Introducción

La intensificación de los sistemas de crianza artifi­cial del ganado bovino ha traído consigo una serie de problemas sanitarios y de manejo (Dirksen y Hofmann, 1974), y con ello una mayor incidencia de enfermedades, las cuales, se pueden agrupar en en­fermedades de tipo digestivo, respiratorias, nutri­cionales y parasitarias (Radostits y Blood, 1985).

Las enfermedades respiratorias representan un serio problema en muchos países, afectando tanto al ganado bovino de carne como al de leche (Bryson y col., 1978; Elazhary y col., 1982). Ellas son causa de importantes pérdidas económicas (Caldow y col., 1988), debido a que producen tasas de mortalidad que varían de un 5% a un 15% en los terneros y un detrimento en el crecimiento reflejado en una reduc­ción de 7,2% de la ganancia de peso/animal en pie (Blood y col., 1989). A esto se le suman los costos de manejo, tratamientos y servicios veterinarios (Wikse, 1985).

Los virus se consideran como causantes prima­rios del daño del tracto respiratorio (Andrews y col., 1981; Baker y Frey, 1985), lo que se ha probado en base al aislamiento viral, datos serológicos de infec­ción viral activa y hallazgo de lesiones patológicas de neumonía viral (Blood y col., 1989). El daño producido por la acción viral se ve agravado por la participación de agentes secundarios como myco­plasmas u otra infección bacteriana (Baker y Frey, 1985).

Entre los virus más comúnmente asociados a procesos neumónicos puede mencionarse a virus parainfluenza 3 (PI 3), virus diarrea viral bovina (VDVB), adenovirus tipo 1 y 3, virus herpes bovino tipo 1 (VHB–1) y virus respiratorio Sincicial bovino (VRSB).

Las epidemias de enfermedad respiratoria en un rebaño bovino a menudo parecen involucrar más de un agente viral como etiología, sin embargo, son escasos los estudios que permitan sustentar esta suposición. Existe aún menos información en rela­ción a infecciones vírales mixtas, por lo que induda­blemente se requiere de mayores estudios que per­mitan ayudar a dilucidar esta problemática.

Dado que en Chile la información en cuanto a estas entidades nosológicas es parcial y no existen antecedentes en relación a la relevancia de la infec­ción por VRSB, la investigación en progreso preten­de estudiar el problema de infecciones respiratorias vírales en terneros como un todo, informándose en el presente trabajo sobre la pesquisa directa de agen­tes vírales a través de inmunofluorescencia.

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 Financiado por Proyecto FONDECYT 92/0173.

Material y métodos

Se colectaron 166 muestras de aspirado nasofarín­geo de terneros de 6 predios de la provincia de Valdivia. De ellas 136 corresponden a terneros con infección respiratoria inicial y 30 a animales clíni­camente sanos.

Cada muestra, de aproximadamente 0,5 ml, se obtuvo por medio de una sonda de aspiración naso­faríngea de 45 cm de longitud, estéril, cuyo modelo fue similar a la utilizada por Larrañaga y col. (1991) para el aislamiento de VRS de lactantes con infec­ción respiratoria aguda (IRA).

Desde el momento de su obtención las muestras fueron mantenidas a 4ºC en 5 ml de Medio Mínimo Esencial (MEM) con herpes y antibióticos (penicili­na G y estreptomicina cada uno en dosis de 100 UI/ml), siendo procesadas 2 a 3 horas después de colectadas. Para ello se centrifugaron a 515 xg du­rante 20 minutos, el sedimento se resuspendió en 5 ml de buffer fosfato salino (PBS) estéril, pH 7,4. Se centrifugó nuevamente a 515 xg por 5 minutos, repitiéndose el lavado del sedimento 2 veces más.

Paralelamente se prepararon portaobjetos, 10 por cada muestra, los cuales estaban limpios, desgrasa­dos y rotulados con lápiz diamante (número de muestra y 2 circunsferencias como pocillos). Una vez realizado el tercer lavado, se depositaron 15 ml de sedimento previamente homogenizado, en cada una de las circunsferencias. Se secaron a temperatu­ra ambiente, luego se fijaron con acetona a 4ºC durante 10 minutos. Una vez evaporada la acetona se realizó inmediatamente la IF o en caso contrario se guardaron los portaobjetos envueltos en papel de aluminio a -70ºC.

Para la pesquisa de los virus PI3-, VDVB y VHB-1 se utilizaron los reactivos comerciales para inmunofluorescencia del Laboratorio Bioveta* rea­lizando las tinciones de acuerdo a las indicaciones del fabricante. Para el VRSB se utilizó conjugado proporcionado por el Dr. J. López de la Universidad de Cornell, USA. Se consideró positivos a aquellos frotis que presentaron 2 ó más células con fluores­cencia específica. Como controles positivos se utili­zó, en todos los casos, cultivo del virus correspon­diente.

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* BIOVETA, Praga, Checoeslovaquia. volver

Resultados

En los animales de cuatro predios se detectó VRSB y en uno de ellos además VDVB, como se aprecia en el cuadro 1. De las 13 muestras positivas a VRSB, 12 presentaron fluorescencia de tipo granu­lar en el citoplasma (Figura 1) y en la restante se observó acúrnulos de células con fluorescencia a nivel de membrana celular. En la muestra positiva a VDVB se observó la fluorescencia típica a nivel de citoplasma celular. La mayoría de las muestras po­sitivas se detectaron en los meses de otoño e invier­110.

CUADRO 1 TOTAL DE MUESTRAS DE ASPIRADO NASOFARÍNGEO POR PLANTEL Y RESULTADO DE LA INMUNOFLUORESCENCIA FRENTE

Predios

Total muestras

Inmunofluorescencia positiva

BHV-1

VDVB 

PI-3

VRSB

1

16

-

-

-

2

2

22

-

-

-

-

3

12

-

-

-

-

4

31

-

-

-

5

5

23

-

-

-

2

6

32

-

1

-

4

Controles

30

-

-

-

-

TOTAL.

166

-

1

-

13

 

Figura 1. Inmunofluorescencia positiva a virus respiratorio sincicial bovino en células de aspirado nasofaríngeo.

Discusión

La sonda de aspiración nasal utilizada en este traba­jo, proporcionó un buen resultado, recomendándose como un método de muestreo satisfactorio por sobre el uso de tórulas nasales, ya que, según Bryson (1985), la sonda no corre el riesgo de quebrarse en la fosa nasal, además capta una mayor cantidad de muestra, lo que es ideal frente a virus de bajo título infectado y no produce ningún efecto adverso en la viabilidad viral.

Por otra parte, Kimman y col. (1986) señalan que el problema de la IF en frotis de tórulas nasales es la fluorescencia inespecífica, situación que es supera­da en los aspirados nasofaríngeos.

La presencia de partículas extrañas y exceso de mucus en los aspiradores se ve solucionada por el lavado de la muestra con una solución de tampón fosfato, de manera de dejar en lo posible sólo células epiteliales disminuyendo de este modo la fluores­cencia inespecífica y considerándose así, una buena base diagnóstica (Lauer, 1982; Méndez y col. 1987; Torres y Vicente, 1992).

Con respecto a VRS el hallazgo de estructuras granulares fluorescentes en el citoplasma de células epiteliales (foto 1) concuerda con lo descrito por Gardner y col. (1970) y Lauer (1982). También se ha descrito un tipo de fluorescencia limitada a la membrana celular producto de la unión de anticuer­pos marcados con antígenos de VRSB que han pro­tuido a través de ella (Gardner y col., 1970). Esta fluorescencia sólo se ha visto en el caso de células epiteliales de bronquíolos y alvéolos de terneros afectados por este agente (Kimman y col., 1989b), y en este trabajo en una muestra.

Cabe destacar que los 2 tipos de localización de fluorescencia detectada en las células de frotis de aspirado fueron observados en muestras que habían sido obtenidas en la época fría del año mostrando una marcada estacionalidad en estos hallazgos, la cual ha sido descrita por Edwards y col. (1984), Fenner y col. (1987) y Kiorpes y col. (1988).

Mahy (1985) recomienda la inmunofluorescen­cia indirecta para la tinción de aspirados nasofarín­geos dado que según este investigador posee una mayor sensibilidad que la IF directa, en cambio, Torres y Vicente (1992) no encuentran diferencia significativa entre ambas técnicas aunque ambos concuerdan en que es una prueba efectiva y rápida por sobre otras técnicas de laboratorio.

En los predios 4 y 6 (Cuadro 1), fue donde se recolectó el mayor número de muestras y desde donde se obtuvieron la mayoría de los resultados positivos en el presente estudio (10 de las 13 positi­vas a RSV y la muestra positiva a VDVB), lo que estaría sugiriendo un problema de manejo y de me­didas sanitarias de los planteles dada la influencia que éstos tienen en la presentación clínica de proble­mas respiratorios, tal como lo plantean diversos autores (Bryson y col., 1978; Bryson, 1985; Kiorpes y col., 1988).

En el caso del predio 1 (Cuadro 1) se obtuvo un total de 16 muestras, donde 9 se tomaron durante la evolución de un brote de bronconeumonia. Sólo en 2 de ellas se detectó positividad frente a VRS por IF, lo que podría traducirse en un posible rol etiológico de este agente. En relación a las 7 muestras restan­tes, la negatividad frente a esta prueba podría deber­se a que fueron obtenidas pasados los 7 días en que la IF es factible como método diagnóstico, a que el aspirado haya tenido un bajo título viral o a una elevada contaminación bacteriana.

En cuanto al predio 5 en el que se colectaron 23 muestras y sólo 2 de ellas fueron positivas a VRS no se observó un brote de problemas respiratorios lo que podría deberse a las medidas sanitarias y de manejo con que cuenta el plantel.

Los resultados de esta primera comunicación permiten asumir que los virus estarían jugando un papel como agentes etiológicos en los problemas respiratorios de terneros, cuya relevancia se preten­de dilucidar en el curso de esta investigación y deberá además tenerse en consideración otros virus como coronavirus, adenovirus y parvovirus a los que la literatura menciona como de importancia creciente (Láuchli y col., 1990).

Referencias

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Recibido el 15 de agosto de 1993, aprobado el 3 de noviembre de 1993.