Introducción

El uso de drogas antimicrobianas (antibióticos y sulfas) en Medicina Veterinaria, sin lugar a dudas ha sido una de las principales herramientas en el control y erradicación de enfermedades infecciosas de origen bacteriano en animales de abasto y compañía. Sin embargo, casi paralelamente con su introducción a fines de la Segunda Guerra Mundial, se comenzó a investigar en tomo a los efectos adversos que pudieran provocar la presencia de estos fármacos en productos destinados a consumo humano, como son leche, carne y huevos (Berridge, 1956), creciendo estos últimos años notablemente el número de publicaciones científicas, relacionadas con este aspecto.

Así por ejemplo, es importante mencionar el caso de cloranfenicol, cuyo efecto adverso más importante se ejerce sobre la médula ósea, constituyéndose este antibiótico en una de las drogas que más comúnmente provoca anemia aplástica. El hecho de que la frecuencia de aparición de los síntomas no tenga relación con la dosis (Kucers, 1980) y que la enfermedad se manifiesta especialmente en individuos que se han expuesto a la droga en más de una ocasión, ha motivado a los Estados Unidos, Canadá y a los países de la Comunidad Europea, a prohibir o restringir su empleo en animales de abasto (Settepani, 1984; FDA, 1991), existiendo penalidades a nivel de los productores y plantas procesadoras si se encuentran trazas de esta droga en los productos finales (Keukens y col., 1992).

También son conocidos los efectos de la oxitetraciclina, cuya actividad quelante lleva a la formación de un complejo tetraciclina ortofosfato de calcio en dientes y estructuras esqueléticas (Goodman y Gilman, 1988), siendo una de las drogas de mayor vigilancia en los países de gran desarrollo ganadero a nivel de residuos en carne y leche (Oka y col., 1991).

Otros riesgos en la población humana, interesantes de mencionar, son las reacciones de hipersensibilidad a las penicilinas naturales, semisintéticas y cefalosporinas (Dewney y Edwards, 1984; Ryan y col., 1986); y las alteraciones en la microflora intestinal causantes de 'colitis seudomembranosas', provocadas por antibióticos como clindamicina y amoxicilina, entre otros (Bartlett, 1990).

Sin lugar a dudas una de las medidas más adecuadas, para evitar la presencia de estas drogas en productos de origen animal destinados al consumo humano, es respetar los períodos de resguardo o supresión que recomiendan las industrias farmacéuticas para sus productos; sin embargo esto no siempre se lleva a cabo.

Esto ha llevado a que países de gran desarrollo lechero hayan establecido legislaciones sanitarias gubernamentales, que regulan y norman el uso de antibióticos, controlando los niveles máximos permitidos o también denominados niveles de tolerancia en los alimentos de origen animal; éstas varían de un país a otro, pero siempre dentro de los márgenes recomendados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) (Booth y Harding, 1986) o la Food and Drug Administration de los Estados Unidos (FDA).

Así por ejemplo el Milk Marketing Board de Inglaterra y Gales, a partir del año 1965, dicta normas sobre el manejo de vacas lactantes con estas drogas (Booth, 1986). La FDA, en la misma década, dictó normas para controlar la presencia de antimicrobianos en alimentos de origen animal, estableciendo sanciones para quienes contravengan estas disposiciones; en la actualidad este organismo controla la calidad de la leche a través del PMO (Pasteurized Milk Ordinance) (FDA, 1990).

Una de las últimas disposiciones de la FDA está dirigida al etiquetado de los productos farmacéuticos, estableciendo que debe incluirse en él, el tiempo de eliminación o también denominado 'período de resguardo' de las drogas en la leche. Debe indicarse además las condiciones de almacenamiento de las drogas a nivel predial, señalando que los productos farmacéuticos utilizados en vacas lactantes deben ser separados de aquéllos destinados a vacas no lactantes (Appendix N del PMO, abril de 1991; Wayne, 1993).

Todas estas legislaciones pasan por tener técnicas estandarizadas para la detección de residuos de antibióticos en leche, carne y huevos.

Diversos métodos han sido empleados para los fines de detectar 'residuos' de antimicrobianos en leche, y su aplicación depende básicamente de los recursos económicos a nivel estatal y privado. Los métodos de mayor sensibilidad corresponden a técnicas fisicoquímicas como por ejemplo la cromatografía de alta resolución (HPLC) (McEwen y col., 1992), electroforesis (Cáceres, 1990), métodos inmunológicos como el radioinmunoensayo (Keukens y col., 1992) y uno de los más modernos, el Charm II (Cullors, 1992). El empleo de estos métodos, debido fundamentalmente a sus elevados costos, se limita sólo a instituciones supervisoras a nivel gubernamental.

Existen además los métodos microbiológicos, que pueden ser cualitativos y cuantitativos, y se basan en la capacidad de difusión del antibiótico o sulfa en un medio de cultivo que contiene determinada cepa bacteriana. Éstos tienen la ventaja de ser fácilmente implementables, poseer bajos costos y otorgar una adecuada confiabilidad, razón por la cual siguen siendo aún métodos de elección en análisis de rutina (Booth y Harding, 1986; Cullors y col., 1992). Así por ejemplo, el Commonwealth of Pennsylvania (USA) los utiliza como métodos oficiales para detectar 'residuos' de antimocrobianos en leche (Sischo y Burns, 1993).

Dado que la elección de las técnicas dependen de las realidades de cada país, ya que existen diferencias en el uso de estas drogas y considerando que a nivel nacional es necesario disponer de un método estandarizado, admitido internacionalmente, que sea de bajo costo, fácil implementación y capaz de detectar la mayoría de los antimicrobianos de uso rutinario, en el presente trabajo se ha planteado evaluar la sensibilidad de el Método Microbiológico de Cilindros en Placa (AOAC, 1984), utilizando como cepa bacteriana Bacillus subtilis BGA (Gesche, 1986) para la detección de 'residuos' de antibióticos y sulfas en leche.

 

Trabajo financiado por: Proyecto DTI A-3518 Universidad de Chile.

Materiales y métodos

Se utilizó como referencia la Técnica Microbiológica de Cilindros en Placa estandarizada por la Association of Official Analytical Chemist -AOAC- (1984), empleando como cepa bacteriana Bacillus subtilis BGA (Gesche, 1986).

El medio de cultivo de ajustó a diferentes pH, dependiendo de las características fisicoquímicas de la droga y para la detección de sulfonamidas se adicionó trimetoprim como droga pura (Gesche, 1986).

Se analizaron diferentes concentraciones de esporas en el medio de cultivo (107, 104 y 3x 103 esporas/ml de agar) con la finalidad de mejorar la sensibilidad de la técnica.

Antimicrobianos utilizados en el ensayo

Se utilizaron drogas puras con potencia conocida, las cuales se especifican en el Cuadro 1.

CUADRO 1 ANTIMICROBIANOS UTILIZADOS EN EL ENSAYO

ANTIBIÓTICO POTENCIA meg / mg LABORATORIO DE ORIGEN
PENICILINA G 1.000.000 UI Chile
CLOXACILINA 884,08 Chile
NAFCILINA 890,00 Veterquímica
CEFOPERAZONA 942,50 Chile
CEFACETRILO 994,00 Hoechst
NEOMICINA 625,00 Chile
TETRACICLINA 980,31 Chile
SULFAMETOXAZOL 100,48 Chile
LINCOMICINA 876,00 Upjohn
NOVOBIOCINA 888,00 Upjohn
DIHYDROESTREPTOMICINA 757,00 Veterquímica

A partir de ellas se prepararon soluciones madres iguales a sus Concentraciones Mínimas Inhibitorias. Los solventes empleados dependieron de las características fisicoquímicas de la droga, y la cantidad de producto activo para preparar esta solución se calculó en base a la fórmula descrita por Anhalt y Washington II (Lennette, 1985).

A partir de las soluciones madres se prepararon concentraciones decrecientes, disminuyéndolas a la mitad en cada paso, hasta obtener la correspondiente a los niveles de tolerancia recomendados para cada una de ellas por la Organización Mundial de la Salud (OMS, 1984) o la Food and Drug Administration (FDA, 1991). Para la preparación de éstas se empleó leche obtenida de animales sin alteraciones de la glándula mamaria (clínica y subclínica) y que no hubiesen recibido terapia con antibióticos o sulfas a lo menos 1 mes antes; ésta fue sometida a 100 °C por 30 segundos con la finalidad de destruir los inhibidores naturales, fundamentalmente aquellos termorresistentes como son lisozimas y ribonucleasas (Rama y col., 1985).

Sensidiscos controles

Para el control de la técnica se utilizaron diferentes sensidiscos con concentraciones conocidas de antibiótico, dependiendo del pH del medio. Estos fueron: penicilina G, 0,01 UI; estreptomicina, 0,5 mcg y sulfisomidina, 0,5 mcg.

Evaluación de la sensibilidad de la Técnica Microbiológica de cilindros en Placa utilizando Bacillus subtilis BGA

Para evaluar el grado de sensibilidad de la técnica se probaron diferentes concentraciones de los antimicrobianos en estudio, partiendo por la Concentración Mínima Inhibitoria y finalizando con los niveles de tolerancia correspondientes a cada una de ellas.

El volumen de agar seleccionado, previamente ajustado su pH y homogeneizado con una concentración determinada de esporas, se colocó sobre un placa petri. Una vez solidificado a temperatura ambiente, se colocaron sobre él cilindros metálicos estériles equidistantes entre sí, en los cuales se colocó un volumen de 200.tl de cada antibiótico en diferentes concentraciones, Figura 1.

 Figura 1. Esquema de la metodologia

Luego de la incubación a 37 °C por un tiempo de 18 a 24 horas, se procedió a la lectura de los halos de inhibición con un Vernier de precisión, expresando los valores en mm.

Análisis de resultados

Para el análisis de los resultados, cada concentración de droga se repitió 10 veces, obteniéndose en cada una de ellas halos de inhibición expresados en mm; para cada concentración se calculó su valor promedio, desviación estándar y coeficiente de variación.

Para la transformación de los halos de inhibición a concentraciones en µg/ml, se realizó un Análisis de Regresión Exponencial, obteniéndose una ecuación que fue considerada para la conversión de los halos (mm) a concentraciones de antibiótico (µg) (Caballero, 1985).

Resultados y discusión

La sensibilidad de la técnica para cada antibiótico (expresada en µg/ml), con sus correspondientes halos de inhibición (expresados en mm) se pueden observar en el Cuadro 2.

CUADRO 2 SENSIBILIDAD DE LA TÉCNICA MICROBIOLÓGICA CON BACILLUS SUBTILIS BGA, PARA LOS ANTIMICROBIANOS EN ESTUDIO

ANTIMOCROBIANOS CONCENTRACIÓN (µg/ml) HALO mm Media +/- D.E.
PENICILINA G 0,005 13,1+/-1,19
CLOXACILINA 0,15 10,8 +/-0,91
NAFCILINA 0,31 16,9 +/-1,00
CEFOPERAZONA 0,15 12,0 +-0,81
CEFACETRILO 0,15 9,5 +-0,52
NEOMICINA 0,15 11,0 +/-0,81
TETRACICLINA 0,15 13,5 +-0,46
SULFAMETOXAZOL 0,31 16,9 +/-0,73
LINCOMICINA 0,62 11,0+/-0,64
NOVOBIOCINA 0,15 12,0 +-0,71
DIHYDROESTREPTOMICINA 0,15 13,5 +-4,60

Al observar las concentraciones mínimas (grado de sensibilidad) detectadas en los antimicrobianos en estudio, se pudo apreciar que los halos de inhibición correspondientes a éstas fueron superiores a 11 mm para la mayor parte de ellos.

En el Cuadro 3 se indica la correlación y la ecuación resultante del Análisis de Regresión Exponencial usada en la transformación de los halos de inhibición en mm a concentraciones en µg/ml.

CUADRO 3 ANÁLISIS DE REGRESIÓN EXPONENCIAL PARA CADA ANTIMICROBIANO. CORRELACIÓN Y ECUACIÓN RESULTANTE PARA LA TRANSFORMACIÓN DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN A CONCENTRACIONES

ANTIBIÓTICOS r FÓRMULA
PENICILINA G 0,98 Conc. = Exp. ((halo - 3,0907) 10,3260)
CLOXACILINA 0,99 Conc. = Exp. ((halo - 2,1009) / 0,5608)
NAFCILINA 0,99 Conc. = Exp. ((halo - 1,9720) 10,6648)
CEFOPERAZONA 0,98 Conc. = Exp. ((halo - 2,4847) / 0,7879)
CEFACETRILO 0,99 Conc. = Exp. ((halo - 2,1062) 10,6194)
NEOMICINA 0,97 Conc. = Exp. ((halo - 2,2596) / 0,4389)
TETRACICLINA 0,98 Conc. = Exp. ((halo - 2,2534) / 0,3437)
SULFAMETOXAZOL 0,94 Conc. = Exp. ((halo - 2,2153) 10,4880)
LINCOMICINA 0,99 Conc. = Exp. ((halo - 1,3164) / 0,4433)
NOVOBIOCINA 0,99 Conc. = Exp. ((halo - 1,8383) / 0,4138)
DIHYDROESTREPTOMICINA 0,98 Conc. = Exp. ((halo - 2,0496) / 0,4498)

Discusión

Al analizar los resultados correspondientes a la menor concentración detectada para cada antimicrobiano en estudio, podemos verificar que la Técnica Microbiológica de Cilindros en Placa, utilizando como cepa bacteriana Bacillus subtilis BGA, es adecuada para la detección de concentraciones residuales en leche para los antimicrobianos en estudio, ya que los rangos de sensibilidad del método están dentro de los niveles de tolerancia que recomiendan diferentes organizaciones internacionales como son la Organización Mundial de la Salud -OMS- (Booth y Harding, 1986) y la Food and Drug Administration -FDA- (1991).

Así por ejemplo, al analizar los datos de penicilina, fármaco de referencia para evaluar la eficacia y sensibilidad de diferentes técnicas empleadas con este fin, se puede corroborar la bondad del método empleado, ya que la concentración mínima detectada en este trabajo fue de 0,005 µg/ml (0,005 ppm), valor que está dentro del rango de los niveles de tolerancia, es decir, concentraciones inocuas en alimentos de origen animal para el consumo humano, recomendados por la FIJA u OMS para esta droga (0,006 ppm).

Es interesante mencionar que la sensibilidad del método empleado en este trabajo, siempre utilizando como patrón penicilina, fue bastante superior al compararla con resultados de otros trabajos que también emplearon métodos microbiológicos, utilizando como cepa bacteriana Bacillus subtilis BGA (Bishop y White, 1984). Esto se puede atribuir a dos variables importantes en la metodología empleada que influyen en la sensibilidad de la ténica: a) concentración de esporas en el medio de cultivo; b) pH del medio de cultivo.

Se reconoce que la concentración de microorganismos, en el medio de cultivo, es una de las variables más importantes que influye en la difusión de un antimicrobiano en los métodos microbiológicos, ya que a mayor cantidad de ellos, menor posibilidad tiene el antibiótico o sulfa de difundir en el medio. En nuestro caso, la concentración empleada fue de 3x103 esporas/ml de agar, la cual es bastante inferior a la citada en otro trabajo, quien habitualmente emplea 107 a 104 esporas/ml de agar (Gesche, 1986).

En relación al pH del medio de cultivo, tal como lo ha mencionado otro trabajo (Gesche, 1986), esta es una variable de gran importancia para mantener la actividad de los antimicrobianos, ya que los antibióticos y sulfas tienen diferentes estructuras moleculares, pudiendo ser ligeramente catiónicas o aniónicas. Tomando en cuenta esta variable, en el presente trabajo los pH seleccionados estuvieron de acuerdo a las características fisicoquímicas de las drogas (Prescott y Baggot, 1988); es así como se utilizó un pH 6,2 para detectar betalactámicos, cefalosporinas, tetraciclinas y lincomicina; pH 7,2 para sulfonamidas y pH 8,0 para aminoglucósidos y novobiocina.

De acuerdo a estas variables, podemos indicar que todas las muestras que den como resultado un halo de inhibición igual o mayor a 11 mm pueden darse como positivas a la presencia de residuos, pero siempre recordando que el microorganismo empleado es B. subtilis BGA a una concentración de 3x103 esporas/ml de agar.

Para el caso de los otros antimocrobianos evaluados en el presente trabajo, el método presentó una buena sensibilidad para las tetraciclinas, novobiocina, dihydroestreptomicina, cefalosporinas y neomicina, ya que las concentraciones mínimas detectadas estuvieron dentro de los niveles de tolerancia recomendados por la OMS (1986) o la FDA (1991). Los niveles de tolerancia recomendados por estos organismos son: oxitetraciclina, 0,1 ppm; noboviocina, 0,15 ppm; dihydroestreptomicina, 0,125 ppm; cefalosporinas, 0,01 ppm; neomicina, 0,15 ppm

Para sulfametoxazol, lincomicina, nafcilina y cloxacilina, las concentraciones mínimas detectadas fueron ligeramente superior a los niveles de tolerancia recomendados por los organismos internacionales, pero siempre dentro de los niveles aceptables; esto sugiere el uso de otras pruebas más sensibles para estos antimicrobianos; entre ellas podemos mencionar los métodos microbiológicos que empleen otras cepas bacterianas como Bacillus stearothermophilus ver. cadilolactis, Bacillus cereus o Sarcinea lutea (Bishop y White, 1984; Cullors y col., 1992; McEwen y col., 1992).

Mediante estos resultados podemos corroborar lo mencionado por otros investigadores, quienes indican que los métodos microbiológicos continúan siendo de gran utilidad para el estudio de residuos de antimicrobianos en diferentes fluidos biológicos de origen animal, como es el caso de la leche, dado que éstos se consideran los más prácticos y económicos, además de presentar una adecuada confiabilidad en su sensibilidad (Cullors y col., 1992). Así por ejemplo, el Comonwealth of Pennsylvania (USA), utiliza los tests microbiológicos como métodos oficiales para detectar residuos de antibióticos y sulfas en leche (Sischo y Burns, 1993).

Finalmente, estimamos que las técnicas microbiológicas, por su adecuada confiabilidad, fácil ejecución y bajos costos, deberían ser consideradas en nuestro país para emplearse como métodos de rutina en la vigilancia de residuos de antimicrobianos en alimentos de origen animal. Otros métodos como por ejemplo HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) e inmunológicos, aun cuando son métodos muy sensibles sus altos costos limitarían su uso, justificándose quizás en instituciones supervisoras a nivel gubernamental, a lo menos por ahora.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen la colaboración de los Laboratorios Chile, Hoechst; Rhodia Merieux; Upjohn Veterquímica.

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Recibido el 13 de septiembre de 1993. Aprobado el 15 de mayo de 1996.