La vacunación de bovinos adultos con dosis tradicional de Brucella abortus Cepa 19, no es recomendable por los problemas posteriores debidos a la respuesta serológica persistente que se genera y que entorpece el diagnóstico. El empleo de dosis reducida de esta vacuna ha obviado considerablemente este problema. (Plommet y Fensterbank, 1976; Nicoletti, 1979; Beckett y Mc. Diarmid, 1987).
La revacunación de bovinos adultos que ya fueron vacunados con Cepa 19 cuando terneras, provoca persistencia de niveles de anticuerpos por períodos superiores a los 8 meses, en una proporción aproximada de un 14%. (Pinochet y col., 1986). Estas respuestas serológicas postvacunales varían en intensidad y duración, según la dosis, la vía de aplicación, como la edad de los bovinos vacunados. (Alton y col., 1981).
En 1981, Díaz y col., describen la obtención de un antígeno capaz de descartar las respuestas serológicas debidas a la vacunación con Cepa 19. Posteriormente, Pinochet y col. (1989), desarrollan una metodología simple con este mismo propósito, e incluso normalizan el antígeno obtenido, que luego de evaluado ofrece resultados promisorios (Pinochet y col., 1990).
La protección que otorga la vacunación de bovinos adultos utilizando dosis reducida de vacuna, ha sido comprobada por medio de desafíos con cepas de Brucella de alta patogenicidad y comprobación posterior de los índices de desarrollo de la bacteria en diferentes órganos, además de la presencia de abortos (Crawford y col. 1988). Son muy escasas las experiencias dirigidas a evaluar estos esquemas de vacunación en condiciones de campo y con diseños que permitan fehacientemente comprobar la bondad del método (Viana y col. 1986).
En los países en desarrollo donde existe imposibilidad de pagar indemnizaciones por la eliminación de bovinos reactores a brucelosis, se presentan con frecuencia rebaños lecheros que muestran elevadas prevalencias de la enfermedad, las que llegan en muchos casos a tasas superiores de 20%. Estas prevalencias aparecen aun cuando se cumplan estrictamente las normas de vacunación tradicional.
Proteger a los bovinos adultos, aún no infectados de brucelosis, en los predios o áreas con alta prevalencia de la infección, constituye el objetivo principal de este estudio. Con este fin se aplicará un esquema de revacunación con dosis reducida de Cepa 19, el que será evaluado a través del tiempo.
Financiado por proyecto 0439-88 FONDECYT. |
La experiencia se realizó en 5 predios lecheros ubicados en el centro y centro-sur del país, caracterizados por poseer una prevalencia histórica de brucelosis superior al 25%. En cada una de estas lecherías se seleccionaron bovinos hembras adultos, de uno o más partos y que habían sido vacunados con Cepa 19 a la edad de 3-8 meses. Además estos bovinos debían ser no reactores a las pruebas de seroaglutinación estándar y rosa de Bengala. Los animales seleccionados fueron separados en cada predio en dos grupos y debidamente identificados permanecieron en sus planteles de origen, en forma conjunta y con el manejo usual de cada lechería. Los grupos fueron denominados Tratados y Controles y quedaron constituidos como sigue:
Predio |
Bovinos grupos tratados |
Bovinos grupos controles |
A |
108 |
70 |
B |
78 |
91 |
C |
89 |
28 |
D |
62 |
52 |
E |
61 |
23 |
Total |
398 |
264 |
El tamaño muestral fue calculado por el método de la binomial corregida (Morales y Mancilla, 1989), para la comparación de la prevalencia entre dos grupos independientes, considerando un alfa de 5% y una probabilidad de detectar diferencias de un 90%. Este tamaño se aumentó adecuadamente considerando a aquellos animales que, por diversos motivos, abandonarían sus predios.
Los bovinos de los grupos tratados fueron revacunados con Brucella abortus Cepa 19, en dosis de 4,5 x 108 UFC*, aplicada por vía conjuntival. Los bovinos de los grupos controles de cada predio no recibieron esta revacunación.
Se obtuvo muestra de sangre de los bovinos de los grupos tratados el día 0 (previo al día de la revacunación, para comprobar que no eran reactores) y los días 45, 90, 180, 360, 540 y 720 posteriores a la revacunación. En las mismas oportunidades citadas, se obtuvo muestras de sangre de los bovinos de los grupos controles.
Todos los sueros obtenidos fueron sometidos a las pruebas de seroaglutinación estándar (SAE), a través de la técnica en placa y a la prueba de rosa de Bengala (RB), realizándose ambas de acuerdo a técnicas recomendadas por Alton y col. (1975). En la prueba de SAE se utilizó un antígeno normalizado al patrón de CEPANZO, OMS/PS.** y en la prueba de RB un antígeno comercial (Bengatest. Rhodia Merieux, Francia).
Aquellas muestras que resultaron con un título de 100 o mayor a la prueba de SAE, o eran reactoras a la prueba de RB, o a ambas, fueron sometidas a la prueba de inmunodifusión doble (ID), según la técnica recomendada por Pinochet y col. (1990), utilizando un antígeno preparado y normalizado por los mismos autores. Esta prueba se realizó con el fin de descartar las respuestas serológicas debidas a la vacunación. A título complementario se usó también esta prueba con los sueros de los grupos controles, que eran reactores a SAE y/o RB, con el fin de confirmar que estos resultados obedecían a la infección natural que se esperaba ocurriese en cada predio.
Los resultados de las diferentes pruebas, correspondientes a las muestras obtenidas en todas las oportunidades, fueron analizadas estadísticamente.
__________
Notas
* | Unidades formadoras de colonias. volver |
** | Centro Panamericano de Zoonosis. Organización Mundial de la Salud. Oficina Panamericana de la Salud. Buenos Aires. República Argentina. volver |
En los cuadros 1 y 2 se presenta el número de reactores a las pruebas de SAE y RB de los grupos de bovinos tratados y controles, en los diferentes días post-revacunación o post-inicio de la experiencia, respectivamente. Se aprecian diferentes significativas (p < 0,05) respecto a SAE entre los grupos, considerando los días 45, 540 y 720 postrevacunación. No sucede lo mismo a los 90, 180 y 360 días. En el grupo tratado, el porcentaje de reactores es variable o se mantiene a través del tiempo, lo que sucede a la inversa en el grupo control donde aumenta gradualmente.
CUADRO 1 BOVINOS DE LOS GRUPOS TRATADOS REACTORES A LAS PRUEBAS DE SEROAGLUTINACIÓN ESTÁNDAR (SAE)Y ROSA DE BENGALA (RB), EN DIFERENTES PERÍODOS POSTREVACUNACIÓN CON CEPA 19 VÍA CONJUNTIVAL EN DOSIS REDUCIDA
Días postrevacunación | N° | SAE | RB | ||
Reactores | % | Reactores | % | ||
0 | 398 | 0 | - | 0 | - |
45 | 398 | 65 | 16,3 | 122 | 30,6 |
90 | 389 | 58 | 14,9 | 52 | 13,4 |
180 | 368 | 52 | 14,1 | 53 | 14,4 |
360 | 364 | 57 | 15,6 | 56 | 15,4 |
540 | 334 | 49 | 14,7 | 39 | 11,7 |
720 | 249 | 47 | 18,9 | 37 | 14,9 |
CUADRO 2 BOVINOS DE LOS GRUPOS CONTROLES, REACTORES A LAS PRUEBAS DE SEROAGLUTINACIÓN ESTÁNDAR (SAE) Y ROSA DE BENGALA (RB), EN DIFERENTES PERÍODOS POSTINICIO DE LA EXPERIENCIA
Días post Inic. Exp.* | N° | SAE | RB | ||
Reactores | % | Reactores | % | ||
0 | 264 | 0 | - | 0 | - |
45 | 264 | 19 | 7,2 | 23 | 8,7 |
90 | 263 | 36 | 13,7 | 28 | 10,6 |
180 | 258 | 45 | 17,4 | 43 | 16,6 |
360 | 248 | 47 | 18,9 | 51 | 20,6 |
540 | 217 | 58 | 26,7 | 51 | 23,5 |
720 | 168 | 63 | 37,5 | 57 | 33,9 |
*Inicio de la experiencia. |
La cantidad de reactores a la prueba de RB en los grupos tratados y controles, en los diferentes días posteriores al inicio de la experiencia, presenta igualmente diferencias significativas (p < 0,05) entre los grupos, si se consideran los días 45, 540 y 720. El porcentaje de reactores del grupo tratado decrece intensamente desde el día 45 al 90, pero se mantiene más o menos estable hasta el día 720. En el grupo control el aumento de reactores es gradual.
En el cuadro 3, se presentan los resultados de la prueba de ID, que detecta a los bovinos que presuntamente se infectaron naturalmente en los predios, descartando a los reactores postvacunales y se verifican diferencias significativas entre el grupo tratado y control a partir del muestreo del día 90 (p < 0,05). Los porcentajes de reactores a esta prueba indican que para ambos grupos la cantidad más alta de 'presumiblemente' infectados se presenta en los muestreos de los días 360 y 540 post-inicio de la experiencia. En el gráfico 1 se representan los porcentajes acumulados de reactores a ID en las diferentes etapas del estudio y al comparar éstos en el día 720, con el número inicial de bovinos de cada grupo, se obtiene que en los tratados un 4,8% se hizo presumiblemente infectado, mientras en los controles el 23,8% cumplió con esta condición.
CUADRO 3 BOVINOS DE LOS GRUPOS TRATADOS Y CONTROLES REACTORESA LA PRUEBA DE INMUNODIFUSIÓN (PRESUMIBLEMENTE INFECTADOS), EN LOS DIFERENTES PERÍODOSDE LA EXPERIENCIAGrupos | Días** | ||||||
45 | 90 | 180 | 360 | 540 | 720 | ||
Tratados | N° | 398 | 389 | 368 | 364 | 334 | 249 |
ID+* |
1 | 2 | 2 | 7 | 5 | 2 | |
% |
0,2 | 0,5 | 0,5 | 1,9 | 1,5 | 0,8 | |
Controles |
N° |
264 | 263 | 258 | 248 | 217 | 168 |
ID+* |
1 | 8 | 10 | 19 | 16 | 9 | |
% |
0,4 | 3 | 3,9 | 7,7 | 7,4 | 5,3 | |
*Reactores a la prueba de inmunodifusión doble **Días post-revacunación, o post-inicio de la experiencia. |
Gráfico 1. Porcentajes acumulados de bovinos reactores a la prueba de inmunodifusión doble, en los grupos tratados y controles y en diferentes períodos de la experiencia. |
Los reactores no infectados, pero persistentes a las pruebas de SAE y/o RB que aparecieron luego de la revacunación con Cepa 19 en dosis reducida se presentan en el cuadro 4. Observando los porcentajes de reactores en las diferentes etapas del estudio, se comprueba que a los 45 días después de la revacunación la persistencia es alta (33,1%) que decrece hasta los 360 días y se mantiene estable hasta el término de la experiencia. A los 720 días post-revacunación un 13,6% de los bovinos persiste como reactor.
CUADRO 4 BOVINOS REACTORES PERSISTENTES A LAS PRUEBAS DE SERO-AGLUTINACIÓN ESTÁNDAR, ROSA DE BENGALA O A AMBAS,DIFERENTES DÍAS POST REVACUNACIÓN CON CEPA EN DOSIS REDUCIDA Y VÍA CONJUNTIVALDías post Revacunac. | 45 | 90 | 180 | 360 | 540 | 720 |
N° | 398 | 389 | 368 | 364 | 334 | 249 |
Reactores | 132 | 74 | 63 | 54 | 48 | 34 |
% | 33,2 | 19,0 | 17,1 | 14,8 | 14,4 | 13,6 |
A nivel predial (cuadro 5), se observa que los porcentajes de reactores a ID (bovinos presumiblemente infectados) del grupo control, alcanzan una incidencia de acuerdo con la esperada (25% o más), que era la existente en los predios pertinentes.
CUADRO 5 DISTRIBUCIÓN PREDIAL DE BOVINOS REACTORESA LA PRUEBA DE INMUNODIFUSIÓN DOBLE(PRESUMIBLEMENTE INFECTADOS) PERTENECIENTES A LOS GRUPOS TRATADOS Y CONTROLES, DIAGNOSTICADOS DURANTE LA EXPERIENCIA
Predio | Grupos Tratados | Grupo Controles | ||||
N° | ID+* | % | N° | ID+* | % | |
A | 108 | 3 | 2,8 | 70 | 22 | 31,4 |
B | 78 | 1 | 1,3 | 91 | 9 | 9,9 |
C | 89 | 6 | 6,7 | 28 | 7 | 25,0 |
D | 62 | 6 | 9,7 | 52 | 19 | 36,5 |
E | 61 | 3 | 4,9 | 23 | 6 | 26,0 |
Total | 398 | 19 | 4,8 | 264 | 63 | 23,9 |
*Reactores a la prueba de inmunodifusión doble. |
El predio B es la excepción, donde el porcentaje de reactores fue ostensiblemente más bajo. Los grupos de bovinos revacunados presentan también porcentajes variables de reactores, pero éstos son marcadamente más bajos que aquellos de los bovinos de los grupos controles.
La imposibilidad práctica de realizar desafíos experimentales con Brucella en nuestro país, así como la dificultad de contar con agricultores dispuestos a eliminar un alto número de bovinos de sus predios sin obtener indemnización, obligó a utilizar en este estudio de protección postvacunal, el desafío natural por Brucella que se produce en los predios lecheros que mantienen una alta prevalencia de la enfermedad. El utilizar grupos de bovinos revacunados y sus respectivos controles dentro de un mismo predio, mantenidos en iguales condiciones de manejo y principalmente sometidos a una misma carga de infección del medio, tuvo a su favor el obtener resultados de cada grupo perfectamente comparables. La prevalencia histórica de los predios (sobre un 25% de reactores a brucelosis) aseguró contar con una carga adecuada del agente. En los grupos controles de cada predio, se infectó (diagnosticado serológicamente), un porcentaje similar o mayor al citado, esto en un período de dos años. Sólo un predio, el B, presentó en su grupo control una prevalencia de 9,9% de reactores a ID (cuadro 5). La modalidad de usar el desafío natural, en predios de alta prevalencia de brucelosis se estimó al término de la experiencia como muy satisfactoria.
Las hembras bovinas seleccionadas para este estudio eran en general de primer parto, SAE y RB no reactores y aunque vacunadas tradicionalmente con Cepa 19 cuando terneras se entendían como susceptibles a adquirir la brucelosis, lo que fue demostrado serológicamente en los grupos controles.
La eliminación de bovinos que se produjo durante el desarrollo del estudio, no sobrepasó los niveles esperados, ya que no alcanzó a un 40% en los dos años. Esta eliminación obedeció siempre a factores totalmente ajenos a brucelosis, por lo que no alteró los objetivos del estudio.
La dosis de 4,5 x 108 UFC, utilizada en la revacunación, fue similar a la recomendada por Alton y col. (1980), pero usada en aplicación conjuntival. Se eligió esta dosis, pues Pinochet y col. (1986) usando 5 x 109 UFC como dosis, habían obtenido un porcentaje alto de reactores persistentes (14%), aun a los 8 meses después de la revacunación. Los resultados de esta experiencia indican, sin embargo, que el número de reactores persistentes después de la revacunación fue muy similar, a pesar de la dosis menor de vacuna utilizada. La proporción de reactores persistentes obtenida fue superior a la lograda por otros autores (Plommet, 1976; Beckett y Me Diarmid, 1987), aunque estos autores se refieren principalmente a bovinos que no recibieron la vacunación tradicional cuando terneras.
Los resultados de las pruebas de SAE y RB (cuadro 1) fueron los esperados; en ellos se aprecia un elevado número de reactores a los 45 días postrevacunación, cantidad que fue decreciendo paulatinamente para luego mantenerse con pocas modificaciones hacia el final del estudio. La prueba de RB fue la más sensible frente a estas respuestas postrevacunación, si se le compara con la prueba de SAE, sin embargo, ya a los 90 días de la experiencia, los porcentajes de reactores se hicieron similares para las dos pruebas.
Los bovinos del grupo control muestran un progresivo aumento de los reactores a ambas pruebas y a través del tiempo (cuadro 2) lo que sin duda representa la situación normal que sucede en cada predio, en los animales tradicionalmente vacunados cuando terneras. Esto también corrobora que la Cepa 19 aplicada a esa edad, no protege adecuadamente en áreas o predios de gran exposición o alta prevalencia de brucelosis, o bien no lo hace más allá de los tres años. Esta situación ya ha sido considerada por Flores-Castro y col. (1985).
La prueba de ID, se utilizó para descartar las respuestas postvacunales a las pruebas de SAE y RB, ya que esta prueba con una alta sensibilidad y especificidad sólo pesquisa a los reactores naturalmente infectados. Como no se realizó comprobación bacteriológica de infección, se ha usado el término 'presumiblemente infectado', para denominar a los bovinos reactores a ID.
La prueba de ID presenta una sensibilidad y especificidad con rangos que van del 94 al 100% respectivamente (Lord y col., 1989; Pinochet y col., 1989).
Basados en el comportamiento de la prueba de ID, los resultados de esta experiencia aparecen como altamente favorables; la comparación de los porcentajes acumulados a lo largo del estudio (gráfico 1) es concluyente. El porcentaje de reactores presumiblemente infectados es extraordinariamente mayor en el grupo control.
La mayor proporción de nuevos casos de reactores en el grupo control se produce a los 360 y 540 días de la experiencia, lo que podría también indicar que la protección dada por la vacunación tradicional con Cepa 19 no dura en áreas de alta prevalencia, más de tres años, como ya se citó anteriormente.
A nivel predial (cuadro 5), se advierte que la revacunación aplicada a los bovinos de los grupos tratados, produce un efecto protectivo mayor en los predios donde hubo menor porcentaje de reactores en el grupo control correspondiente, lo que también indica que hubo una menor carga de agentes en el medio. Inversamente las lecherías que muestran una mayor prevalencia en sus grupos controles también presentan un mayor número de bovinos evacunados, donde la vacunación experimental no protegió adecuadamente. A pesar de ello, siempre la prevalencia en los grupos revacunados es extraordinariamente menor (predios D, C y E especialmente).
La vacunación de bovinos adultos con Cepa 19 a dosis reducida no produce mayores problemas en los predios con alta prevalencia de brucelosis. Diversos autores han demostrado que estos esquemas de vacunación no producen abortos y que la persistencia de bovinos portadores a nivel mamario de Cepa 19 es escasa y sin mayores consecuencias (Plommet y Fensterbank, 1976; Alton y col., 1980; Pinochet y col., 1986).
Se puede concluir que el esquema de vacunación usado en el presente trabajo, no siendo óptimo, permitiría rebajar en un porcentaje bastante conveniente las prevalencias de brucelosis en los bovinos de predios o áreas altamente afectadas, para posteriormente poder iniciar con esquemas tradicionales y eliminación de reactores el programa de control respectivo.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a la Dra. Nancy Poquet y a los Drs. Enrique Bidirinis y Alfonso Campos su participación en el desarrollo de este estudio.
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Recibido el 16 de mayo de 1991, aprobado el 26 de agosto de 1991. |