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A pesar de algunas recientes tentativas de desarrollar técnicas más sensibles y específicas (inmunoelectromicroscopia; reacción en cadena de polimerasa/PCR) para la detección del virus herpes bovino-1 (VHB-1) en el semen bovino, el aislamiento y la identificación viral por el cultivo celular, permanecen como los métodos de diagnóstico más usados (Afshar y Eaglesome, 1990; Brunner y col., 1988).

El uso del semen bovino contaminado por el VHB-1 en la inseminación artificial puede acarrear graves problemas reproductivos (Kendrick y Mc Entee, 1967; Parsonson y Snowdon, 1975; Snowdon, 1965), y una vez que fue demostrado que la eliminación del virus en el semen es intermitente, solamente el examen individual de las muestras obtenidas puede asegurar la comercialización del semen libre del VHB-1 (Kupferschimied y col., 1986; Sheffy y Krinsky, 1973).

Con la finalidad de obtener métodos más eficientes para la ampliación de estudios en ese sentido, se iniciaron en nuestro laboratorio tentativas de aislamiento del VHB-1 en muestras de semen bovino a través de la inoculación en cultivo celular de crecimiento en microplacas de 24 orificios en substitución de los tubos de Leighton, anteriormente utilizados, los cuales ya habían demostrado ser inadecuados para el examen de un gran número de muestras (Rocha y col., 1993).

Se examinaron 101 muestras de semen en forma de pajuelas provenientes de 61 toros de una central de semen brasileña. Microplacas de 24 orificios recubiertas con monocapa de células MDBK (MadinDerby Bovine Kidney) previamente establecidas y cultivadas en medio esencial mínimo (MEM) con 10% de suero fetal bovino libre de anticuerpos para el VHB-1 en una concentración de 2 x 105 cel/ml y volumen de 1,0 ml por orificio fueron utilizadas cuando presentaban más de 90% de confluencia celular, generalmente después de 72 horas.

Las muestras se diluyeron en MEM 1:10 para evitar un posible efecto citotóxico del semen. La monocapa celular fue sometida a un doble lavado con solución salina de Hank, después se inoculó 0,1 ml de muestra utilizándose dos orificios por muestra.

Posteriormente a la adsorción por una hora a 37°C en estufa con 5 % de CO2, se adicionó 1,0 ml de medio de conservación sin suero a cada orificio. En cada placa se utilizó tres orificios para los controles negativos y uno para el control positivo, totalizando 10 muestras del semen estudiadas en duplicado, y cuatro controles por microplaca.

La presencia de efecto citopático (ECP) característico con alteraciones morfológicas sugestivas de aislamiento viral, fue investigada en microscopio por 5 días consecutivos, siendo consideradas negativas muestras en las que no se observase ECP después de tres pasajes. Muestras que presentaban ECP fueron tituladas e identificadas frente al suero patrón específico.

Se aisló el VHB-1 en 20 de las 101 muestras examinadas, siendo que las microplacas de 24 orificios demostraron ser de uso práctico. Un gran número de muestras puede ser examinado simultáneamente, reduciendo sensiblemente el riesgo de contaminación bacteriana por la manipulación, con economía de material y especialmente de mano de obra. Las placas, al principio descartables, fueron reutilizadas aplicando procesos rutinarios de lavado y esterilización térmica en microondas, sin que se constataran daños en el material. Su uso prácticamente dispensó el uso de pipetas, pudiendo realizar el trabajo casi exclusivamente con micropuntas, lo que facilitó enormemente la ejecución de la técnica, además de simplificar la previa preparación del material.

El examen individual de muestras de semen obtenidas permite el almacenamiento de partidas libres del virus. El método de aislamiento viral en microplacas de 24 orificios, aunque demorado, se mostró lo suficiente sensible para permitir el aislamiento del VHB-1 además del examen de un gran número de muestras de manera simultánea. Hasta que técnicas más evolucionadas estén disponibles para el uso rutinario, la técnica se muestra como alternativa de apoyo al control de esa vía de diseminación del virus, ayudando a evitar los problemas reproductivos ocasionados por el uso de inseminación artificial de semen contaminado por ese agente.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Dra. María Judith Godiño por su aporte en la traducción del artículo.

Referencias

AFSHAR, A., M.D. FAGLESOME. 1990. Viruses asociated with bovine semen. Vet. Bull. 60: 93-109.

BRUNNER, D., M. ENGELS, M. SCHWYZER, R. WYLER, 1988. A comparison of three techniques for detection of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) in naturally and experimentally contaminated bovine semen. Zuchtygiene 23: 1-9.

KENDRICK, J.W. y K. Mc ENTEE, 1967. The effects of artificial insemination with semen contaminated with IBR-IPV virus. Cornell Vet. 57: 3-11.

KUPFERSCHIMIED, H.U., U. KIHM, P. BACHMAN, K.H. MOLLER, M. ACKERMANN. 1986. Transmission of IBR/IPV virus in bovine semen: a case report. Theriogenology 25: 439-443.

PARSONSON, I.M., W.A. SNOWDON. 1975. The effect of natural and artificial breeding using bulls infected with or semen contaminated with IBR virus. Austr. Vet. J. 51: 365-369.

ROCHA, M.A., A.M.G. GOUvEIA, R.C. LEITE. 1993. Isolation of infectious bovine rhinotracheitis virus (IBR) in semen of a bull semen centre. Encontro de Virologia, Porto Alegre: 1993. Programas e Resumos. Porto Alegre, Sociedade Brasileira de Virologia, p. 258.

SHEFFY, B.E., M. KRINSKY. 1973. Infectious bovine herpesvirus in extended bovine semen. Proc. U.S. Anim. Health Assoc. 77: 131-137.

SNOWDON, W.A. 1965. The IBR/IPV virus-reaction to infection and intermittent recovery of the virus from experimentally inoculated cattle. Aust. Vet. J. 41: 135-142.

Recibido el 2 de Mayo de 1995. Aprobado el 12 de Septiembre de 1995.