Introducción

La alimentación de los peces de cultivo significa un alto costo dentro del proceso de producción intensiva, la cual no siempre es aprovechada en un ciento por ciento por el pez, si las dietas no están suficientemente equilibradas (Steffens, 1987; Espinoza, 1992). El tipo de alimento que ingieren las truchas, además está relacionado con el medio en el cual viven, ya que existe la trucha silvestre o anádroma y la doméstica o cultivada. La primera consume sólo lo que logra capturar en su entorno (Artigas et al., 1985; Drumond, 1990), lo cual provoca un pobre crecimiento, reducida ganancia de peso, desarrollo sexual tardío y mala calidad organoléptica. En tanto, la trucha cultivada recibe una dieta altamente energética y rica en proteínas y vitaminas (Arias, 1989; Kinkelin et al., 1991), la cual debe ser adecuadamente balanceada para que cumpla el objetivo de obtener un animal de buenas características comerciales (Arias, 1989).

Debido a que el hígado es uno de los órganos más importantes en las etapas metabólicas del proceso digestivo y sobre el cual existe poca información básica, se ha estimado necesario realizar este estudio a objeto de incorporar datos que permitan enfrentar futuros estudios nutricionales y de fisiología hepática en los salmónidos.

Materiales y método

Se analizó la conformación histológica y ultraestructural del hígado de la especie trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss), conformando dos grupos de 10 individuos cada uno; uno de origen silvestre y otro proveniente de piscicultura.

El grupo de truchas silvestres se obtuvo, mediante técnicas de pesca deportiva convencionales, en los ríos Diguillín y Renegado (VIII Región, Chile). Los individuos capturados fueron identificados mediante claves taxonómicas (Kafuku e Ikenohue, 1983), medidos y pesados, mediante un ictiómetro y balanza electrónica portátil, respectivamente. Sus talla y peso promedios fueron 220 mm y 200 g.

El grupo de truchas cultivadas estuvo formado por peces colectados al azar, sin distinción de sexo, en la Piscicultura Llano Blanco, ubicada en la comuna de Los Ángeles, provincia de Biobío (VIII Región, Chile). Estos peces están sometidos a una crianza intensiva, bajo condiciones ambientales óptimas de temperatura y presión de oxígeno. Los individuos habían terminado su fase de engorda y presentaron una talla y peso promedio de 270 mm y 230 g, respectivamente. Estos animales reciben durante su crecimiento inicial alimento concentrado comercial marca IANSA, y en la fase de engorda uno integrado por un 45% de proteína de origen vegetal y animal (alfalfa y harina de pescado, respectivamente), durante dos veces diarias.

Toma de muestras hepáticas

Los peces fueron sacrificados mediante sección de la región cervical, realizándose posteriormente una incisión ventromedial, separando todas las vísceras y aislando cuidadosamente el hígado. Enseguida se realizaron pequeños cortes en el órgano de 3 a 4 mm, los cuales fueron fijados inmediatamente, unos en glutaraldehído tamponado al 4% y otros en formalina tamponada al 10%.

Las muestras fueron procesadas según las técnicas histológicas corrientes para inclusión en parafina y araldita, para su posterior análisis en microscopia de luz y electrónica (TEM y SEM, respectivamente). Se analizaron aproximadamente 100 cortes.

Análisis de las muestras

En microscopia de luz se analizaron muestras teñidas con Azul de Toluidina, en ambos grupos de truchas se observó la forma y disposición de los lobulillos hepáticos, de los hepatocitos, disposición de los vasos sanguíneos y canalículos biliares.

En TEM se analizó el tamaño del hepatocito y su núcleo; presencia y tamaño del RER; visualización y ubicación del aparato de Golgi; forma, cantidad y ubicación de las mitocondrias; cantidad, tipo, ubicación y tamaño de las vacuolas citoplasmáticas; cantidad, disposición y tamaño del lumen de los canalículos biliares; composición de las paredes sinusoidales; y presencia o ausencia de células de Küpffer y de Ito.

En SEM se describió y midió el espacio de Disse y su relación con los elementos adyacentes.

Para la determinación de los valores reales medibles se utilizaron las fotografías obtenidas, las cuales fueron convertidas a valores estandarizados de acuerdo a la fórmula: 0=I/A, donde O es el objeto, I la imagen y A el aumento. Posteriormente fueron multiplicados los valores por un coeficiente constante.

Los valores obtenidos en ambos grupos en estudio fueron sometidos al Test de Student (p menor 0,05), para determinar el grado de significancia estadística en los parámetros analizados.

Resultados y discusión

Microscopia de luz

La observación de los hepatocitos, en ambos grupos de peces, indicó que ellos se disponen en forma glomerular, constituida por 5 a 8 células, aproximadamente, circundando la vena central y otros grupos dispuestos en forma de cordones de una sola capa de células, ubicándose periféricamente a la disposición glomerular (Figura 1).

Figura 1. Microfotografía de tejidos hepáticos de trucha cultivada. Se observa una vena central (v), a la cual drenan sinusoides. Los hepatocitos tienen disposición acordonada y glomerular. Tinción azul de Toluidina (30x)

La disposición glomerular observada difiere con la misma disposición determinada por Hampton et al. (1985), los cuales describieron una distribución tubular, dado que en su centro se ubicaría un canalículo biliar. También hay diferencias en la disposición acordonada formada, según estos autores, por una capa simple o doble de hepatocitos, interceptados por células distintas que se teñían oscuramente. Esta estructura descrita no apareció en ninguna de nuestras muestras; lo cual podría estar relacionado con la escasa cantidad de tejido conjuntivo presente en esta especie, lo que determinaría un reordenamiento de las células debido al poco soporte del conjuntivo (Yasutake y Wales, 1983) y la gran ramificación observada de los sinusoides (Yokote, 1983).

El hepatocito adopta una forma piramidal, con su citoplasma de tinción clara y el núcleo esférico fuertemente teñido, con su cromatina dispuesta en grumos, y un nucléolo muy marcado. Esta descripción es coincidente con lo observado por otros autores, en la misma especie (Anderson y Mitchum, 1974; Hampton et al., 1985; Roberts, 1989). En la base de los hepatocitos, en cualquiera de sus ordenamientos (glomerular y acordonada), se ubican los sinusoides hepáticos de células endoteliales aplanadas con sus núcleos sobresaliendo hacia el lumen sinusoidal (Figuras 1 y 2).

Figura 2. Microfotografía de tejidos hepáticos de trucha cultivada. Se observan lobulillos hepáticos de distribución glomerular y hepatocitos de forma piramidal, rodeando a sinusoides (s), destacándose de los núcleos de las células endoteliales.  Tinción azul de Toluidina (125 x).

Las células hepáticas mostraron dos tipos de tinción, unas pálidas y otras intensamente teñidas (Figuras 2 y 3), esto puede ser similar a lo encontrado por Hampton et al. (1985), quienes las observaron sólo en los hepatocitos de distribución acordonada, determinándolas como otros tipos de células. Sin embargo en nuestras observaciones ellas corresponden a hepatocitos y se encuentran en los dos tipos de distribución de las células hepáticas.

Figura 3. Microfotografía de tejidos hepáticos de trucha cultivada, mostrando parte de la vena central del lobulillo (v), a la cual drenan los sinusoides distinguiéndose por los núcleos de las células sinusoidales se aprecian hepatocitos de dos coloraciones: palidos (p) e Intensos (i).  Tinción azul de Toluidina (125 x).

Respecto de las áreas portales, tienen la misma composición que en los mamíferos, pero son muy difíciles de encontrar, debido al escaso tejido conjuntivo en esas zonas. Esto es coincidente con los trabajos de Anderson y Mitchum (1974), quienes lo consideran como una característica común en el hígado de trucha.

La única diferencia estructural observable encontrada a este nivel microscópico, entre ambos grupos de truchas, fue en la cantidad de vasos sanguíneos, la cual es mayor en el hígado de las truchas silvestres respecto a las cultivadas.

Microscopia electrónica de transmisión

Las estructuras analizadas en TEM y sus medidas posteriores se detallan en la Tabla 1, indicando además aquéllas que poseen diferencias estadísticamente significativas.

TABLA 1 MEDIDAS PROMEDIOS DELOS PARÁMETROS HEPÁTICOS, POR GRUPO DE TRUCHAS Y ZONA ANALIZADA (en µm)

 -

Truchas cultivadas

 Truchas silvestres

Hepatocito

34,9

54,2

Núcleo hepatocito

8,7

6,1

Tamaño RER

0,1a

0,08b

Tamaño VO

0,26

0,28

Tamaño VC

0,29a

0,45b

Lumen CB

1,3

2,4

Lumen S

24,3

20,6

Núcleo CS

2,6

3,1

VO = vesículas oscuras VC = vesículas claras CB = canalículo biliar S = sinusoide CS = célula sinusoidal a, b letras distintas indican diferencias significativas.

 

A pesar de haber considerado en el trabajo la medición del aparato de Golgi y mitocondrias, ello no se realizó al encontrarse el primero muy asociado al retículo endoplásmico el primero, y las segundas al no poder visualizarse con absoluta claridad.

En la Tabla 2 se indica la presencia o ausencia de algunas estructuras buscadas en ambos grupos de animales.

TABLA 2 REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE ALGUNOS COMPONENTES CELULARES EN LOS HEPATOCITOS DE AMBOS GRUPOS

- Truchas silvestres Truchas cultivadas
Aparato de Golgi + +
Lisosomas - -
Inclusiones grasa - +
Células de Küpffer + -
Células de Ito - -
Espacio de Disse + +
presencia = + ausencia = -

Los hepatocitos presentan núcleos con la cromatina condensada y de posición central, y un nucléolo muy marcado (Figuras 4a y 4b), esto es igual a lo observado por otros autores (Anderson y Mitchum, 1974; Hampton et al., 1985). Alrededor del núcleo se dispone el retículo endoplásmico, muy desarrollado en ambos grupos en estudio, pero con una disposición distinta; así, en las truchas silvestres, adopta una disposición laberíntica (Figura 5) y de mayor tamaño (Tabla 1) que lo observado en el grupo de truchas cultivadas, en las cuales se disponen en un sistema de membranas paralelas (Figura 6). Estas diferencias fueron estadísticamente significativas.

Figura 4. Microfotografía TEM del parénquima hepático de trucha cultivada. A) se destaca heposito de forma poligonal y su núcleo con cromatina (n) nucleolar, gran desarrollo del reticulo endoplásmico (r), gran cantidad de vacuolas (v) citoplasmaticas. En el costado superior izquierdo del núcleo se observa canalículo biliar con proyecciones intracaniculares (c). B)Se puede obserbar a hepatositos, rodeando a un sinusoide (s) con eritrocito en su interior (4.200x).

 

Figura 5. Microfotografía TEM de  hepatocitos de trucha silvestre, observándose la disposisción laberíntica del retículo endoplásmico. Núcleo de hepatocito (n), retículo endoplásmatico.

Figura 6. Microfotografía TEM del parénquima hépatico de trucha cultivada. observándose la dosposición más regular de retículo endoplásmatico (n), sinusoide (s) (7.200x) 

Esta observación realizada en el grupo silvestre no ha sido descrita anteriormente, en cambio la distribución del RER en las truchas cultivadas (Anderson y Mitchum, 1974; es coincidente con otros estudios.

Próximo al RER, se aprecia en ambos grupos la presencia de dos tipos de vesículas secretorias, unas electrónicamente densas y otras claras, que indicarían distinto contenido, y que además muestran distinto tamaño. En el grupo de truchas domésticas o cultivadas, las vesículas oscuras son de menor tamaño que las claras, en promedio ellas miden 0,26 µm y 0,29 µm, respectivamente (Figura 7, Tabla 1). En tanto, en el grupo de truchas silvestres, las vesículas claras midieron en promedio de 0,45 tm y las oscuras 0,28 µm (Tabla 1), lo cual fue estadísticamente significativo.

Figura 7. Microfotografía TEM de  hepatocito de trucha cultivada que muestra la ubicación prinuclear de vesículas densas y vesículas claras (c). Núcleo del hepatosito (n), reticulo endoplásmatico (r) (7.000x).

Según Hampton et al. (1988) estas vesículas citoplásmicas proveerían, aparentemente, un sistema de transporte entre el citoplasma del hepatocito y el lumen canalicular.

El aparato de Golgi no se observó con claridad en ambos grupos de peces, lo que indicaría que se encuentra muy poco desarrollado (Figura 6). Esta característica es discrepante con lo observado por otro autor, quien además le da una ubicación supranuclear (Hampton et al., 1989).

Respecto a las mitocondrias, éstas se encontraron en poca cantidad en ambos grupos, lo cual concuerda con Hampton et al. (1989), quienes determinaron en esta especie poca cantidad de estos organitos, lo que puede implicar una gran dependencia de glicólisis anaeróbica para producir energía.

En el grupo de truchas cultivadas se observó en el citoplasma de algunos hepatocitos presencia de vesículas de grasa, en distinta distribución (Figura 8).

Figura 8. Microfotografía TEM de  hepatocito de trucha cultivada.  Presencia de vesículas de grasas (v); núcleo del hepatosito (n) con abundantes poros nucleares (12.000x).

En tanto en el grupo de truchas silvestres no aparecieron estas inclusiones de grasa (Figura 9, Tabla 2). Debido a que también esto fue observado en truchas cultivadas, en otro trabajo (Hampton et al., 1985), se puede inferir que esto se debe a las prácticas nutricionales a que son sometidos estos peces.

Figura 9. Microfotografía TEM de hepatocito de trucha silvestre con vesícualas citoplasmáticas (v), pero ausencia de gotas de grasa. Núcleo del hepatocito(n)(12.000x).

En relación a las estructuras conductoras hepáticas, se observó que los canalículos biliares tienen diferentes tamaños y direcciones, conteniendo gran cantidad de microvellosidades (Figuras 9 y 10). Estos canalículos están formados por las membranas plasmáticas laterales de los hepatocitos, en la unión de dos o tres células, en forma similar a lo estructurado en mamíferos. La estructura descrita de los canalículos fue igual en ambos grupos de truchas. Sin embargo, Hampton et al. (1988), los describió con otra morfología, determinando que los canalículos se ubicaban en el centro de lo que denominaron como túbulos hepáticos, determinados por un tipo de ordenamiento glomerular de los hepatocitos.

Figura 10. Microfotografía TEM de hepatocito de trucha cultivada. Se destacan los  canalículos biliares con microvellosidades y abundante retículo endoplásmatico (r)(4.200x)

La estructura de los sinusoides correspondió a la característica para los mamíferos, es decir, su pared está conformada por células endoteliales de núcleos prominentes y muy teñidos, su citoplasma es claro y la membrana plasmática relativamente delgada (Figura 11). Entre ambos grupos no hubo diferencia significativa.

 

Figura 11. Microfotografía TEM de tejido hepático de trucha silvestre. Hay presencia de vaso central, sinusoide (s), núcleo de la célula sinusoidal(n), célula de Küpffer (k), y mastocito (c) (4.200x)

Anexado a los sinusoides se observaron células de Küpffer de cuerpo alargado, con núcleo elíptico poco teñido y citoplasma claro (Figura 11); ellas sólo se encontraron en las truchas silvestres y nunca en el grupo de truchas cultivadas (Tabla 2).

En las observaciones del espacio de Disse por medio del SEM, se apreció que se encuentra interceptado por gran cantidad de proyecciones citoplasmáticas de los hepatocitos hacia la pared del sinusoide (Figura 12). Esto fue observado en los dos grupos de truchas (Tabla 2). Aunque no existen publicaciones respecto de esta estructura para peces, sí ha sido descrito para mamíferos (Steiner y Carruthers, 1961).

Figura 12. Microfotografía SEM de un sinusoide de tejido hepático de trucha de cultivo, observándose el espacio de Disse (D), las proyecciones de los hepatocitos hacia la pared sinusoidal (s), y el borde interno en la pared del sinusoide (b) (20.000x)

En la visión por SEM también se pudo apreciar la disposición glomerular de los hepatocitos, los cuales están compuestos por cinco a seis células, limitadas periféricamente por el espacio de Disse. Esta disposición es similar a la descrita en mamíferos (Steiner y Carruthers, 1961) y en algunas aves (Abdelwahab, 1986).

Conclusiones

En la comparación por medio de microscopia de luz, el tejido hepático de la trucha arco iris reflejó que la disposición de los lubulillos, canalículos biliares y hepatocitos, es igual en ambos grupos estudiados; sin embargo, las truchas del grupo silvestre mostraron una mayor cantidad de vasos sanguíneos.

En la observación de las muestras, mediante microscopia electrónica de barrido, se encontraron diferencias significativas entre ambos grupos, desde el punto de vista estadístico, en el tamaño del RER y de las vesículas claras citoplasmáticas de los hepatocitos. Además existe mayor presencia de gotas lipídicas en los hepatocitos de las truchas cultivadas.

Referencias

ABDELWAHAB, E.M. 1986. Ultrastructure and arrangement of hepatocyte cords in the Duckling's liver. J. Anat. 150: 181-189.

ANDERSON, B. and D. MITCHUM. 1974. Atlas of Trout Histology. Wyo. Game fish. Comm. Bull 13: 15-21.

ARIAS, P. 1989. Cultivo intensivo de truchas a nivel rural. En: Curso Internacional sobre Cría de Peces y Ranas. 20-22 noviembre. Universidad de Concepción. Departamento Medicina Veterinaria, Chillán, Chile.

ARTIGAS, J.N., E. CAMPUSANO y U. GONZÁLEZ. 1985. Contribución al conocimiento de la Biología y hábitos alimentarios de Salmo gairdneri (Richardson, 1836) en lago Laja (Chile). Gayana, Zool. 49: 3-29.

HAMPTON, J.A., P. MAC CUSKEY, R. MAC KUSKEY and D.E. HINTON. 1985. Functional Unites in Rainbow Trout (Salmo gairdneri). Liver: I. Arrangement and Histochemical Properties of Hepatocytes. Anat. Rec. 213: 166-175.

HAMPTON, J.A., C.R. LANTZ, P.J. GOLDBLATT, D.J. LAUREN and D. HINTON. 1988. Functional Units in Rainbow Trout (Salmo gairdneri, Richardson). Liver: II. The Biliary System. Anat. Rec. 221: 619-634.

HAMPTON, J.A., C.R. LANTZ y D.E. HINTON. 1989. Functional Units in Rainbow Trout (Salino gairdneri, Richardson). Liver: III. Morphometric Analysis of Parenchima, Stroma and Component Cell Types. Am. J. Anat. 185: 58-73.

KAFUKU, T. and J. IKENOHUE. 1983. Modern Methods of Aquaculture in Japan. Kodansha. Tokyo, Japan.

KINKELIN, P., C. MICHEL y P. GHITTINO. 1991. Tratado de lasenfermedades de los peces. Ed. Acribia. Zaragoza, España.

ROBERTS, R. 1989. Fish Pathology. 2nd Ed. Bailliere Tindall, London.

STEINER, J.W. and J.S. CARRUTHERS. 1961. Studies on the fine Structure of the terminal branches of the biliary tree. Am. J. Pathol. 38: 639-661.

YASUTAKE, W.T. and J.H. WALES. 1983. Microscopic Anatomy of Salmonids: An atlas. Fish and Widlife Publ. N° 150. Services U.S. Dept. of the Interior. Washington. D.C. USA.

YOKOTE, M. 1983. An atlas of Fish Histology Normal and Pathological Features. Takashi Hibiya Kodansha Ltd. Tokyo, Japan.

Recibido el 13 de marzo de 1995. Aprobado el 20 de mayo de 1996.