Introducción

Escherichia coli (E. coli) posee a lo menos dos características esenciales para desarrollar su rol pa­tógeno, que son la capacidad de producir un factor o antígeno de adhesión o pili y la de elaborar enteroto­xinas (Tzipori, 1985). En el bovino, los principales factores de adhesión al enterocito por parte de E. coli son las proteínas de superficie denominadas K99, F41 y FY (Contrepois y Gouet, 1983). E. coli enteropatógena produce dos tipos diferentes de en­terotoxinas, una termolábil (LT) y otra termoesta­ble (ST). La toxina LT está formada por dos poli­péptidos con un peso molecular de 25.000 D y 11.500 D respectivamente y es considerada de rarí­sima presentación en cepas bovinas.

La toxina ST, se describe frecuentemente en el bovino, tiene un peso molecular de 2.000 D es de naturaleza proteica, resistente a una temperatura de 100ºC y soluble en metanol (Tzipori, 1985). Se reconoce dos tipos de toxinas ST: STa y STb, de éstas sólo STa ha sido descrita en cepas de origen bovino (Dubourgier y col., 1980). A su vez se ha demostrado la existencia de dos subgrupos de toxi­nas STa: STaP y STa2 o STaH (Mainil y Kaecken­beeck, 1986). La toxina ST provocaría su acción patógena estimulando la enzima guanilato ciclasa, la que incrementaría el guanosin monofosfato cícli­co (GMPc) desencadenándose una hipersecreción intestinal con pérdida de sodio, cloro, bicarbonato y agua (Field y col., 1978, Contrepois, y Gouet, 1983; Saeed y col., 1986). Tanto la producción de pili como de toxina son genéticamente codificadas por plásmidos (Tzipori, 1985).

Una de las técnicas de detección de la toxina ST, es la inoculación intragástrica en ratón lactante de 1 a 4 días de edad, de las cepas sospechosas de E. coli (Gianella, 1976). De igual modo se ha utilizado el método de esa ligada intestinal en terneros (Myers y col., 1975).

Tanto para la toxina LT, como para la ST, tam­bién se utiliza la técnica de hibridación de ADN, la cual implica fragmentos de ADN radiactivamente marcados; la reacción positiva se detecta por auto­radiografía (Mainil y col., 1984; Kelly y col., 1985).

El presente trabajo tiene como objetivo compro­bar la enterotoxigenicidad de cepas de E. coli aisla­das desde terneros diarreicos, mediante las técnicas de inoculación intragástrica en ratón lactante y en esa intestinal ligada de terneros; como igualmente comprobar el efecto de la temperatura sobre la esta­bilidad del efecto biológico de la toxina.

 Financiado por Proyecto 0787/89 FONDECYT.

Material y método

Cepas de estudio. Se estudiaron 283 cepas de E. coli provenientes de terneros con diarrea entre 1 y 10 días de edad, de lecherías ubicadas en la zona metropolitana.

Las muestras se obtuvieron mediante tórula rec­tal. El aislamiento y la identificación de E. coli se realizó mediante metodología clásica para la fami­lia Enterobacteriaceae.

Se utilizaron además dos cepas de referencia, ST (+) y ST (-), provenientes del Centro de Referen­cia de E. coli de la Universidad de Pennsylvania, Estados Unidos de Norte América.

PRUEBAS DE ENTEROTOXIGENICIDAD

Inoculación Intragástrica en ratón lactante

El inóculo se preparó cultivando las cepas en medio líquido Cas Ye por 18 horas a 37°C con agitación constante, luego se centrifugó a 1.000 g por 10 minutos utilizándose el sobrenadarte como inóculo al cual se adicionó 50 ul de azul de Evans al 2%. Se emplearon ratones lactantes de 2 a 3 días de edad. Por cada cepa en estudio se inocularon 4 ratones con 0,1 ml de inóculo. La inoculación se efectuó por vía orogástrica utilizando una aguja hipodérmica roma. Posteriormente los animales fueron mantenidos por 3 hr a 25°C y luego sacrificados usando algodón impregnado de éter.

Para la interpretación de los resultados, se em­pleó el método de Gianella (1976) dividiéndose el peso del intestino por el peso del cuerpo (PI/PC), considerando el promedio obtenido de cuatro rato­nes inoculados por cada cepa.

Se consideró reacción negativa a la producción de toxina ST un resultado de la razón PI/PC inferior a 0,07; sospechoso entre 0,071 y 0,09 y positivo a valores sobre 0,09 (Fig. 1).

Figura 1. Inoculación intragástrica en ratón lactante. C  : Ratón control con cepa de referencia ST ( - ). +  : Positivo a la producción de toxina TS.

Asa intestinal ligada de terneros

Se utilizaron 5 terneros entre 2 y 5 días de edad, de 30 a 35 kg de peso, que habían consumido calostro, los animales provinieron de establecimientos con excelente manejo sanitario. Previo a la inoculación, los animales fueron dejados en ayunas por 24 h. El acto quirúrgico se realizó modificando la técnica descrita por Myers y col. (1975), consistió en pre­medicación con xilacina 0,1 ml im, en la fase anes­tésica se utilizó ketamina en dosis de 10 mg por kg de peso, asociada con diazepam 2 mg por kg de peso.

La intervención quirúrgica se realizó a nivel de la fosa paralumbar derecha ubicándose la válvula ileo­cecal. Un metro hacia adelante de este elemento anatómico, se procedió a ligar los segmentos intes­tinales con vetafi 0,40 a una distancia de 4 cm cada uno. Los diferentes segmentos se inocularon con 2 ml de medio de cultivo de las cepas en estudio, cultivadas en caldo BHI por 18 hrs a 37ºC, con una concentración de 109 a 1010 células por ml. Los segmentos controles se inocularon en forma alter­nada con el medio de cultivo sin inóculo. Además, en cada ternero se inocularon un mínimo de 3 seg­mentos con las cepas de referencia señaladas con anterioridad, en cada terreno se ensayó un máximo de 75 cepas.

Finalizada la inoculación se repuso el intestino en la cavidad abdominal y se procedió a suturar. El animal fue sacrificado con 1 g de tiopental sódico IV a las 18 hrs postinoculación realizándose el estudio anatomopatológico macroscópico e histo­patológico.

Los segmentos intestinales inoculados se consi­deraron reaccionantes negativos a la producción de toxina ST cuando el diámetro intestinal permaneció igual, o el aumento fue menor al doble, respecto al segmento control negativo; sospechoso cuando el diámetro aumentó al doble y positivo cuando el aumento fue tres veces o más al del segmento con­trol (Fig. 2). A los segmentos positivos se les midió el volumen de líquido acumulado en su interior luego de 18 hrs postinoculación.

Figura 2.  Asa intestinal de ternero. Flecha Negra: Segmentos negativos a la producción de toxinas ST. Flecha Blanca: Segmentos positivos a la producción de toxinas ST.

Determinación de resistencia a la temperatura de enterotoxina ST

Los sobrenadantes de aquellas cepas que resultaron positivas a la producción de ST de acuerdo al sayo en ratón lactante fueron sometidas a tratamien­tos térmicos a 65ºC durante 15 min, a 80ºC durante 30 min y a 100ºC durante 30 min y posteriormente inoculadas nuevamente en ratones usando el mismo protocolo.

Resultados y discusión

Como se puede observar en el cuadro 1, el número de cepas positivas a la producción enterotoxina ST es relativamente bajo tanto por el método en ratón lactante como en la inoculación intraintestinal en ternero. A pesar que en el ternero se detectó un número mayor de cepas productoras de enterotoxi­nas ST existe una asociación estadística significati­va entre el modelo ratón y ternero (Mc Nemar p ≤ 0,05). El ensayo en terneros puede tener una mayor sensibilidad para detectar enterotoxina STa de ce­pas homólogas o bien está pesquisando enterotoxi­na LT. Toxina LT es un raro hallazgo en cepas bovinas y su presencia se demuestra por su efecto en asa ligada de ternero y no es detectada en ratones lactantes (Ellis y Kienhols, 1977).

CUADRO 1 INOCULACIÓN DE 283 CEPAS DE E. COLI EN RATÓN LACTANTE Y ASA INTESTINAL LIGADA DE TERNERO. CEPAS POSITIVAS (+), SOSPECHOSAS (S) Y NEGATIVAS (-) A LA PRODUCCIÓN DE TOXINA TS.  

Especie

Cepas ST (+)

Cepas ST (S)

Cepas ST (-)

-

 %

%

%

Ratón lactante

34

12,01

4

1,41

245

86,57

Ternero

41

14,48

4

1,41

238

84,09

Los resultados obtenidos empleando método ra­tón lactante, difieren con los descritos por Acosta­Martínez y col. (1980), quienes estudiaron la pato­genicidad de cepas de E. coli aisladas de terneros con diarrea, detectando un 60% de cepas reaccio­nantes con este método. Sin embargo, Moon y col. (1976), reportaron un 13% de cepas productoras de ST, en la misma especie experimental. Por otra parte Myers (1975) trabajando con 373 cepas de E. coli, aisladas de terneros diarreicos, comprobó que un 18% de éstas presentaron características entero­toxigénicas al utilizar el método del asa intestinal ligada de ternero.

En el estudio anatomopatológico de las asas in­testinales ligadas inoculadas en el ternero, se pudo comprobar en el ileon enteritis hemorrágica y ente­ritis nacrótica, con marcada necrosis de las vellosi­dades intestinales. La cantidad de líquido obtenido de las asas positivas a la producción de ST fluctuó entre 10 y 80 ml. Éste fue de un color café amari­llento de característica acuosa y de mal olor.

Al analizar estadísticamente el efecto de los tra­tamientos térmicos sobre la actividad biológica de ST se detectó que temperaturas de 80ºC o superio­res, afectan significativamente la actividad toxigé­nica de la toxina ST. Esto se demostró en la prueba de inoculación intragástrica en ratones lactantes en la cual disminuyó la razón PI/PC. Mediante la prue­ba Scheffé (Nie y col., 1975) se establecieron dife­rencias significativas (p ≤ 0,05) entre los trata­mientos a 65, 80 y 100ºC, con valores promedios de 0, 1032, 0,0959 y 0,0848 respectivamente. Sin em­bargo, no hubo diferencias estadísticas entre el va­lor inicial de la razón PI/PC para la toxina sin tratamiento térmico y la toxina con tratamiento a 65ºC (p ≥  0,05) con promedios de 0,1032 y 0,1031 respectivamente.

Nuestros resultados se contraponen a lo descrito por Smith y Hall (1967) quienes consideran que ST es relativamente estable a tratamientos térmicos de 100ºC por 30 min. En cambio Whipp y col. (1975) trabajando con cepas de E. coli provenientes de cerdos, aplicaron temperatura de 37ºC por 60 min y de 100ºC por 15 y 30 minutos y posteriormente se inocularon en ratones lactantes para observar la toxicidad de las cepas tratadas. Sus resultados indi­can que temperaturas de 37ºC por 60 min no afectan la acción de ST, pero existe una baja consistente en la capacidad toxigénica de las cepas a temperaturas de 100ºC ya sea tanto a los 15 como a los 30 min existiendo diferencias significativas entre éstas.

Jacks y Wu (1974) trabajaron con enterotoxinas provenientes de cepas de E. coli aisladas desde humanos y de animales sometiéndolas a diferentes temperaturas, las que posteriormente se inocularon

en ratón lactante. Sus resultados también concuer­dan con los obtenidos en este ensayo, ya que obser­varon disminución de la toxigenicidad progresiva de ST a temperaturas superiores a 80ºC, llegando a una inactivación a 100 y 121ºC.

Referente a la sobrevivencia de los terneros ino­culados, se pudo comprobar en general, que éstos resistieron bien al acto quirúrgico, como igualmen­te el postoperatorio, hasta las 18 horas en que fue­ron sacrificados; sin ambargo, debemos acotar, que este es un método laborioso, costoso desde el pun­to de vista económico, y que además sin lugar a dudas produce gran sufrimiento al individuo experi­mental. Al observarse una asociación significativa (Mc Nemar p ≥  0,05) entre el método ratón y el método asa ligada en terneros, pensamos que esta última metodología debería realizarse sólo en casos muy justificados y no como rutina diagnóstica. Es de esperar que las técnicas de biología molecular aplicadas al diagnóstico de enteropatógenos en me­dicina veterinaria, tales como sondas de DNA, per­mitan reemplazar el uso de los animales de experi­mentación, evitando así su sufrimiento y a la vez disponiendo de ensayos rápidos, sensibles, especí­ficos y de bajo costo económico.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Dr. Richard Wilson del Reference Center, Pennsylvania State University, USA, por facilitar las cepas de referencias emplea­das en el presente trabajo.

Referencias

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Recibido el 3 de junio de 1991, aprobado el 2 de octubre de 1991.