Introducción

La rabia, debido a su amplia distribución y a sus características de zoonosis, constituye un problema de relevancia en la salud pública de gran parte del mundo. Esto obliga a organizar permanentes pro­gramas de provención y control, orientados princi­palmente a la vacunación masiva de animales do­mésticos, complementados con exámenes de labo­ratorio de las especies susceptibles (Abelsth y Tri­marchi, 1983).

En el país, el control de esta enfermedad ha sido complejo y costoso, agudizándose esta situación en los últimos años debido a la detección de virus en poblaciones de quirópteros insectivoros (Favi y Ca­talán, 1986; Núñez y col., 1987) constituyéndose de vital importancia la vigilancia sistemática de la fauna silvestre con el fin de prevenir la transmisión del virus a los animales domésticos que están en mayor contacto con el hombre. Por esta razón, es esencial la denuncia de casos y un buen diagnósti­co, para poder determinar la cadena epidemiológica de esta enfermedad.

En este sentido, adquieren importancia las alter­nativas de diagnóstico sensibles, rápidas, exactas y simples que puedan utilizarse en forma rutinaria.

En Chile, los casos que ingresan al laboratorio de Diagnóstico de Rabia del Instituto de Salud Pública son sometidos simultáneamente a dos métodos de diagnóstico: Inmunofluorescencia Directa e Inocu­lación en ratón lactante. Ninguna de estas técnicas posee una sensibilidad y especificidad de un 100%, aunque la primera técnica es rápida y la inoculación en ratón es más específica. Estas ventajas y desven­tajas de las pruebas, hacen necesaria su combina­ción a fin de poder entregar un resultado seguro en el menor tiempo posible.

En los últimos años, la búsqueda de un solo procedimiento que reúna las características desea­das para los efectos ya mencionados, ha centrado los estudios en los cultivos celulares, en los cuales, como ya se ha verificado, es posible aislar virus rábico a partir de animales infectados naturalmente (Baer y col., 1982). Las células BHK-21 son utili­zadas en estudios con virus polioma, aftosa, arbovi­rus y virus rábico (The American Type Culture Collection 1981).

Rudd y col. (1980), afirman que esta línea de células es ideal para la propagación de virus rábico. Según Abelsth y Trimarchi (1983), estas células son susceptibles de infectar inoculándolas con sus­pensiones al 10% de tejido nervioso de animales positivos a rabia. La comprobación de la presencia de virus se realiza entre las 24 y 72 hrs post­inoculación a través de la técnica de fluorescencia.

Larghi y col. (1975) evaluaron este sistema celu­lar en la detección de virus rábico a partir de mues­tras de saliva de animales sospechosos y lo compa­ran con la técnica de inoculación en ratones lactan­tes, concluyendo que los cultivos celulares eviden­ciaron positividad uno a siete días postinoculación, a diferencia de los ratones, que presentaron sinto­matología entre 6 y 22 días postinfección. Se con­cluye entonces que la técnica de aislamiento de virus rábico en cultivos celulares es más rápida que en ratones lactantes en muestras de saliva de anima­les sospechosos.

Los antecedentes mencionados anteriormente han motivado a realizar este estudio preliminar en cultivos celulares BHK-21, fijándose para ello los siguientes objetivos:

Comparar la rapidez de aislamiento de virus rá­bico calle en cultivos celulares BHK-21 y en ratones lactantes. Comparar dos técnicas de siembra de células BHK-21 (tubos de cultivo celular tradicional y tubos Leighton), para verificar cuál de los dos ofrece menos inconvenientes en el manejo de laboratorio.

 

Material y método

Para la realización de este trabajo se utilizaron ce­pas de virus rábico obtenidas a partir de muestras de cerebro bovino, felinos y quirópteros Tadarida bra­siliensis llegadas al Laboratorio de Diagnóstico de Rabia del Instituto de Salud Pública de Chile entre los años 1983 y 1986. En el caso de quirópteros debido a la escasa muestra se utilizó las cepas murciélago con un pasaje en cerebro de ratón. Las cepas se mantuvieron en glicerina al 50% y en congelación a -70ºC hasta su procesamiento.

Las células BHK-21, proporcionadas por el La­boratorio de Cultivo Celular, Sección Virología del Instituto de Salud Pública de Chile, fueron cultiva­das en tubos Leigthon y en tubos de cultivo celular tradicional, sembrándose en concentración de 100.000 células/ml. Se inocularon con un creci­miento aproximado de 80%.

Se requirieron además, ratones Mus musculus, cepas CFI y NHI, recién nacidos (1-2 días) y de 21 días de edad obtenidos del Bioterio del Instituto de Salud Pública.

A partir de las cepas virales se prepararon sus­pensiones con una dilución 1/1.000, las cuales fue­ron inoculadas simultáneamente en los cultivos ce­lulares BHK-21 y en ratones lactantes por vía intra­cerebral.

Inoculación en células BHK-21: Se inocula­ron 8 tubos Leighton y 8 tubos de cultivo celular tradicional por muestra con 0,2 ml por tubo de la dilución 1/1.000 se incubaron en cámara a 36ºC hasta el momento de cosechar. Inoculación en ratones lactantes: A partir de la misma dilución anterior, se inocularon 20 ratones lactantes con 0,01 m1 por vía intracerebral (Ko­prowski, 1976).

A fin de determinar con precisión el título viral de las cepas y establecer la dosis letal empleada se inocularon ratones adultos vía intracerebral. El cálculo fue realizado por el método de Red y Müench (Lorenz y Bogel, 1976).

Cosecha de cultivos celulares: Las células BHK-21 fueron cosechadas a las 24, 48 y 72 hrs postinoculación, mediante el siguiente procedi­miento que desarrollamos en nuestro laboratorio: a) Tubos Leighton: eliminar el medio de mantención, retirar el cubreobjeto y depositar en un tubo de ensayo donde se fija en acetona durante una hora a -20ºC. Posteriormente se somete a tinción directa con anticuerpos fluorescentes según Larghi, (1975). b) Tubos de cultivo celular tradicional: eli­minar el medio de mantención, lavar la monocapa con PBS (Solución tampón), cubrir las células con PBS y dejar reposar durante 10 min. a temperatura ambiente, eliminar el PBS y desprender la capa celular con un asa de pipeta Pasteur, realizar un frotis, el cual una vez seco se fija en acetona por 10 min. a -20°C y teñir con anticuerpos fluorescentes (Larghi, 1975). Cosecha de ratones lactantes: Se sacrifican 3 ratones por muestra a las 24, 48 y 72 hrs post­inoculación, la cosecha de los cerebros se realizó según la técnica descrita por Koprowski (1976).

Se consideraron como positivas aquellas mues­tras que evidenciaron antígeno rábico en una o más células. Se clasificó de acuerdo al porcentaje de células fluorescentes en:

Ausencia de células fluorescentes (Muestra Ne­gativa).
+ ++ + + + + + + + 1 - 25% de células fluorescentes. 25 - 50% de células fluorescentes. 50 - 75% de células fluorescentes. Más de 75% de células fluorescentes.

Diariamente, los tubos infectados fueron obser­vados con microscopio óptico invertido, para evi­denciar cambios morfológicos o efecto citopático.

Todas las muestras fueron observadas con mi­croscopio de fluorescencia (Ortholux II de luz por incidencia con ploemopak y filtro incorporado, au­mento 50 x 6,2).

Resultados y discusión

1. Desarrollo del virus rábico en células BHK-21

Los resultados obtenidos en el desarrollo de las cepas de virus rábico en las células BHK-21, se resumen en el cuadro 1, los cuales han sido ordena­dos de acuerdo a la especie animal a partir de la cual se aislaron, y el título obtenido por inoculación intracerebral en ratón.

CUADRO 1 CEPAS DE VIRUS RÁBICO AISLADAS A LAS 24, 48 Y 72 HRS. DE INOCULADAS, A PARTIR DE CÉLULAS BHK-21, SEMBRADAS EN TUBOS LEIGHTON Y DE CULTIVO TRADICIONAL  

Cepas

Título

24 hrs.

48 hrs.

72 hrs.

 TL

TT

TL

TT

TL

 TT

Murciélago

85/2436

6,0

+

NI

+

NI

+

NI

10

85/326

6,0

++

-

+++

-

++++

--

10

85/2014

5,8

+

NI

+

NI

+

NI

10

86/537

5,6

+

NI

+

NI

+

NI

10

85/2354

5,5

+

NI

++

NI

++++

NI

10

85/1643

3,9

++

-

++

+

++

+

10

85/1068

3,7

+

-

+

-

++

+

10

85/120

3,7

+

-

+

-

+

+

10

85/423

3,6

++

-

+++

-

+++

-

10

85/433

3,6

++

-

++

-

+++

-

10

85/822

3,5

+

NI

+

NI

+

NI

10

86/765

3,2

+

-

++

+

+++

+

10

85/1519

2,7

+

NI

+

NI

+

NI

10

85/1009

2,3

+

-

+

-

+

+

10

Felino-

85/684

4,5

+

NI

+

NI

+

NI

10

Bovino-

85/918

6,0

+

-

+ +

-

++

+

10

83/1132

4,9

  +

NI

+

NI

+

NI

10

++++ = hasta   25% Fluorescencia    TL = Tubo Leighton ++++ = hasta   50% Fluorescencia    TT = Tubo Tradicional ++++ = hasta   75% Fluorescencia    NI = No hubo información ++++ = hasta 100% Fluorescencia

1.1. Aislamiento de virus rábico en tubos Leighton:

Todos los tubos infectados con cada una de las cepas en estudio, evidenciaron positividad en los tiempos determinados.

Como se observa en el cuadro 1 todas las cepas fueron positivas a las 24 horas postinoculación, entregando porcentajes de fluorescencia que varia­ban entre el 5 y 50% como en el caso de las cepas murciélago 85/326; 85/423; 85/433; 85/1.643.

En trabajos realizados por Iwasaki y clark (1977), con células de neuroblastoma infectadas con virus fijo de alta y baja virulencia, se obtuvo positivos a las 18 hrs de incubación, observándose pequeños gránulos dispersos en la superficie celu­lar. A las 24 hrs, se detectó en el sistema de baja virulencia un porcentaje de fluorescencia de 25% y en el de alta virulencia un 65%.

Fernández y col. (1963), trabajando en células diploides humanas (HDCS), lograron al tercer día postinfección un porcentaje de fluorescencia de 0,5 a 1%, visualizando al igual que en el caso anterior, pequeños gránulos dispersos en el cito­plasma. Este porcentaje aumentó a 15% al séptimo día. Sólo se obtuvo porcentajes mayores de células fluorescentes a través de pasajes celulares.

Diversas experiencias con virus fijo en células epiteliales de conejo, han entregado resultados me­nos convincentes, Fernández y col. (1963), obtu­vieron durante los siete primeros días de incuba­ción, un porcentaje de fluorescencia que no sobre­pasó el 1 %. Estudios en células BHK-21 infectadas con virus fijo en tubos Leighton, revelaron resulta­dos positivos a las 48 hrs de incubación al trabajar con diluciones de 1/10 (no se indicó título de las cepas). Corzo y col. (1977) y Rudd y col. (1980), siguiendo la misma modalidad y utilizando DEAE-­Dextrano, obtuvieron resultados similares. Debbie y col. (1972), señalaron que es posible evidenciar antígeno fluorescente en las células BHK-21 infec­tadas a las 36 hrs de incubación; a partir de los cinco días esta fluorescencia se hace extensiva a la mayo­ría de las células. Utilizando microscopio electróni­co, Hummeler y col. (1967), evidenciaron fluores­cencia y cambios estructurales en el citoplasma, entre 8 a 9 hrs postinfección. Estudios realizados con virus calle en este sistema celular han demostra­do la posibilidad de visualizar entre 24 y 72 hrs postincubación inmunofluorescencia (Abelsth y Trimarchi, 1983; Rudd y col., 1980). Larghi y col. (1975), investigando muestras de saliva de anima­les sospechosos, detectaron positividad en células BHK-21 a las 24 hrs de inoculadas y previamente tratadas con DEAE-Dextrano.

El procedimiento de obtención de las células de los tubos de cultivo celular tradicional resultó más complejo y a la observación de los frotis se visuali­zaron células, en su mayoría destruidas, presentán­dose tinción inespecífica y dificultad en la lectura o hallazgo del antígeno (Figura 1). Además entregan resultados negativos o porcentajes de fluorescencia bajos en relación a los obtenidos en tubos Leighton.

Figura 1. Frotis de células BHK-21 infectadas con virus rábico (cepa 85/918) visualizado por IFD, a las 72 horas. Aumento 50 x 6.2. POSITIVO: +

Los tubos Leighton ofrecieron un manejo de laboratorio simple y claridad en el diagnóstico, pues la monocapa se presentó íntegra y casi sin tinción inespecífica (Figuras 2, 3, 4, 5, 6 y 7) evaluándose con mayor exactitud los porcentajes de fluorescencia observados.

   

Figura 2. Células BHK-21 obtenidas de cultivo en tubos Leighton infectadas con virus rábico (cepa 85/918) visualizadas por IFD, a las 24 hrs. Aumento 50 x 6.2. POSITIVO: +

Figura 3. Células BHK-21 obtenidas de cultivo en tubos Leighton infectadas con virus rábico (cepa 85/236) visualizadas por IFD, a las 72 hrs. Aumento 25 x 6.2. POSITIVO: ++++

 

Figura 4. Células BHK-21 obtenidas de cultivo en tubos Leighton infectadas con virus rábico (cepa 85/423) visualizadas por IFD, a las 48 hrs. Aumento 50 x 6.2. POSITIVO: +++

Figura 5. Impronta de cerebro de ratón lactante infectado con virus rábico (cepa 85/1.519) visualizado por IFD, a las 72 hrs. Aumento: 50 x 6.2. POSITIVO: +

   

Figura 6. Impronta de cerebro de ratón lactante infectado con virus rábico (cepa 85/120) visualizado por IFD, a los 10 días. Aumento: 50 x 6.2. POSITIVO: ++++

Figura 7. Impronta de cerebro de ratón lactante infectado con virus rábico (cepa 85/423) visualizado por IFD, a las 72 hrs. Aumento: 50 x 6.2. NEGATIVO.

La observación con microscopio óptico inverti­do de los tubos infectados no evidenció la presencia de efecto citopático ni alteraciones de tipo morfoló­gico en las células BHK-21, salvo las de crecimien­to celular normal, que se corroboraron con los tubos controles.

Existe controversia respecto al efecto citopático por la infección viral. Kissling (1958), señala que el virus rábico fijo y calle pueden ser mantenidos en sistemas celulares sin mostrar efecto citopático. Kaplan y col. (1960), evidenciaron efecto citopáti­co leve en células de riñón de Hamster, sin indicar el período de incubación utilizado. Fernández y col. (1963), relacionan el efecto citopático, con la pre­sencia de grandes inclusiones citoplasmáticas en células BHK-21 y HDCS en un séptimo pasaje. Por el contrario, no observaron efecto citopático frente a pequeños gránulos fluorescentes presentes en es­tos mismos sistemas celulares en un primer pasaje, a los 7 días de incubación. Experiencias realizadas en células Vero con virus fijo, muestran la presen­cia de efecto citopático entre los 7 y 9 días de incubación (Debbie y col., 1972).

La falta de efecto citopático en el presente estu­dio, se puede explicar por el corto período de obser­vación de las células infectadas, el utilizar cepas de virus no adaptadas a las células BHK-21 y el no haber realizado pasajes celulares. 1.2. Aislamiento de virus rábico en ratones lactantes

Los resultados obtenidos en el aislamiento de virus en ratones lactantes se resumen en el cuadro 2.

CUADRO 2 CEPAS DE VIRUS  RÁBICO AISLADAS A LAS 24, 48 Y 72 HRS. DE INOCULACIÓN POR VÍA INTRACEREBRAL EN RATONES LACTANTES

Cepas

Título

24 hrs.

48 hrs.

72 hrs.

Murciélago

85/2436

6,0

- - -

10

85/326

6,0

- - +

10

85/2014

5,8

- - -

10

86/537

5,6

- - -

10

85/2354

5,5

- - +

10

85/1643

3,9

- - +

10

85/1068

3,7

- - -

10

85/120

3,7

- + +

10

85/423

3,6

- - -

10

85/433

3,6

- - -

10

85/822

3,5

- + +

10

86/765

3,2

- + +

10

85/1519

2,7

- + +

10

85/1009

2,3

- - -

10

Felino-

85/684

4,5

- - -

10

Bovino-

85/918

6,0

- - -

10

83/1132

4,9

- - -

10

Debido a múltiples experiencias realizadas en ratones lactantes inoculados con virus rábico, era esperable no observar resultados positivos a las 24 hrs postinfección. En los animales que evidencia­ron positividad a la prueba de inmunofluorescencia directa entre las 48 y 72 hrs, ésta se manifestaba levemente con polvo antigénico casi imperceptible presente en una determinada zona de la preparación (figura 5), sin que ninguno de los animales presen­tara sintomatología previa. Los porcentajes de fluo­rescencia de los ratones positivos no excedieron del 1 al 2%.

Larghi (1973) y Koprowski (1976), coinciden en señalar que la presencia de sintomatología entre los 6 y 22 días postinfección permite sospechar de rabia. Sin embargo, la aparición de síntomas ner­viosos o muerte de ratones entre las 24 y 48 hrs, de inoculados deben atribuirse a otras causas, tales como, traumas, mal procedimiento de inoculación, contaminación bacteriana, etc.

El Comité de Expertos de la Organización Mun­dial de la Salud (OMS) sobre rabia (1984) concuer­da con Acha y Szyfres (1986) e indican que ratones inoculados con material sospechoso, pueden co­menzar a sacrificarse sólo a partir del cuarto día de inoculados y someter las muestras a inmunofluores­cencia a fin de disminuir el período de observación en espera de sintomatología.

Es interesante destacar que todas las cepas que evidenciaron positividad en los frotis, provenían de murciélagos, que como ya se había mencionado tenían un pasaje en ratón lactante. Esto podría ex­plicarse como un segundo pasaje del virus en el cerebro del ratón, facilitándose de esta manera la infectividad.

Al igual que en el caso de las células BHK-21 no se observó relación entre los títulos de las cepas y la positividad en los frotis de ratones lactantes, ni se evidenció relación entre la presencia de antígeno fluorescente en los frotis a las 48 hrs de incubación y los altos porcentajes de fluorescencia en las célu­las BHK-21 (Cuadros 1 y 2).

Es necesario continuar estos estudios, de técni­cas de cultivo celular, dirigidos a la especificidad y sensibilidad de la prueba; los que están en desarro­llo en nuestro laboratorio.

Wiktor y Koprowski (1980); Wiktor y col. (1980), revelaron a través de la técnica de anticuer­pos monoclonales, la determinación de distintas especificidades entre cepas de virus fijo al igual que con virus calle, comprobando existencia de varian­tes antigénicas.

Sepúlveda y col. (1985), confrontaron 15 cepas aisladas de quirópteros, porcinos, caninos, bovinos y felinos a la vacuna antirrábica 'Fuenzalida­Palacios' de uso humano y veterinario y al suero antirrábico nacional. Como resultado obtuvieron que cinco cepas, entre las cuales están las utilizadas en este estudio, 85/684, 85/433 y 85/1.068, no fueron neutralizadas por la vacuna antirrábica en dosis de 100 DL 100 y 10 DL50. Frente a las prue­bas de identificación viral con el suero antirrábico la cepa 85/684, entre otras, no fue neutralizada, obte­niéndose resultados dudosos frente a las cepas 85/ 423 y 85/433.

Estos resultados podrían estar indicando la pre­sencia de cepas atípicas con capacidades infectantes diferentes, independiente de los títulos que presen­ten al inocularse en ratones.

Conclusiones

El sistema de cultivo celular en células BHK-21 evidenció antígeno rábico en menos tiempo que la técnica de diagóstico de inoculación intracerebral en ratones lactantes. La técnica de cultivo celular en tubos Leigh­ton, resultó de mayor facilidad de manejo en el laboratorio y mayor claridad en el diagnóstico que la realizada en el cultivo celular tradicional.

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Recibido el 25 de julio de 1991, aprobado el 1 de octubre de 1991.