Abstract

Bovine leukemia virus (BL VJ was detected in cattle by the syncytia infectivity assay (SIA), using blood lymphocytes and fetal lamb kidney (FLK) cells as indicator system. The cells with 4 o more nucleus were counted as syncytial cells. The syncytia inducing activity of BLV was inhibited by BL V precipitating antibody positive sera, but it was not inhibited by BLV negative serum. The presence of BLV antigens in the syncytia was determined by indirect immunofluorescent test, using BLV - reference serum obtained from two cocas with BLV - precipitating antibody and comercial serum. The results indícate that the syncytias observed using FLK are specific for BL V.

[Contenido]

La leucosis enzoótica bovina (LEB) es una enfer­medad infecciosa en cuya etiología participa el virus de la leucosis bovina (VLB), un retrovirus oncogénico tipo ARN, exógeno para la especie (Ferrer, 1980) que infecta a los linfocitos B y se encuentra relacionado con los virus HTLV I y II humanos (Oroszlan y Cols., 1982).

En Chile, los primeros antecedentes clínicos de la LEB datan de la década de los sesenta (Schulz y Cols., 1962); posteriormente, se realizaron estudios orientados a diagnosticar la infección con el VLB empleando claves hematológicas (Cripe y Cols., 1971; Rudolph y Cols., 1972) o bien estudios  serológicos por inmunodifusión (Villouta y Cols., 1984b) con reactivos comerciales extranjeros; sin embargo, a la fecha no ha sido demostrada la presencia del virus.

La validez de un método de diagnóstico seroló­gico se establece demostrando que una reacción positiva equivale a la presencia del VLB en el animal (Burny y Cols., 1978). En este sentido son varias las técnicas que se han desarrollado con el objeto de detectar directamente el VLB (Ferrer y Diglio, 1976; Bouillant y Cols., 1981; Esteban y Cols., 1985). De éstas, la inducción de sincicios ha resultado ser un sistema más sensible que la microscopía electrónica, y permite detectar al VLB en fluidos y linfocitos (Ferrer y Cols., 1977).

Los cultivos celulares donde el VLB es capaz de inducir policariocitosis (sincicios) son de variado origen (Itóhara y Takatori, 1982). Las células transformadas (Van der Maaten y Miller, 1980) que se utilizan en la actualidad en algunos países no son de fácil obtención, por lo que cada nación debe tender a adaptar el tipo de metodologías requeridas, de acuerdo a su realidad. En base a lo anterior es que en este trabajo se planteó confir­mar la presencia del VLB en animales serológica­mente positivos a la infección, a través de la prueba de inducción de sincicios en cultivos primarios de riñón fetal ovino (RFO).

Para ello, se obtuvo linfocitos sanguíneos de dos bovinos Holstein-Friesian positivos y dos negativos a la infección con el VLB, diagnosticada por inmunodifusión (ID)1. Estos animales pertene­cían a un predio de la Región Metropolitana donde por más de 10 años se ha estudiado la infección con el VLB. Las vacas eran negativas a la infección con los virus rinotraqueítis infecciosa bovina y parainfluenza-3, de acuerdo a las técnicas diagnós­ticas descritas por Berríos y Cols. (1985a,b).

Los linfocitos de estos animales se obtuvieron y aislaron de acuerdo a lo descrito por Villouta y Cols. (1984a). Estos se inocularon y cocultivaron con monoestratos  celulares de RFO entre el segundo y cuarto pasaje, según la metodología descrita por Van der Maaten y Cols. (1974); Diglio y Ferrer (1976) e Itohara y Takatori (1982). Las pruebas se realizaron en duplicado en tubos Leighton, con cubreobjetos (22 x 10,5 mm), los cuales al cabo del 7º día de cultivo fueron retirados, secados y fijados con metanol para ser teñidos con Giemsa, según lo detallado por Ferrer y Cols. (1977).

La presencia del VLB en los linfocitos se evidenció por la capacidad del virus de inducir sincicios en los cultivos de RFO inoculados con linfocitos de las vacas positivas a la infección (Figura 1, b-c). Se consideró como sincicio toda célula que presentara cuatro o más núcleos. Se observó, además, que la capacidad de inducir sincicios estaba relacionada con la concentración de linfocitos inoculados y con el pasaje del cultivo inoculado. No se observó sincicio en los cultivos de RFO inoculados con linfocitos de las vacas negati­vas a la infección con el VLB.

 A)

 B)

C)

Figura 1 a) Cultivo de RFO inoculado con linfocitos de vaca, LEB (-). x 40. b) Sincicios típicos inducidos por linfocitos de vaca, LEB (+). x 40. c) Dos sincicios con un número de núcleos diferentes, cultivo inoculado con linfocitos de vaca (+). x 400.

La especificidad de la inducción de sincicios por el VLB se estableció por la prueba de inhibición de sincicios (Ferrer y Cols., 1977), en la cual los linfocitos infectados con el VLB fueron incubados con sueros anti VLB obtenidos de las vacas infectadas y suero positivo de referencia de reacti­vos comerciales[1>], los cuales fueron filtrados e inactivados (560C), previo a su inoculación al monoestrato. Los sueros de las vacas negativas no inhibieron la capacidad de inducir sincicios de los linfocitos de las vacas infectadas.

Se realizó además la prueba de inmunofluores­cencia indirecta, utilizando cubreobjetos de culti­vos inoculados con linfocitos infectados o no con el VLB. Estos cubreobjetos se fijaron con acetona y se incubaron con sueros positivos y negativos, y un conjugado anti IgG bovino unido a fluoresceí­na[2>] (Ferrer y Cols., 1975). Se visualizó fluorescen­cia sólo en los cultivos inoculados con linfocitos de la vaca que poseían sincicios y que se habían incubado con sueros de las vacas infectadas o con suero positivo de referencia[1>].

En base a los resultados obtenidos se demuestra la presencia del VLB en el país, encontrándose en etapa de desarrollo la estandarización de la técnica de inducción de sincicios.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Srta. Paula Segovia C. la valiosa colaboración prestada en el desarrollo de este trabajo.

Referencias

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Recibido en noviembre de 1987, aprobado en marzo de 1988.

 

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1 IFFA-MERIEUX, Lyon, Francia.
2 Sigma Chemical Co. Ltd. St. Louis, USA. 

  Trabajo financiado por Proyecto A-2424-8722, DTI. Universidad de Chile.   Parte de este trabajo corresponde a la tesis de grado para optar al título de Médico Veteri­nario.