Introducción

La determinación de las isoenzimas (isoformas) de fosfatasa alcalina (ALP; E.C. 3.1.3.1) en el suero de los animales domésticos y en el hombre parece tener una importante significancia clínica, de acuerdo a lo observado por diversos autores (Dumas y Spano, 1980; Thorén-Tolling, 1988 b; Kramer, 1989). Su separación se ha realizado en base a sus diferencias en sitios catalíticos, inhibidores de la movilidad electroforética previo y posterior a la remoción del ácido siálico, inmunogenicidad y secuencias aminoacídicas (Moss, 1982; Hoffman, 1990). Sin embargo, a pesar de ello, aún no hay una clara definición de las isoenzimas que existen en la sangre de los animales domésticos, por lo que su relación con los diferentes tejidos y órganos no está bien definida.

La determinación de la actividad sanguínea de ALP es una medida de la actividad combinada de isoenzimas individuales de diferentes tejidos (Horney y col., 1992), que se encuentran unidas a la membrana plasmática por unión covalente a fosfolípidos en diversos tejidos como son, entre otros, hígado, hueso, mucosa intestinal y riñón (Amthauer y col., 1992; Wong y Low, 1992). Por ello, la separación de estas fracciones en el suero es de gran importancia en la detección del tejido u órgano afectado.

En el equino, bajo condiciones normales, sólo las isoenzimas de hígado y hueso han sido las más frecuentemente observadas (Blackmore and Elton, 1975; Thorén-Tolling, 1988; Hank y Col., 1993). Blackmore y Palmer (1977) han sugerido la presencia en suero de ALP intestinal en parasitismo y diarreas agudas, lo que está en desacuerdo con lo planteado por Hoffmann y col. (1983), quienes consideran que esta isoenzima no se encontraría en la sangre debido a su corta vida media. Por otro lado, Thorén-Tolling (1988) ha descrito en el suero de yeguas preñadas (12 semanas antes del parto) la presencia de una ALP de origen placentario. Sin embargo, posteriormente Amthauer y col. (1992) han descrito una ALP de origen plancentario que sólo estaría presente en el hombre y primates superiores.

Utilizando el método de la electroforesis en gel de agarosa y el pretratamiento de los sueros con neuraminidasa (sialidasa E.C. 3.2.1.18), los cuales han mostrado ser efectivos en la separación de diferentes fracciones de ALP en el hombre y animales domésticos (Chamberlain y col., 1992; Homey y col., 1992; Rudolph y col., 1995), en el presente trabajo se analizan dos grupos fisiológicamente diferentes de yeguas Fina Sangre de Carrera Inglés (FSC), para estudiar el comportamiento en sangre de esta enzima.

 

 Trabajo financiado por FONDECYT. Proyecto Nº 1940294.     Financiamiento publicación D.T.I. U. Chile.

Material y métodos

Veinte yeguas Fina Sangre de Carrera Inglés (FSC), entre 4 y 13 años de edad y mantenidas en un aras de la comuna de El Monte, Región Metropolitana, fueron utilizadas en este trabajo. Todas ellas se presentaban en buen estado de salud y la mitad se encontraba en los últimos meses de gestación, permaneciendo en potrero durante el día y siendo estabuladas durante la noche. Todas fueron sometidas a un examen físico y perfil bioquímico. A cada animal se les extrajo en la mañana 2 muestras de sangre con y sin anticoagulante (EDTA sal potásica) por venopunción yugular, utilizando tubos con vacío (Venoyect). En la sangre con EDTA se determinó proteína plasmática (PP) en g/dl (método del refractómetro), hemoglobina (Hb) g/dl (método de la cianometahemoglobina) y el volumen globular aglomerado (VGA) % (microhematocrito).

La sangre sin anticoagulante fue centrifugada a 1.000 G durante 20 min en una centrífuga refrigerada (Kubota 8700 Pronoc). En el suero obtenido se determinó la actividad enzimática (U/L; 30 °C) de la aspartato aminotransferasa (AST; E.C. 2.6.1.1), creatin kinasa (CK; E.C. 2.7.3.2), gammaglutamil transferasa (GGT; E.C. 2.3.2.2), y fosfatasa alcalina (ALP; E.C. 3.1.3.1), utilizando un espectrofotómetro semiautomático (Microlab, Merck) y reactivos comerciales (Boehringer Mannheim). Además, se determinó la concentración de calcio y fósforo (mg/dl), utilizando los métodos de o-cresolftaleína-complexona y fosfomolibdato, respectivamente (Merck).

En el suero sanguíneo se separaron las isoenzimas de ALP, utilizando para ello un método comercial de gel de agarosa (Titan Gel Alkaline Phosphatase Isoenzyme Gel de Helena Lab.), siguiendo las indicaciones del fabricante con algunas modificaciones. El suero de cada yegua fue analizado en paralelo con y sin neuraminidasa (sialidasa, E.C.3.2.1.18) de Vibrio cholerae (Enhancer de Helena Lab.), incubando 25 µl de suero con 5µl de neuraminidasa por 5 min a temperatura ambiente. Cinco microlitros de cada suero fueron aplicados en una placa de agarosa, la que fue ubicada posteriormente en una cámara de electroforesis que contenía buffer frío tris-barbital-barbital sódico pH 8,6-9,0, aplicándose una corriente de 250 V por 30 min. Las bandas de ALP fueron visualizadas por tinción específica en una cámara obscura a 45°C, con azul de nitrotetrazolium en buffer sustrato 5-bromo 4-cloro 3-indolil fosfato.

Posteriormente las placas fueron lavadas en ácido acético al 10% y agua destilada, realizándose la densitometría óptica a 595 mm (Quick Scan Jr., Helena Lab.) en las placas húmedas.

En cada placa se determinó el porcentaje de cada fracción y su migración relativa (MR), considerando para ello el punto de aplicación del suero y la migración de la albúmina sérica, la que se tiñó con Rojo Ponceau cuando fue necesario. La MR se obtuvo dividiendo los mm recorridos por la banda ALP por los mm recorridos por la albúmina. Utilizando la MR de cada banda (con y sin neuraminidasa), éstas se compararon con las MR de bandas previamentes obtenidas en extractos de tejidos por Rudolph y col. (1994), con el fin de determinar su origen tisular. Para ello el valor RM se asemejó al valor más próximo de los estándares. Las bandas de cada tejido se numeraron siendo la número 1 la banda más anódica, es decir, la con mayor migración.

Como en los estándares de tejido antes mencionados no existían extractos de placenta, éste se realizó en duplicado a partir de una placenta a término, obtenida en un aras de la VI Región, sometiendo 2 y 4 g de tejido al mismo tratamiento con butanol utilizado con anterioridad (Rudolph y col., 1994).

Los resultados obtenidos son expresados como promedio +/- desviación estándar (DE). La significación estadística al comparar los grupos y promedios se obtuvo por ANDEVA y la prueba de 't' para promedios.

Resultados y discusión

Al comparar los resultados de los perfiles realizados a los dos grupos en estudio (Cuadro 1) se observó que las yeguas no preñadas presentaban un VGA y Hb inferiores a los valores observados en las yeguas preñadas (P < 0,05). Además, la proteína plasmática y el Ca total también presentaban valores más bajos (P < 0,05), en cambio, las enzimas AST, CK, GGT y el Pi presentaban valores semejantes (P > 0,05).

CUADRO 1 PERFIL BIOQUÍMICO DE LOS GRUPOS ANALIZADOS

- Días pre-parto VGA % Hb g/dl PP g/dl AST U/L CK U/L GGT U/L Cam g/dl Pim g/dl
Yeguas. no preñadas

-

38,30* +/-3,03 13,34 +/-0,91 6,56 +/-0,30 135,70 +/-30,97 156,60 +/-100,95 9,50 +/-3,96 11,90 +/-0,53 2,77 +/-0,74
Yeguas preñadas 22,40 +/-16,03 45,70 +/-1,49 15,39 +/-0,71 7,07 +/-0,31 127,90 +/-33,09 145,80 +/-55,82 8,10 +/-2,95 13,19 +/-1,41 2,59 +/-1,06
P. - < 0,05 < 0,05 < 0,05 N.S. N.S. N.S. < 0,05 N.S.
*Valores son el promedio +/- D.E. de diez animales.

La actividad sérica total de ALP (U/L) y las 3 bandas observadas en ambos grupos (Cuadro 2) presentaron valores semejantes, a excepción de la banda 2 que fue significativamente inferior (P < 0,05) en el suero de las yeguas preñadas.

CUADRO 2 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA SÉRICA (U/L) DE FOSFATASA ALCALINA Y SUS ISOENZIMAS EN YEGUAS FSC

Yeguas ALP TOTAL BANDA 1 BANDA 2 BANDA 3
No preñadas 356,30+/-93,72* 292,69+/-82,31 55,47+/-14,79 7,50+/-2,33
preñadas 327,30+/-64,36 287,50+/-56,98 33,18+/-12,84 7,72+/-4,03
P. N.S. N.S. < 0,05 N.S.
*Valores corresponden al promedio +/- D.E. de 10 animales.

En el Cuadro 3 se entregan los promedios de migración relativa de las bandas observadas con y sin neuraminidasa y su distribución porcentual, en ambos grupos de yeguas. La banda más anódica (con y sin neuraminidasa) en ambos grupos fue semejante en su migración relativa (P > 0,05), y fue la que presentó la mayor actividad porcentual (sobre un 80%). De acuerdo a su migración relativa y comparada con estándares de tejidos (Rudolph y col., 1994), esta fracción correspondería a la fracción HÍGADO-1.

CUADRO 3 MIGRACIÓN RELATIVA Y DISTRIBUCIÓN PORCENTUAL DE LAS BANDAS DE ALP OBSERVADAS EN LOS SUEROS DE YEGUAS PREÑADAS Y NO PREÑADAS

- SIN NEURAMINIDASA CON NEURAMINIDASA
BANDA 1 BANDA 2 BANDA 3 BANDA 1 BANDA 2 ..BANDA.3..
YNP 0,645+/-0,021*(***) 0,387+/-0,010 0,083+/-0,019 0,594+/-0,021 0,347+/-0,025 0,074+/-0,015
83,70+/-4,11** 14,29+/-0,35 2,01+/-0,92 81,97+/-4,57 15,75+/-2,99 2,09+/-0,70
YP 0,650+/-0,011 0,432+/-0,029 0,167+/-0,060 0,604+/-0,018 0,368+/-0,045 0,137+/-0,044
88,23+/-4,46 9,58+/-3,09 2,19+/-2,00 88,25+/-3,42 10,06+/-3,41 1,67+/-1,40
YNP = Yeguas no Preñadas. * = Migración relativa. YP = Yeguas Preñadas. ** = Distribución porcentual. ***Valores corresponden a la media +/- D.E. de 10 animales.

La segunda banda observada presentó una migración relativa de 0,432 en las yeguas preñadas y de menor migración (0,387) en las no preñadas (P < 0,05). Sin embargo, a pesar que su migración disminuyó cuando los sueros fueron tratados con neuraminidasa (0,368 y 0,347, respectivamente), ellas no presentaron una diferencia significativa entre los grupos en estudio. La distribución porcentual de esta fracción en las yeguas no preñadas fue inferior a un 20% del total, e inferior a un 10% en las preñadas. En las yeguas no preñadas la migración relativa de esta fracción en los sueros tratados y no tratados con neuraminidasa fue constante (0,347 +/- 0,025 y 0,387 +/- 0,010, respectivamente), correspondiendo a la segunda fracción de hígado (HÍGADO-2) (Rudolph y col., 1994). En cambio, en las yeguas preñadas, las MR de esta banda en el suero con neuraminidasa (0,368 +/- 0,045) y sin tratamiento (0,432 +/- 0,029) no fueron homogéneas en las diferentes yeguas, ya que 2 de ellas, muestreadas a los 47 y 55 días previo al parto, presentaron una menor migración comparadas con el resto, por lo que se asemejan a la fracción HÍGADO-2. Las 8 restantes presentaron una mayor migración en ausencia de neuraminidasa (0,418 - 0,485), aproximándose principalmente a la fracción PLACENTA-1 (Cuadro 4).

CUADRO 4 MIGRACIÓN RELATIVA Y DISTRIBUCIÓN PORCENTUAL DE LAS BANDAS DE ALP OBSERVADAS EN EXTRACTO SALINO DE PLACENTA EQUINA

 

SIN NEURAMINIDASA

CON NEURAMINIDASA

BANDA 1

BANDA 2

BANDA 1

BANDA 2

MR

0,539 a 0,571*

0,338 a 0,351

0,331 a 0,364

0,201 a 0,221

%

43,64 a 47,28

52,72 a 56,36

75,77 a 79,85

20,15 a 24,23

MR = Migración relativa. *Valores corresponden a dos experimentos en duplicado. % = Distribución porcentual.

Esta banda en los sueros tratados con neuraminidasa, por su retraso en movilidad, también se acercó a esta fracción.

La actividad porcentual de la tercera banda observada fue marcadamente baja (Cuadro 3), no presentándose en una de las yeguas no preñadas y en 3 de las preñadas. En las primeras correspondería por su migración a la fracción DUODENO-3, y en las preñadas, a la misma fracción en 5 yeguas, y sólo una posiblemente sería originaria de placenta (PLACENTA-2).

En el Gráfico 1, se entregan los patrones de isoenzimas (isoformas) observados en los dos grupos de animales analizados. En las yeguas no preñadas éste fue único, predominando hígado sobre intestino. En las yeguas preñadas también predominó hígado, presentándose además placenta y duodeno.

 GRÁFICO 1

PROCENTAJE DE PRESENTACIÓN DE LOS PATRONES DE ISOENZIMAS DE FOSFATASA ALCALINA, OBTENIDOS EN LOS SUELOS TRATADOS CON NEURAMINIDASA EN LAS YEGUAS PREÑADAS.  Y NO PREÑADAS.  CADA GRUPO DE YEGUAS CONTENÍA 10 ANIMALES H1 HÍGADO -1; H2 = HÍGADO-2; D3 = DUODENO-3; P1 = PLACENTA-1, P2 = PLACENTA -2.

 

Discusión

Los resultados obtenidos en el perfil bioquímico realizado a las yeguas analizadas (Cuadro 1) mostraron valores dentro de los rangos normales para la especie y raza (Jain, 1986; Kaneko, 1989). Sin embargo, los valores para Hb y VGA fueron significativamente mayores (P < 0,05), al igual que para la proteína plasmática y Ca sérico en las hembras preñadas. Considerando que estos animales se encontraban en los últimos meses de preñez, período en que hay un aumento del volumen sanguíneo (Physick-Sheard, 1991) y un predominio de las hormonas estrogénicas y lactogénicas (Le Blanc, 1991), esta última con un efecto somatotrófico, es posible esperar que la serie roja, proteína plasmática y Ca, se presenten aumentados en esta etapa de la preñez. Ya en 1947, McLeod y colaboradores observaron que las yeguas FSC preñadas presentaban un número de eritrocitos mayor que las yeguas no preñadas (Jain, 1986). Además, Hansen y col. (1950) entregan valores para VGA y Hb en yeguas FSC preñadas, muy semejantes a los obtenidos en este estudio.

La actividad de la ALP total (U/L) determinada en ambos grupos (Cuadro 2) fue muy semejante entre ellos, al igual que la actividad de las bandas 1 y 3. En cambio, la banda 2 de las yeguas gestantes presentó una actividad significativamente menor que las no preñadas, al igual que presentó una migración mayor que las no preñadas (Cuadro 3). Esta segunda banda de ALP en las yeguas preñadas fue variable en su migración, a diferencia de lo observado en las no preñadas, posiblemente por el estado fisiológico en que se encontraban. Como posible origen tendrían la fracción 2 de hígado en el 20% de los casos y en un 80% la fracción PLACENTA-1. Sólo una de estas yeguas presentó la fracción PLACENTA-2 que correspondió a la banda 3, tres no mostraron esta última banda y el resto coincidió con las no preñadas en la fracción DUODENO-3 (Gráfico 1).

Thorén-Tolling (1988) separa en gel de agarosa una banda de origen placentario en el suero de yeguas preñadas 12 semanas antes del parto, utilizando inhibidores químicos para confirmarla. En este estudio (Cuadro 4) observamos dos bandas con actividad fosfatásica muy semejante, las cuales retrasaron su migración al pretratar el extracto con neuraminidasa. Debido a que la fracción más anódica mostró un aumento de su actividad después que el suero fue tratado con neuraminidasa, es posible suponer de la existencia de una tercera banda que no es afectada por esta enzima y que se sobrepone a las dos bandas descritas.

La determinación de la migración relativa (MR) de las bandas de fosfatasa alcalina obtenidas tanto en sueros tratados y no tratados con neuraminidasa, permitieron clasificar las bandas obtenidas. Así tenemos que en ambos grupos de yeguas la isoenzima que predominó por su mayor migración y actividad (Cuadro 3) fue de origen hepático (fracción 1), la que es dominante en los potrillos y adultos, como ha sido observado en otros trabajos (Thorén-Tolling, 1988; Rudolph y col. 1996) y que corresponde al tejido parenquimatoso según estudios previos (Forchetti y Rudolph, 1995).

En las yeguas no preñadas la segunda isoenzima en actividad y migración fue también de origen hepático (fracción 2), siendo su origen de tejidos no parenquimatoso (Forchetti y Rudolph, 1995). La tercera fracción que fue de escasa migración y actividad correspondería a duodeno 3. Esta última, de acuerdo a lo observado en otras especies como es el canino, no se presentaría en individuos sanos. Sin embargo, ella corresponde por su migración a las fracciones observadas en extractos de duodeno (Rudolph y col., 1994). Esto sería coincidente a lo planteado por Blackmore y Palmer (1977) y Hoffman y col. (1983), quienes estiman que la isoenzima intestinal se haría presente en el suero en condiciones normales y patológicas.

En el caso de las yeguas no preñadas, el 100% de las fracciones se presentaron en todas ellas, mostrando una homogeneidad en su estado fisiológico. En cambio, las preñadas mostraron variaciones en las fracciones 2 y 3, siendo estable sólo la fracción 1, que se presentó en todas ellas.

De acuerdo a los resultados obtenidos, las yeguas FSC en los últimos meses de gestación presentarían algunas diferencias con las yeguas no preñadas, caracterizadas por tener un VGA, Hb, PP y Ca mayores, y fracciones isofórmicas de ALP diferentes, entre las cuales la más característica sería la fracción placentaria observada previamente por Thorén-Tolling (1988).

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Sr. Fernando Coloma del Aras San Patricio por las facilidades prestadas para la realización de este trabajo, como asimismo al Dr. Iván Castelblanco por su colaboración en la obtención de placenta equina.

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