores de 'i' para la placa N3 en cada grupo de animales se aprecian en el cuadro 3.

CUADRO 3 VALORES DE 'i' PARA TRES GRUPOS DE SUEROS BOVINOS OBTENIDOS EN ELISA-PS UTILIZANDO PLACAS NUNC 269620

Valor de 'i'

            Sueros de bovinos

Infectados

Negativos

 Vacunados

Rango

13-111

1-12

1-21

Promedio

71

7

7

D.E.

26

2

4

2. Determinación de niveles de sensibilidad y especificidad

El corte +/– para la placa N3 se estableció en el valor 'i' igual a 14 y respecto de éste se clasificaron los grupos definidos previamente como infectados o positivos, y no infectados o negativos, como se aprecia en el cuadro 4. Estos valores nos entregan una sensibilidad de 95,8% y una especificidad de I00%.

CUADRO 4 RESULTADOS DE ELISA-PS AL UTILIZAR PLACAS NUNC 269620

Prueba de ELISA-PS

Sueros bovinos

Positivos

Negativos

(+)

46

0

(-)

2

78

TOTAL

48

78

3. Respuesta frente a sueros de animales vacunados

El 88,3% de los sueros de animales vacunados estudiados, positivos a pruebas diagnósticas tradiciona­les, fueron negativos a la prueba de ELISA–PS al utilizar la placa N3.

Discusión

El objetivo básico de establecer una fase sólida con un antígeno soluble de Brucella abortos 1119-3 se logró satisfactoriamente. Se comprobó que la prepa­ración de este antígeno, siendo sencilla es segura, obteniendo un buen rendimiento y un producto con las características funcionales de la cadena O y el Hapteno Nativo (NH), cuya pureza frente a proteí­nas es muy alta (0,5%). Preparaciones de cadena O obtenidas de B. abortus 1119–3 con métodos mucho más sofisticados consideran óptimo contaminacio­nes de proteínas de 1 % (Cherwonogrodzky y Niel­sen, 1988). También se considera importante la es­casa cantidad de KDO que no sobrepasó del 0,01 %, ya que en experiencias en que se preparó NH de B. melitensis 16M muy purificado mediante métodos también sofisticados, los niveles de 0,05 a 0,06% fueron considerados óptimos (Alonso-Urmeneta y col., 1988).

Las placas originalmente seleccionadas para este trabajo cubrieron un amplio espectro de capacidad de adsorción. Nielsen (1991), recomienda probar varios tipos de placas y TS para maximizar la capa­cidad de unión del antígeno. Esta unión, que es de tipo hidrofóbica, es más estable para los PS cuando se utilizan placas denominadas de rango medio de adsorción (Wright y col., 1990). Esto se comprobó al verificar que la placa NUNC Maxisorp que según el fabricante posee una alta capacidad de adsorción, no lo demostró en este caso frente a nuestro antíge­no PS, sin embargo las placas Dynatech IMMU­LON2 (D2) y NUNC 269620 (N3) que se conside­ran de adsorción mediana, dieron mejores resultados. Esto está demostrado por los RA alcanzados por D2 y N3 que son alrededor de 50% (9) y 100% (13) mayores respectivamente, del valor mínimo (6) con­siderado para aceptar una placa como válida, mien­tras el RA de la placa NUNC Naxisorp sólo alcanzó a la mitad (3) de este valor.

El TS PBS pH 7,2-7,6 resultó ser el más adecua­do para el establecimiento de la fase sólida, lo que concuerda con lo descrito por Nielsen y col. (1983), quienes también encuentran que el acetato pH 4,2 no permite una buena adsorción del antígeno inde­pendientemente del tipo de placa que se utilice. El TS carbonato/bicarbonato pH 9,6 también favoreció la adsorción del antígeno y ha sido recomendado por algunos autores (Nielsen y col., 1983; Alonso-Ur­meneta y col., 1988; Nielsen y col., I989).

Trabajando con cadena O de B. abortus 1119–3 en el desarrollo de pruebas de ELISA, se han obte­nido fases sólidas estables en poliestireno (Nielsen y col., 1989; Wright y col., I990). Otros autores reportan dificultades para absorber antígenos, que funcionalmente son similares al nuestro y que se conocen como Poly B y NH (Díaz y col., 1984; Alonso–Urmeneta y col., 1988), aunque con modi­ficaciones basadas en nuestro protocolo, última­mente han logrado establecer fases sólidas más estables utilizando diferentes antígenos PS purifica­dos (Moriyón, 1992)*.

La capacidad del PS de absorberse al poliestireno es el resultado de la calidad de éste, del adecuado pH del TS y de la concentración utilizada. La escasa contaminación con s-LPS y proteínas del polisacá­rido utilizado en este trabajo, hace pensar que posee una capacidad propia de absorbieres al plástico cuan­do se dan las condiciones apropiadas.

Respecto a otros materiales, como clase de con­jugado o sustrato, y metodología que constituyen el resto de la prueba y que no fueron motivo de análisis en este trabajo, se puede decir que funcionaron ade­cuadamente.

Existen varios métodos de calcular el punto de diferenciación entre sueros positivos y negativos o corte +/-, como son: el valor 'i' promedio del grupo negativo más tres desviaciones estándar; el valor 'i' promedio del centésimo percentil o el doble del valor 'i' promedio, también del grupo negativo. Se eligió este último método por ser el más sencillo, considerando que los valores de corte +/–, determi­nado por los tres métodos resultan muy similares según IAEA/FAO, (1992).

En la evaluación de la prueba, los niveles de sensibilidad y especificidad para los dos tipos de placas seleccionados fueron altos, si se le compara con aquellos entregados por otras pruebas de diag­nóstico de brucelosis. La placa en que se aprecian los mejores niveles de sensibilidad (95,8%) y espe­cificidad (I00%) fue la NUNC 269620 (N3), resul­tado levemente superior en cuanto a sensibilidad de aquel obtenido por Pinochet y col. (1990), de 92,3%, con el uso del antígeno en pruebas de ID.

La capacidad de discriminar los animales vacu­nados, que eran positivos a otras pruebas de diag­nóstico se aprecia al observar los cuadros 1 y 3, donde los valores de 'i' promedios de animales negativos y vacunados son muy semejantes y difie­ren manifiestamente de los de animales infectados.

Esta capacidad de discriminar se considera muy buena pues la placa D2 da como negativos a un 95,8% y la placa N3 a un 88,3% de los animales vacunados. Wright y col. (I990) utilizando cadena O como antígeno y en un ELISA competitivo que tiene la cualidad de amplificar la diferenciación en la respuesta de vacunados e infectados que entrega un ELISA indirecto, obtienen un 85% de reacciones negativas en animales vacunados.

Es conveniente señalar que los valores de 'i' de los sueros de animales vacunados con resultado positivo, son muy bajos y están ligeramente por encima del valor de corte +/–, a excepción de un solo animal que resultó francamente positivo. Esto últi­mo podría deberse a que el animal fue muestreo en el momento máximo de producción de anticuer­pos o también a la posible presencia de una infec­ción concomitante (Wright y col., 1990). Referente a lo anterior puede suceder que algún animal vacu­nado estuviera iniciando una infección natural no pesquisada por la prueba de ID, que es de una sensibilidad analítica mucho menor que ELISA, o bien porque normalmente animales vacunados po­seen algún grado de reactividad frente a epítopes específicos del largo de la cadena O, en etapas tempranas postvacunación durante el momento má­ximo de producción de anticuerpos (Wright y col., 1990).

La prueba de ELISA desarrollada en este estudio, capaz de discriminar entre animales vacunados con Cepa 19 y aquellos naturalmente infectados por cepas de campo, tiene altos niveles de sensibilidad y especificidad y estudios posteriores deben tender a probar alternativas respecto de otros tipos de con­jugados y de ensayos en la modalidad de competi­ción, para así optimizar las cualidades del antígeno polisacárido.

__________

Nota

* Comunicación personal, 1992.  volver

 

Referencias

ÁBALOS, P.; L. PINOCHET; L. IBARRA; I. PALAVICINO. 1990. Bovi­ne brucellosis in Chile: diagnosic and vaccination alternati­ves for controlling the disease. Proccedings of Workshop on Animal Disease Diagnosis in Latin America. Joint IFS/IAEA/FAO. San José, Costa Rica.

ALTON, G.; L. CORNER. 1981. Vaccination of heifer with a redu­ced doce of Brucella abortos Strain 19 vaccine before first mating. Aust. Vet. J. 57: 548-550.

ALTON, G.; L. M. JONES, R. ANGUS, J. VERGER. 1988. Techniques for the brucellosis laboratory. INRA, Paris, France. pp. 113­-123.

ALONSO-URMENETA, B.; I. MORIYÓN; R. DÍAZ; M. BLASCO. 1988. Enzyme-linked immunosorbent assay with Brucella native hapten polysaccharide and smooth lipopolysaccharide. J. Clin. Microbiol. 26: 2642-2646.

CHERWONOGRODZKY, J.W.; K.H. NIELSEN. 1988. Brucella abor­tos 1119-3 O-Chain polysaccharide to differentiate sera from B. abortos S-19-vaccinated and field-strain-infected cattle by agar gel immunodiffusion. J. Clin. Microbiol. 26: 1120-1123.

CHERWONOGRODZKY, J.; G. DUBRAY, E. MORENO; H. MAYER. 1990. Antigens of Brucella. In: Animal Brucellosis. Nielsen, K. and Duncan, J.R. Ed. CRC Press, Inc. Florida, USA. pp. 19-64.

DÍAZ, R.; P. GARATEA; L.M. JONES; I. MORIYÓN. 1979. Radial immunodiffusion test with Brucella polysaccharide antigen for differentiating infected from vaccinated cattle. J. Clin. Microbiol. 10:37-41.

DÍAZ, R.; J. TOYOS, M.D. SALVO, M.L. PARDO. 1981. A simple method for the extraction of polysaccharide B from Brucella cells for use in the radial immunodiffusion test diagnosis of bovine brucellosis. Ann. Rech. Vet. 12: 35-39.

DÍAZ, R.; J. TOYOS; L. FERNÁNDEZ-LAGOS; M.D. SALVO; B. ALONSO; l. MORIYÓN. 1984. Studies on the polysaccharide B and native hapten of Brucella and Yersinia enterocolitica serotype 9. Develop. Biol. Standard. 56: 213:220.

IAEA/FAO. 1989. ELISA kit for the detection of antibodies against Brucella abortus. Joint FAO/IAEA Division. Animal Pro­duction and Health Section. Agriculture Laboratory. Seibers­dorf, Austria.

IAEA/EAO. 1992. Brucellosis ELISA kit. Indirect enzyme immu­nossay for detection of bovine antibody to Brucella abortus. Joint FAO/IAEA Programme Animal Production and Health. Seibersdorf, Austria. Bench Protocol Version-BRA 1.1.

NIELSEN, K. 1991. Enzyme immunoassay development. Agricul­ture Canada. ADRI. Nepean, Ontario. Canada. 52 pp.

NIELSEN, K.; J. STILLER; G. ADAMS; R. WILLIAMS. 1983. Binding of Brucella abortus whole cell and lipolysaccharide antigens to plastics. Res. Vet. Science. 34: 131-137.

NIELSEN, K.; J.W. CHERWONOGRODZKY; J.R. DUNCAN; D.R. BUNDLE. 1989. Enzyme-immunosorbent assay for differen­tiation of antibody response of cattle naturally infected with Brucella abortus or vaccinated with strain 19. Am. J. Vet. Res. 50: 5-9.

PINOCHET, L.; P. ÁBALOS; L. STEPHENS; M. DURÁN. 1990. Nor­malización de un antígeno soluble para descartar respuesta postvacunal a Brucella abortus Cepa 19 Av. Cs. Vet. 5: 119-123.

PINOCHET, L.; P. ABALOS; A. BEST; J. LÓPEZ; C. VERGARA; I. PALAVICINO. 1991. Protección contra brucelosis bovina en hembras adultas mediante la revacunación con dosis reducida de Cepa 19. Av. Cs. Vet. 6: 152-157.

SUTHERLAND, S.; J. SEARSON. 1990. The immune response to Brucella abortus: the humoral response. In: Animal Bruce­llosis. Nielsen, K. and Duncan, J.R. Ed. CRC Press, Inc. Florida, USA. pp. 65-81.

WRIGHT, P.; K. NIELSEN; W. KELLY. 1990. Primary binding techniques for the serodiagnosis of bovine brucellosis: Enzy­me immunoassay. In: Animal Brucellosis. Nielsen, K. and Duncan, J.R. Ed. CRC Press Inc. Florida, USA. pp. 199-235.

Recibido el 1 1 de enero de 1993, aprobado el 9 de agosto de 1993.