Introducción

El virus de la peste porcina clásica o 'classical swine fever virus' (CSFV), el virus de la diarrea viral bovina o 'bovine viral diarrhoea virus' (BVDV) y el virus de la enfermedad de la frontera de los ovinos o 'border disease virus' (BDV) son miembros del género Pestivirus, familia Flaviviridae (Francki y col., 1991). El CSFV causa una enfermedad de gran importancia económica para la industria porcina en todo el mundo. El BVDV está asociado a varias condiciones clínicas en bovinos las cuales pueden variar desde una infección inaparente hasta una enfermedad altamenteletal (enfermedad de las mucosas). Pestivirus son también reconocidos por su habilidad de causar infecciones transplacentarias y provocar serias pérdidas reproductivas (Van Oirschot, 1983).

Otra notable característica de los pestivirus es su alto grado de variación antigénica entre los distintos aislados. Cepas de BVDV y BDV de ovinos son particularmente variables en su composición antigénica (Cay y col, 1989; Edwards y col, 1991; Paton y col, 1991; 1994).

Pestivirus han sido estudiados en varios países (Wensvoort y col, 1986, 1989; Hess y col., 1988; Cay y col., 1989; Edwards y Sands, 1990; Edwards et. al. 1988, 1991; Greiser-Wilke y col., 1990; Paton y col., 1994). En Brasil, CSFV todavía es encontrado en estados de donde la suinocultura está menos desarrollada; sin embargo, BVDV tiene amplia distribución en el ganado bovino. Por otro lado, BCV todavía no ha sido aislado en el país. Sin embargo, a pesar de la presencia de por lo menos estos dos pestivirus (BVDV y CSFV) poco se conoce acerca de la composición antigénica de las muestras de estos virus ahí aisladas.

La presente investigación describe el análisis antigénico de pestivirus aislados en Brasil de ganado bovino y porcino, así como de virus aislados de cultivos celulares inadvertidamente contaminados, utilizando anticuerpos monoclonales.

Materiales y métodos

Células

Los cultivos celulares utilizados fueron obtenidos de diferentes orígenes. Células 'porcine kidney' (PK15) y 'fetal lamb kidney' (FLK) fueron gentilmente cedidas por el Laboratorio Nacional de Referencia en Brasil (LARA - Pedro Leopoldo, MG), y por la Facultad de Veterinaria de la Universidad Federal de Santa María, RS (gentilmente cedido por el Dr. R. Weiblen, CCR, UFSM). Células FLK y swine kidney (SK6) fueron donadas por el Centro Nacional de Investigaciones en Cerdos y Aves (CNPSA, EMBRAPA Concordia, SC). Células Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) fueron obtenidas de los laboratorios arriba mencionados y de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Federal de Pelotas, RS. Las células fueron multiplicadas y subdivididas una o dos veces por semana siguiendo procedimientos estándar (Roehe, 1991).

Virus

Todas las cepas 'standard' de pestivirus (BVDV 'Oregon' C24V SingerY NADL; BDV 'BD Weybridge' o 'BDW' y 'M2', CSFV 'Alfort 187' and 'Glentorf') y un aislado de BDV (BD137/4; Roehe y col., 1992) fueron obtenidas del Central Veterinary Agency, Addlestone, Surrey, UK. La muestra 'Soldan' de BVDV fue aislada de un caso de un ternero con sospecha de enfermedad de las mucosas (Oliveira, 1996), así como la cepa VM96, gentilmente cedida por la Dra. Valeria Moojen, Facultad de Veterinaria de la Universidad Federal de Río Grande do Sul (Oliveira, 1996). Las muestras EVI 001 y 006 fueron aisladas de animales persistentemente infectados (Oliveira, 1996). Los aislados de BDV (BD3535, BD390) fueron gentilmente cedidos por los Drs. E. Peterhans and M. Strasser, Institute of Veterinary Virology, Berne University, Switzerland.

Las cepas de CSFV denominadas 'Castro' y 'Biológico' son muestras brasileñas 'antiguas' (i.e. anteriores a 1960), usadas en pruebas de producción de vacunas y antisueros, y fueron obtenidas del Ministerio de Agricultura. La muestra 'PS Porco' es un 'antiguo' aislado de CSFV con historia de pasajes desconocida, usada en el pasado para la producción de la vacuna cristal-violeta. Como las demás cepas de CSFV en este estudio, ésta fue multiplicada 'in vitro' en células PK 15.

Los 'stocks' de virus fueron producidos por cinco o más pasajes en los cultivos celulares apropiados, conforme procedimientos estándar (Roehe, 1991). Pestivirus aislados de cultivos celulares fueron aislados de células obtenidas de diferentes laboratorios de virología en Brasil (Oliveira y col., 1996).

Anticuerpos monoclonales

En la Tabla 1 se encuentran listados todos los anticuerpos monoclonales (AcMs) utilizados en el presente estudio. En total fue utilizado un panel de 25 AcMs dirigidos contra antígenos de pestivirus, producidos en el Central Veterinary Laboratory, Surrey, UK (Edwards y col., 1988; Edwards y Sands, 1990). Los AcMs fueron mantenidos congelados en medio de cultivo en glicerol a 50% -20°C hasta el momento de uso. La caracterización de la mayor parte de los AcMs utilizados y la determinación de su especificidad proteica fueran previamente descritas (Paton y col., 1991; Edwards y col., 1991; Paton y col., 1995). Los AcMs producidos contra cepas de BVDV, de número 112,160 y 212, reconocen epitopos en la proteína p125/80; los AcMs 115, 162, 163, 165, 166, 214 y 215 y 220 son dirigidos contra epitopos en la glicoproteína gp53; el AcM 210 reconoce un epitopo en gp48. Los AcMs producidos contra cepas de CSFV de número 179 y 186 reconocen gp48. Los demás AcMs utilizados en este estudio (Tabla 1) no tuvieron su especificidad determinada.

TABLA 1 ANTICUERPOS MONOCLONALES (AcMs) UTILIZADOS EN EL PRESENTE ESTUDIO

AcM número

Producido contra

Especificidad proteica*

112

BVDV

125/80

115

BVDV

gp53=

160

BVDV

p125/80

162

BVDV

gp53

163

BVDV

gp53

165

BVDV

gp53

166

BVDV

gp53

174

CSFV

-**

179

CSFV

gp48

180

CSFV

-

185

CSFV

-

186

CSFV

gp48

187

CSFV

gp53

210

BVDV

gp48

212

BVDV

p125/80

214

BVDV

gp53

215

BVDV

gp53

216

CSFV

-

217

CSFV

-

220

BVDV

gp53

302

CSFV

-

304

CSFV

-

306

CSFV

-

308

CSFV

-

368

CSFV

-

*Paton et. al. (1991); Edwards et. al. (1991); Paton et. al. (1995) ** Especificidad no determinada.

Técnica de inmunoperoxidasa

Muestras de virus fueron sembradas en microplacas de 96 orificios y coloreadas por la técnica de inmunoperoxidasa (Holm Jensen, 1981) utilizando el panel de anticuerpos monoclonales (Edwards & Sands, 1990). Después de 72-96 horas de incubación, las microplacas fueran fijadas en líquido de fijación (acetona al 20% en solución salina tamponada con fosfato (PBS); pH 7,5) por 10 minutos. El fijador fue removido y las microplacas deshidratadas por 4 horas a 37°C. A continuación, las microplacas fueren rehidratadas por 5 minutos con líquido de lavar (PBS conteniendo 0,5% de Tween 80). Después de la remoción del 'wash Huid', fue adicionada una dilución apropiada (1:40 a 1:320) de cada AcM en líquido de dilución (PBS más NaCI 0,35 M) y las microplacas incubadas por 15 minutos a 37°C, seguido de un ciclo de tres lavados con 'líquido de lavar'. Luego se procedió a la adición de un segundo anticuerpo conjugado a la peroxidasa (conejo anti-ratón IgG/ peroxidasa; Dako; 1:150 en líquido de dilución), a una dilución apropiada (usualmente 1:150). Después de un nuevo período de incubación de 15 minutos a 37°C y nuevo ciclo de lavados, se adicionó el substrato 3-amino-9-ethylcarbazole (Sigma) con 0,03% de H2O2 (Harlow y Lane, 1988). Después de 15-50 minutos de incubación a temperatura ambiente, el revelador fue removido, la reacción detenida por la adición de líquido de lavar y las microplacas examinadas en microscopio óptico, buscándose la coloración rojocarmín característica en el citoplasma de las células infectadas. En cada microplaca fueron incluidos controles positivos y negativos.

Resultados

Los resultados obtenidos en la caracterización de todos los pestivirus examinados son presentados en la Tabla 1. Aunque todo el panel de 25 AcMs fueron usados, para mayor claridad aquéllos que no demostraron reactividad no fueron incluidos en la tabla. El ACM reconocen las glicoproteínas virales gp 53 y gp 48. Variaciones antigénicas en estas proteínas son más frecuentes, una vez que como parte del envoltorio viral, están más sujetas a cambios en su composición de proteínas no estructurales, como es el caso de p 125/80 (Collet y col., 1989). Aunque es muy probable que los virus estudiados hayan sufrido variaciones en la naturaleza, cambios en la composición antigénica pueden haber sido generados a través de pasajes in vitro.

Las cepas originarias de cultivos celulares probablemente fueran sometidas a varios subcultivos en laboratorio, aunque no se pueda determinar con exactitud el número de pasajes, puesto que es desconocido el origen de la contaminación; durante estos pasajes, es posible que hayan sufrido alteraciones antigénicas, tal como lo indica Moennig y col. (1987).

Las cepas de BDV, aunque poco numerosas en este estudio, también presentarán perfiles de reactividad variables frente a los Acms empleados. La cepa 'BDW' de BDV en este trabajo no se distinguió de otras 4 cepas de BVDV (MBDK 156 y 146, EVI 001 y 006). La cepa 'BDW' fue estudiada por otros autores y se presentó muy semejante antigénicamente a muestras de BVDV, por lo que fue denominada 'BVDV like' (Paton y col., 1994; Tijssen y col., 1996). Por lo tanto, la misma no debe ser tomada como referencia para buscar una distinción entre BVDV y BDV En los perfiles obtenidos con las demás cepas de BDV los Actos utilizados no fueron capaces de proporcionar una clara distinción entre muestras de los pestivirus de rumiantes. Las cepas de BVDV 'SOLDAN' y 'VM/96' presentaron un perfil de reactividad semejante a los perfiles de las cepas de BDV especialmente 'BD 137/4' y 'BD390'. Además, sus perfiles de reactividad fueron distintos de la cepa 'BVDV-like' BDW. Sin embargo, y respetado el limitado propósito del presente estudio, las cepas 'SOLDAN' y 'VM/96' parecen tratarse de virus más semejantes al BDV que al BVDV. Interesantemente, estas dos cepas fueron aisladas de casos clínicos agudos y fatales de una enfermedad que se creía se trataba de la enfermedad de las mucosas en terneros. Sin embargo, el análisis filogenético de la cepa 'SOLDAN' reveló por secuenciamiento de la porción no traducida 5' de su genoma parece tratarse de una cepa perteneciente al 'tipo II' (Canal y col., 1998). Aunque no hubo comunicaciones de infecciones sintomáticas asociadas a cepas de BVDV tipo 11 en Brasil, en el mismo simposio fue presentada una comunicación acerca de otra cepa del tipo II aislada en al país (Gil y col., 1998). Así que es probable que los AcMs utilizados sí sean capaces de diferenciar cepas del tipo I de aquellas del tipo II, en base a su perfil de reactividad por inmunoperoxidasa. Claro es que son necesarios más datos para definir con mayor exactitud las características antigénias de estas cepas. Estudios futuros serán realizados para permitir una mayor profundidad en el análisis de la biología de las mismas. Mientras más informaciones sean obtenidas la descripción de la ocurrencia de cepas de BVDV con perfil antigénico similar a cepas de BDV, y con características de BVDV del tipo II, queda aquí registrada.

Las cepas de CSFV presentaron una mayor homogeneidad en sus perfiles de reactividad, considerado como el grupo más estable (Wensvoort y col., 1986; Edwards y col., 1991). No obstante, las cepas de CSFV demostraron dos distintos modelos de reactividad antigénica, evidenciando la variación en los perfiles de las cepas de CSFV recientemente aisladas en Brasil (EVI 100, EVI 136 e EVI 192 aisladas en 1987). Esta estrecha variación antigénica también fue encontrada por Edwards y Sands (1990) y Lowings y col. (1996).

AcM 112 fue el más panrreactivo de todos los AcMs evaluados, una vez que reconoció antígenos en 24 de las 27 cepas testadas en este estudio. Entretanto, las cepas 'antiguas' de CSFV no fueron reconocidas por el mismo.

Hubo una clara distinción entre los perfiles de reactividad obtenidos con las cepas de pestivirus de rumiantes (BVDV y BDV) y cepas de CSFV Cepas de BVDV y BDV fueron básicamente reconocidas por los AeMs producidos contra pestivirus de rumiantes. De la misma forma, cepas de CSFV fueron principalmente reconocidas por AcMs producidos contra pestivirus de suinos. El AcM 112 reconoció todas las 19 cepas de pestivirus de rumiantes, y ninguna de CSFV Por otro lado, el AcM 306 reconoció todas las cepas de CSFV y ninguna de pestivirus de rumiantes. Solamente un aislado brasileño de BVDV (cepa SOLDAN), además de tres cepas 'standard' de este virus (C24V Singer y NADL) y una cepa de BDV (137/4) fueron reconocidas por AcMs producidos contra cepas de CSFV.

Una gran heterogeneidad fue observada entre los perfiles de reactividad obtenidos con las cepas de pestivirus de rumiantes. Sin embargo, en la Tabla 1 las cepas fueron agrupadas de acuerdo con los perfiles de reactividad obtenidos. Los nueve primeros aislados de BVDV listados en la tabla 1 (MDBK 411, 211, 69, 137 y 129) presentaron un perfil de reactividad uniforme frente a los AeMs que reconocen p l25/80 (AcMs 112, 160 y 212). Como variabilidad en los AcMs dirigidos contra gp48 y gp53 (Tabla l). Las cepas SOLDAN y VM/96 presentaron un perfil de reactividad totalmente diferente de las demás cepas de BVDV y muy similares a aquéllos detectados con las cepas de BDV Las tres cepas 'clásicas' de BVDV (NADL, C24V y Singer) fueron reconocidas por la mayoría de los AcMs producidos contra BVDV en Tabla 1.

Las cepas de CSFV presentaron una menor variación en sus perfiles antigénicos, siendo reconocidas esencialmente por un grupo de seis AcMs (112, 304, 187, 306, 302 y 220). Las cepas 'antiguas' de Brasil (PS Porco, Biológico y Castro) demostraron un padrón de reactividad similar al presentado por las cepas Alfort y Glentorf, y distinto del presentado por las cepas locales de CSFV aisladas más recientemente (EVI 100, 136 y 192).

Discusión

 En este estudio se buscó la determinación de los perfiles de reactividad obtenidos con cepas brasileñas de pestivirus y su confrontación con los perfiles presentados por cepas 'standard'. Con excepción de los tres aislados brasileños de CSFV examinados anteriormente por Edwards y Sands (1990) y Lowings y col. (1996), que son del conocimiento de los autores, hasta el presente estudios sobre la caracterización antigénica de pestivirus brasileños o de otros países latinoamericanos con anticuerpos monoclonales no han sido reportados.

Los resultados obtenidos revelaron una gran heterogeneidad entre los perfiles de reactividad observados con los aislados de BVDV Las cepas de BVDV aisladas de cultivos celulares presentaron variaciones principalmente frente a los AcMs.

Debido al programa brasileño para la erradicación de la peste porcina clásica, una de las importantes aplicaciones prácticas del presente trabajo fue determinar si cepas locales de CSFV podrían ser diferenciadas de pestivirus de rumiantes aislados localmente. Los resultados obtenidos evidencian que esta diferenciación fue claramente obtenida con los AcMs empleados. Además, dada la posibilidad de transmisión de pestivirus interespecies (Wensvoort & Terpstra, 1988; Paton y col., 1994; Edwards y col., 1995; Paton y col., 1997), se requiere una caracterización más profunda de los virus aislados.

Los resultados obtenidos en Tablas 1 y 2 confirman la importancia del uso de los AcMs para diferenciación de CSFV de los otros pestivirus. En adición, el análisis con paneles de AeMs establece perfiles de reactividad los cuales pueden ser usados como marcadores epidemiológicos, importantes para el estudio de la biología de infecciones causadas por pestivirus. Este estudio deberá ser ampliado en busca del análisis de un mayor número de cepas de pestivirus brasileñas y de otros países de América del Sur.

TABLA 2 PERFIL DE REACTIVIDAD DE CEPAS DE PESTIVIRUS FRENTE A UN PANEL DE ANTICUERPOS MONOCLONALES (AcMs) EN PRUEBAS DE INMUNOPEROXIDASA (IPX) SOBRE CULTIVOS CELULARES

 

Especificidad de los AcMs

p 125/80

GP 48

GP 53

indeterminada

AcM número

112

160

212

210

166

214

215

162

115

163

220

216

217

174

304

187

306

302

CEPAS DE BVDV*

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

MDBK 411

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

MDBK 211

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

MDBK 69

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

MDBK 137

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

FLK 129

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

MDBK 156

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

MDBK 146

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

EVI 001

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

EVI 006

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

C24V

 

 

 

 

 

 

 

SINGER

 

 

 

 

 

 

 

NADL

 

 

 

 

 

 

 

 

 

SOLDAN

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

VM96

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CEPAS DE BDV**

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

BD W

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

BD M2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

BD 3535

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

BD 137/4

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

BD 390

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CEPAS DE CSFV***

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

EVI 100

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

EVI136

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

EVI192

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

PS PORCO

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

BIOLÓGICO

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CASTRO

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ALFORT

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

GLENTORF

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

# Números de acuerdo con la tabla 1. * BVDV = virus de la diarrea vírica de los bovinos. ** BDV= virus e la enfermedad de la frontera *** CSFV= virus de la peste porcina clásica Obs: Puntos negros indican reacciones positivas a la IPX: espacios en blanco indican reacciones negativas. Para descripción de la origen de las cepas refierase al texto en material y métodos.

 

Agradecimiento

Este proyecto fue financiado principalmente por la International Foundation for Science (IFS), otorgado por el CNPq y FAPERGS. Los autores agradecen a todos los colegas por el envío de muestras de células y virus, especialmente a la Dra. J. Bersano por el envío de muestras de CSFV.

 

Referencias

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