Introducción

La infección venérea con Brucella ovis en los carneros puede provocar severas pérdidas económicas en las majadas afectadas. A las alteraciones genitales que conducen a la infertilidad en los carneros, deberían sumarse las posibles pérdidas embrionarias en ovejas servidas por machos infectados durante la estación reproductiva.

Recientemente en la Provincia de Buenos Aires, Argentina, ha sido identificado un alto porcentaje de carneros excretando B. ovis por el semen, con evidencias serológicas y en muchos casos sin signos clínico genitales (Paolicchi y col., 1992). Estos animales actúan como reservorios de la infección, por lo cual deberían ser identificados de inmediato para efectuar un manejo diferencial. Generalmente se considera adecuado eliminar al reproductor de la majada cuando se lo identifica como infectado con B. ovis. Sin embargo, en muchas ocasiones el alto valor del reproductor puede justificar intentar curar al animal con un tratamiento antimicrobiano específico.

A pesar que el tratamiento antibiótico es exitoso en el hombre (Davis y col., 1990), los resultados en animales brucelosos han sido variables. En bovinos, B. abortus ha sido eliminada utilizando sulfato de estreptomicina en combinación con oxitetraciclina de larga acción (OxLA) formulada con un vehículo de depósito para permitir un prolongado efecto antimicrobiano (Milward y col., 1984).

En carneros infectados con B. ovis el uso combinado de clortetraciclina y estreptomicina (Kuppuswamy, 1954), o de OxLA y sulfato de estreptomicina (Marín y col., 1989), o de OxLA asociada a dihidroestreptomicina (Dargatz y col., 1990) ha dado resultados satisfactorios.

El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la administración de OxLA como único antibiótico, para eliminar B. ovis del tracto genital de carneros infectados en forma experimental con una cepa regional.

Material y métodos

Animales: Se utilizaron 6 carneros de la raza Corriedale sexualmente maduros, pertenecientes a una majada con antecedentes negativos de infección con B. ovis. Los mismos no presentaron alteraciones clínico-genitales y fueron negativos serológicamente a la prueba de fijación del complemento (FC) para B. ovis como también al cultivo de semen, 7 días antes de la inoculación experimental. Los frotis de semen antes de la infección presentaron morfología espermática normal y no se observaron células inflamatorias ni bacterias.

Inoculación de B. ovis

Una cepa de B. ovis* aislada del semen de un carnero con epididimitis, fue sembrada sobre agar sangre Columbia e incubada bajo atmósfera de 10% de C02 a 37ºC durante 4 días. El inóculo utilizado fue suspendido en solución fisiológica estéril tamponada (PBS) y ajustado a una concentración de 3,5 x 1010 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml. Dos carneros fueron inoculados vía conjuntival con 0,5 ml en cada ojo, mientras que los otros dos recibieron 5 ml vía prepucial. Dos carneros no infectados, pero inoculados similarmente con PBS permanecieron como controles.

Los animales se mantuvieron durante todo el experimento, 80 semanas, en corrales separados y se sometieron a electroeyaculación a partir de la 4ta. semana post-inoculación (SPI). En el momento en que se aisló B. ovis del semen, los animales fueron considerados infectados.

Tratamiento antimicrobiano

Todos los carneros recibieron 12 dosis de OxLA** a razón de 20 mg por kilo de peso, vía intramuscular, cada 3 días durante un período de 36 días.

Exámenes bacteriológicos post-tratamiento

Desde la 70 a la 80 SPI en tres oportunidades, los carneros fueron sometidos a electroeyaculación y el semen sembrado sobre agar Skirrow y agar ThayerMartin modificado. Las colonias desarrolladas fueron identificadas según Paolicchi y col. (1991). Al término de los exámenes bacteriológicos de semen, los carneros se sacrificaron y muestras de los órganos genitales externos e internos y de linfonódulos inguinales fueron sembrados. Al cabo de 7-10 días las colonias sospechosas fueron identificadas por morfología microscópica por tinción con Ziehl Neelsen modificado y tipificadas en el Centro Panamericano de Zoonosis, Buenos Aires, Argentina.

Histopatología

Secciones de testículos, epidídimos, vesículas seminales, glándulas bulbouretrales, ampollas y próstata de cada carnero se fijaron con Bouin, se embebieron en parafina y se cortaron a 5 micras, para ser teñidos con hematoxilina y eosina por métodos de rutina.

Análisis serológico

Veinte muestras de sangre fueron extraídas durante 80 SPI. Los sueros se utilizaron para la identificación de anticuerpos específicos para B. ovis por la técnica de FC según describieron Myers y col. (1972). Se consideró 10 o más como título positivo.

__________

Notas

*

Laboratorio de Bacteriología, Departamento de Producción Animal, EEA-INTA Balcarce, Buenos AIRES, argentina  volver

**

Terramicina LA, Laboratorio Pfizer. División Veterinaria, Argentina. volver

Resultados

Los resultados serológicos y bacteriológicos de semen y tejidos genitales de los carneros infectados con B. ovis y en carneros controles post-tratamiento con OxLA se describen en la tabla 1.

TABLA 1 RESULTADOS SEROLÓGICOS Y BACTERIOLÓGICOS DE SEMEN Y TEJIDOS GENITALES DE CARNEROS INFECTADOS CON B. ovis, ANTES (AT) Y DESPUÉS (DT) DEL TRATAMIENTO CON OxLA

Número carnero

 Vía de inoculación

 Aislamiento B. Ovis

 Título*

semen

genitales

 serológico

AT

 DT

AT

 DT

1

Conjuntival

+

-

-

 1/320

1/40

2

Conjuntival

+

-

-

1/321

1/10

3

 Prepucial

+

-

 +a

1/322

-

4

 Prepucial

+

-

-

  1/40

-

5

Control

-

-

-

-

-

6

Control

-

-

-

-

-

* Título de FC: AT: Título máximo antes del tratamiento OxLA. ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,    , DT: Título al momento de la necropsia. ª Aislamiento positivo a partir de vesículas seminales.

Los carneros controles permanecieron negativos serológica, clínica y bacteriológicamente durante todo el experimento.

Todos los carneros infectados desarrollaron lesiones clínicas palpables en epidídimo y/o testículo luego de la inoculación bacteriana; en uno de ellos la lesión regresó espontáneamente antes del tratamiento con antibiótico y ya no fue detectable clínicamente.

Durante el período de infección los carneros presentaron títulos positivos de anticuerpos a FC desde los 15 días post-inoculación. Luego del tratamiento con antibiótico se negativizaron a FC los dos carneros inoculados vía prepucial mientras que los dos infectados por vía conjuntival permanecieron con títulos positivos, los que fueron decreciendo hasta el sacrificio (Figura l). El examen bacteriológico del semen demostró que los cuatro animales infectados excretaron B. ovis durante las 70 SPI. Por el contrario, los cultivos seminales se negativizaron en todos los carneros inmediatamente de concluir con el tratamiento antibiótico y permanecieron así hasta la necropsia.

Figura 1. Evolución serológica (FC) postinoculación con B. postratamiento con OxLA.

Los cultivos post-mortem de los órganos genitales fueron negativos, excepto en uno de los carneros el cual permaneció con títulos serológicos positivos y del cual se aislaron pocas colonias de B. ovis de vesículas seminales.

En ningún caso el tratamiento con OxLA logró curar las lesiones en los órganos genitales, debido a que el carácter de las mismas fue crónico y de grado moderado-severo. Los tres carneros que permanecieron con lesiones clínicas, en la necropsia presentaron epididimitis crónica de la cola, granulomas espermáticos y periorquitis con adherencias múltiples a la túnica vaginal interna. No se observaron lesiones macroscópicas en las glándulas sexuales accesorias. Las lesiones histológicas se caracterizaron por epididimitis crónica con formación de granuloma, hiperplasia quística y metaplasia epitelial, fibrosis intersticial, e infiltrado linfocitario y de células plasmáticas. En los testículos se observaron sectores con túbulos espermáticos atrofiados o sólo con células de Sértoli, rodeados de túbulos con espermatogénesis conservada; en otros casos, mineralización intratubular. En todos los carneros se observó vesiculitis intersticial con infiltrado linfocitario y ampulitis crónica. No se observaron lesiones en otros órganos genitales.

Discusión

Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que la administración de OxLA bajo estas condiciones experimentales fue relativamente efectiva para controlar la infección genital por B. ovis en estos carneros. A pesar de que el número de carneros analizados fue bajo, los resultados bacteriológicos del semen y de los órganos genitales reflejan que la bacteria fue eliminada en 3/4 carneros infectados, al menos de los fluidos genitales y tejidos cultivados. En otros trabajos similares el uso de oxitetraciclina sola eliminó a B. ovis del 33,3% (4/12) de los carneros (Marín y col., 1989).

Los trabajos sobre tratamientos con antibióticos en carneros infectados con B. ovis son escasos. Kuppaswamy (1954) tuvo resultados aparentemente satisfactorios cuando trató a carneros afectados de epididimitis con clortetraciclina más dihidroestreptomicina diaria durante 21 días, pero falló en resolver la infección cuando utilizó dihidroestreptomicina sola o con sulfametazina. La asociación de oxitetraciclina con sulfato de dihidroestreptomicina en carneros infectados experimentalmente con B. ovis (Marín y col., 1989), resultó en la cura del 91,6% de los animales, a pesar que las lesiones genitales no fueron resueltas. Similarmente, en el presente trabajo, el tratamiento con OxLA no logró resolver las lesiones genitales debido al severo grado de inflamación y fibrosis en los tejidos analizados.

La restauración de la normalidad en los tejidos afectados, así como de la fertilidad de los animales infectados no se contemplaron en este experimento. Se debe tener presente que el objetivo primario fue establecer la infección genital y las lesiones histopatológicas compatibles con epididimitis, bajo un esquema de inoculación similar al que ocurre naturalmente, y comprobar la eliminación del tracto reproductivo de B. ovis.

El concepto de que un carnero con alteraciones clínicas genitales debe ser eliminado es absolutamente válido, ya que las probabilidades de recuperación de las lesiones son escasas y porque puede ser una consecuencia del establecimiento de una enfermedad infecto-contagiosa en la majada. Este es un criterio ampliamente aceptado como parte del control sanitario reproductivo del macho. Sin embargo este método clínico es impreciso para detectar carneros brucelosos, ya que muchos no manifiestan síntomas o lo hacen, pero las lesiones regresan espontáneamente y desaparecen. El uso combinado de la palpación genital, serología y bacteriología del semen puede asegurar la detección de un alto porcentaje de los animales infectados con B. ovis. La presencia de neutrófilos en el semen de un carnero sin alteraciones genitales indica un fenómeno inflamatorio en algún lugar del tracto genital, y aunque no es específico para ningún microorganismo, sugiere que una forma subclínica de brucelosis podría estar desarrollándose (Kimberling y col., 1986).

La detección de células inflamatorias en el semen podría ser el punto de partida para decidir el tratamiento antibiótico. A pesar de que el control bacteriológico del semen debería realizarse de inmediato para identificar el germen actuante, la frecuente negatividad de los cultivos por intermitencia en la eliminación o por contaminación, hace necesario poner énfasis en la presencia de neutrófilos seminales. Cuando el período reproductivo se inicia con la existencia de algún animal infectado que excreta B. o vis por el semen, el contacto sexual entre éste y otros machos sanos a través de una hembra servida puede desencadenar la propagación de la enfermedad en la majada.

Los tratamientos convencionales con antibióticos pueden fallar en condiciones de infección genital, debido a la inaccesibilidad de los antibióticos para penetrar fácilmente las membranas celulares. Se debe tener presente que Brucellae es un género bacteriano intracelular facultativo, lo cual le brinda una excelente protección permitiéndole multiplicarse dentro de las células fagocíticas mononucleares. Para eliminar a estas bacterias se deben mantener altas concentraciones del antibiótico en sangre y en los tejidos afectados, y por períodos prolongados (Hall, 1983). Varios regímenes terapéuticos utilizando oxitetraciclina de larga acción y estreptomicina han sido exitosos para eliminar B. abortus de vacas infectadas (Milward y col., 1984).

A pesar de que la asociación de estos dos antibióticos en carneros brucelosos también ha tenido éxito, el uso exclusivo de OxLA en este experimento utilizando un número mayor de aplicaciones de las recomendadas, resultó en la eliminación de la bacteria de los tejidos genitales en tres de los cuatro carneros infectados y en todos los exámenes de semen post-tratamiento, lo cual sugiere un grado de efectividad aceptable en estas condiciones experimentales.

El valor económico y/o reproductivo de ciertos ejemplares ovinos que puedan infectarse con B. ovis podría justificar el uso de la formulación antibiótica probada en este trabajo. Esto último también podría ser válido para los casos en que se detecte alto número de neutrófilos seminales, que pueden ser una manifestación de otro tipo de infección genital bacteriana oculta en las glándulas anexas que generan resultados negativos en los espermiocultivos. La presencia de alto número de neutrófilos en semen provoca alteraciones seminales debido a los productos tóxicos liberados por estas células inflamatorias, lo que podría ser controlado con esta terapia antibiótica.

A pesar de que todos los animales usados en este experimento cesaron de excretar B. ovis en el semen luego de la antibioticoterapia, la bacteria fue recuperada de las vesículas seminales de un animal al momento de la necropsia. Esto indica que la bacteria puede permanecer acantonada por un período prolongado no establecido, sin que sea detectada en el semen, y que los antibióticos pueden tener dificultad en el acceso a esos tejidos genitales. Según estos resultados, la desaparición de los títulos serológicos positivos a B. ovis post-tratamiento no asegura totalmente que la bacteria haya sido eliminada del animal. Por otro lado, la persistencia de títulos significativos no necesariamente indicaría que el animal permanezca aún infectado, como se demostró con dos animales serológicamente positivos a FC pero negativos al aislamiento bacteriológico post-tratamiento en el semen y tejidos. Es probable que el tiempo que medió entre el último tratamiento con el antibiótico y la necropsia de los animales no haya sido lo suficientemente extenso como para negativizar los títulos serológicos. Debido a esto, no sería aconsejable utilizar la serología como indicador de la respuesta a la terapia antibiótica contra B. ovis (Dargatz y col., 1990), lo que enfatiza la necesidad de efectuar cultivos seminales en los animales afectados.

Los resultados de este experimento permiten concluir que la infección con B. ovis puede ser controlada con OxLA como único antibiótico a las dosis aquí utilizadas, aunque esto no nos permite asegurar que la fertilidad de un carnero con brucelosis pueda restablecerse ni regresar a la normalidad los tejidos con lesiones crónicas. Este modelo experimental demostró ser útil para estudios de autoinmunización antiespermática post-infecciosa en carneros (Paolicchi, datos sin publicar), ya que la eliminación de un agente bacteriano del tracto reproductor permitiría en muchos casos identificar con mayor precisión la respuesta serológica autoinmune antiespermática.

Futuros trabajos experimentales deberían comparar y/o evaluar la eficacia de éste y otros antibióticos en relación a la eliminación de la enfermedad y la fertilidad posterior de carneros afectados con B. ovis.

Agradecimientos

Los autores agradecen al personal auxiliar de los laboratorios de Histopatología y Bacteriología del Departamento de Producción Animal de la EEA INTA Balcarce, Argentina, por la colaboración en el procesamiento de las muestras. Al Laboratorio Pfizer, División Veterinaria, Buenos Aires, Argentina, por la donación del antibiótico utilizado. Al Dr. C. Lanusse, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNCPBA, Argentina, por la lectura crítica del trabajo.

Referencias

DARGATZ, D.A.; J.A. SMITH; A.P. KNIGTH; P.W. FARIN; C.V. KIMBERLING. 1990. Antimicrobial therapy for rams with Brucella ovis infection of the urogenital tract. J. Am. Vet. Med. Assoc. 196:605-610.

DAVIS, B.D.; R. DULBECCO; H.N. EISEN; H.S. GINSBERG. 1990. Brucella. In: Microbiology, Ed. J. B. Lippincott Company, Philadelphia.

HALL, W.H. 1983. Human brucellosis. In: Current therapy in infectious diseases by KASS, E.M. and PLATT, R. MarcelDecker, 23-24 pp.

KUPPUSWAMY, P.B. 1954. Chemoterapy of brucellosis in rams. N. Z. Vet. J., 2:110-118.

MARIN, C.M.; M.P. JIMÉNEZ DE BAGUES; M. BARBERAN; J.M. BLASCO. 1989. Efficacy of long-acting oxytetracycline alone or in combination with streptopmycin for treatment of Brucella ovis infection of rams. Am. J. Vet. Res. 50:560-563.

MILWARD, F.W.; P. NICOLETTI; E. HOFFMAN. 1984. Effectiveness of various therapeutic regimens for bovine brucellosis. Am. J. Vet. Res. 45:1825-1828.

MYERS, D.M.; L.M. JONES, V.M. VARELA DÍAZ. 1972. Studies of antigens for complement fixation and gel difussiontest in the infections caused by Brucella ovis and others Brucellas. Appl. Microbiol. 23:894-902.

PAOLICCHI, F.A.; H.R. TERZOLO; R.C. MALENA; C. MORSELLA. 1991. Estudio comparativo de medios de cultivo para aislar Brucella ovis. Rev. Arg. Mierobiol. 23:155-159.

PAOLICCHI, F.A.; J. BARTOLOME; A. PATITUCCI; C. SOLANET; C.M. CAMPERO. 1992. Seguimiento clínico, serológico y bacteriológico en carneros naturalmente infectados con Brucella ovis. Rev. Med. Vet. 73:46-52.

Recibido el 26 de octubre de 1992, aprobado el 20 de mayo de 1993.