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La flora bacteriana intestinal normal de aves (FBINA), es una compleja y. dinámica población de microorganismos. En condiciones de crianza na­tural, esta microflora, según Jayne-Williams y Fu­ller (1971), es adquirida por el pollito desde su ecloción a partir del medio ambiente colonizando el tracto digestivo, especialmente a nivel de ciegos, e impidiendo que microorganismos patógenos puedan multiplicarse a este nivel. Este fenómeno denominado por Lloyd y Cols. (1977) 'Exclusión Competitiva' (EC) fue explicado en un anterior trabajo (Rosende y Juri, 1986).

La oportunidad de que los pollitos, en los mo­dernos sistemas avícolas, se contaminen temprana­mente con esta FBINA es escasa. Las prácticas de crianza separada por edad y las óptimas condicio­nes de higiene, privan a las aves de adquirir esta mi­croflora y su posterior colonización del tracto in­testinal. Esta carencia, parcial o total, se traduce en una menor resistencia de las aves a infecciones por bacterias enteropatógenas especialmente sal­monelas móviles. La composición de esta micro­flora intestinal aún no ha sido totalmente determi­nada, existiendo divergencias en cuanto a su papel Laboratorio de Patología Aviar. en la EC, Barnes y Cols., 1972, Rigby y Pettit 1979, 1980; fundamentalmente debido a su alta exigencia para multiplicarse 'in vitro' al requerir la mayoría de ellas, estrictas condiciones de anae­robiosis, difíciles de obtener y mantener (Barnes e Impey, 1970).

Por las razones expuestas, es difícil obtener a ni­vel de laboratorio, cultivos puros de FBINA con propiedades de EC, principalmente porque en este proceso interactúan diferentes microorganismos. Se están estudiando diferentes fuentes de excreción fecal con la finalidad de colonizar el tracto diges­tivo de pollos recién nacidos (Salanitro y Cols., 1973). El presente trabajo pretende determinar si un extracto de cama de gallinas es una fuente adecuada, práctica e inocua de FBINA.

Material y Método

Material

Flora Bacteriana Intestinal Normal de Aves: Se ob­tuvo a partir de la cama de un corral de gallinas re­productoras broiler, de 36 semanas de edad, libres de salmonelas.

Aves en Experiencia: Se utilizaron 140 machos Leghorn de un día de edad, obtenidos en un criade­ro comercial, libres de salmonelas de acuerdo a an­tecedentes basados en el examen serológico, perió­dico, del grupo de gallinas reproductoras y al cul­tivo bacteriológico de 20 pollitos de este grupo experimental. Las aves recibieron alimento de crianza, exento de proteína de origen animal y ,agua potable. Se mantuvieron en dos criaderos de cinco pisos cada una (Petersime Modelo 255D) ubicados en una dependencia aislada de la Facul­tad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Uni­versidad de Chile.

Medios de cultivo: Para la detección de salmo­nelas de origen aviar, se utilizaron los medios de cultivo descritos por Williams y Cols. (1980).

Cepa Salmonella typhimurium: Aislada en el Laboratorio de Patología Aviar de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile y serotipificada en el Instituto de Salud Pública.

Métodos

Controles: Controles bacteriológicos para descartar presencia de salmonelas ajenas a la experiencia, en pollitos, cama de reproductoras y alimento, se rea­lizaron según el método descrito por Williams y Cols. (1980).

a) Pollitos: Se sacrificaron 20 pollitos al día de edad, y se tomaron muestras de ciego, hígado, vitelo, corazón y bazo.

b) Cama de reproductoras: Se siguió la pauta recomendada por Williams y Cols. (1980). Se deter­minó cinco puntos de recolección en el corral de las reproductoras; de cada lugar se tomaron cinco porciones de aproximadamente 10 g para consti­tuir una muestra final de 50 g. La muestra fue re­colectada desde áreas secas superficiales, alejadas de los comederos y bebederos, y se almacenó en bolsas plásticas.

c) Alimento: Se controló cada saco usado en la experiencia, tomándose tres muestras de 30 g cada una por saco de alimento.

Preparación del Extracto de Cama de Gallinas Reproductoras (ECGR): Una vez descartada la con­taminación por salmonelas, se recolectaron 20 g de cama, extraída desde la parte profunda. La muestra fue transportada en frascos de vidrio es­tériles herméticamente cerrados. El tiempo entre la recolección y su procesamiento fue aproximada­mente de 12 horas. Los 20 g de cama se mezclaron con 200 ml de suero fisiológico, previamente so­metido a ebullición por 20 minutos. Esta mezcla fue homogenizada en licuadora por 1 minuto bajo el flujo continuo de nitrógeno, con el fin de crear y mantener el ambiente de anaerobiosis. El extrac­to fue filtrado por gasa, obteniéndose lo que cons­tituyó el ECGR usado como pretratamiento.

Diseño Experimental: Con la finalidad de com­probar la capacidad de exclusión competitiva del ECGR y su inocuidad, las aves experimentales se dividieron en cuatro grupos de 30 aves cada uno, ubicándose en dos grupos por baterías (A y B) dis­puestos en lotes de 15 en cada piso para facilitar su manejo y ulteriores controles bacteriológicos. El pretratamiento consistió en la administración de 1,0 ml/ave de ECGR directamente en la ingluvia. El desafío consistió en la administración directa­mente en la ingluvia de 105 células de S. typhimu­rium por ave.

En la batería A, se ubicaron los siguientes gru­pos

Grupo 1 (G1): Testigo. Sin pretratamiento ni de­safío, a fin de comprobar la ausencia de patologías ajenas a la estudiada y excluir infecciones laterales no deseables por S. typhimurium.

Grupo 2 (G2): Pretratados al día de edad con el fin de controlar inocuidad del ECGR.

En la batería B, se distribuyeron los siguientes grupos:

Grupo 3 (G3): Control de la cepa de S. typhimu­rium, desafiados al tercer día de edad. Este grupo se empleó para comprobar la infecciosidad o pato­genicidad de la cepa de desafío y la eficiencia de los métodos bacteriológicos utilizados en la detec­ción de la excreción fecal de salmonelas por las aves.

Grupo 4 (G4): Experimental. Pretratadas al día de edad y posteriormente desafiadas al tercer día de edad. Su objetivo fue evidenciar la capacidad de exclusión competitiva del extracto de cama de ga­llinas reproductoras.  

Controles efectuados a los diferentes grupos: Se efectuaron seis controles bacteriológicos, los cua­tro primeros con un intervalo de 3 días y los dos últimos semanalmente. Los controles comenzaron al tercer día post desafío, ya que según Lloyd y Cumming (197), los pollos desafiados excretan el inóculo durante los primeros días del ensayo antes que se logre su colonización o excreción total.

Las muestras recolectadas fueron: tórulas cloa­cales al 100% de las aves y 10 g de fecas de cada grupo, tomando aproximadamente 1 g de cinco áreas distintas de las bandejas receptoras de fecas, en los dos pisos de las baterías que alojaban a cada grupo. Doce horas, antes del muestreo, las bandejas receptoras de fecas se limpiaban a fin de obtener material fresco y lo menos posible contaminado con flora ambiental.

Se realizó, como una medida complementaria de detectar posibles efectos observados en los dife­rentes tratamientos empleados, control de peso de las aves. Se hicieron cinco controles, comenzando al día de edad y cada semana, hasta los 28 días de edad. Los pesos corporales de los cuatro grupos, se expresaron en términos de promedio de peso de cada grupo.

Análisis estadístico: Los resultados del aisla­miento de S. typhimurium a partir de tórulas cloa­cales, se sometieron a una prueba de hipótesis de independencia de chi cuadrado (x2 ) con p > 0,01. Se comprobaron los resultados de los grupos 3 y 4. Los resultados de las diferencias de peso vivo pro­medio de los grupos controles y experimentales se sometieron a un análisis de covarianza y su corres­pondiente prueba de hipótesis F, con p > 0,01 (Calzada, 1964).

Resultado

Las muestras colectadas previo a la experiencia (vísceras de los pollitos, extracto de cama y ali­mento) resultaron negativas al aislamiento de sal­monelas. En el cuadro 1 se resumen los resultados obtenidos del examen bacteriológico de las tórulas cloacales (TC) y fecas (F) frescas. En él se obser­va que los grupos 1 y 2 se mantuvieron libres de S. typhimurium durante toda la experiencia, en cam­bio, en los grupos 3 y 4 fue posible aislar S. typhi­murium de las fecas y tórulas cloacales de ambos grupos.

CUADRO 1 AISLAMIENTO DE S. TYPHIMURIUM DE TORULAS CLOACALES Y FECAS DE POLLOS PRETRATADOS Y NO PRETRATADOS CON EXTRACTO DE CAMA DE GALLINAS  REPRODUCTORAS  CON O SIN DESAFIO CON S. TYPHIMURIUM

Edad

G1

G2

G3

G4

(días)

TC

F

TC

F

TC

F

TC

F

6

 0/30*

-

   0/29**

-

29/30

+

2/29

-

9

0/30

-

0/29

-

29/30

+

2/29

+

12

0/30

-

0/29

-

29/30

+

6/29

+

15

0/30

-

0/29

-

29/30

+

5/29

+

22

0/30

-

0/29

-

29/30

+

5/29

+

30

0/30

-

0/29

-

24/30

+

4/29

+

TOTAL

0/180

-

0/174

-

169/180

-

24/174

--- -

*    N° aislamientos positivos a salmonela / N° cultivos bacteriológicos realizados. **   Muere un pollo al día de edad por infección saco vitelino. G1 Testigos sin pretratamiento y desafío. G2 Pretratadas al día de edad sin desafío. G3 Sin pretratamiento y desafiado al 3er día de edad. G4 Pretratadas al día de edad y desafiadas con S. typhimurium al tercer día de edad.

La presencia de salmonelas en las tórulas cloaca­les de las aves del grupo 4 fue considerablemente menor que el grupo control no pretratadas (G3). En el grupo 4, 24 controles bacteriológicos de tórulas cloacales de un total de 174 (13,79%) fue-ron positivas; en cambio en el grupo 3, de un total de 180 cultivos, 169 (93,8%) resultaron positivos. En el grupo experimental 4, en los dos primeros controles, hubo sólo dos aves positivas de 29 con­troles, aumentando la positividad en los sucesivos controles. En cuanto a los controles bacteriológi­cos del 'pool' de fecas, éstos resultaron positivos en los grupos 3 y 4, salvo en el primer control de -este último grupo.

El análisis estadístico de los resultados del exa­men bacteriológico de las tórulas cloacales de los grupos desafiados 3 y 4, para p < 0,01, demostró que existe una significativa relación entre la pre­sencia de ECGR y la resistencia de las aves a la in­fección con S. typhimurium.

En el cuadro 2 se resumen los promedios de los pesos corporales de las aves de cada grupo. Del aná­lisis estadístico se comprueba que las diferencias en los pesos promedios, no son significativos.

CUADRO 2 Pesos promedios de pollitos vivos en diferentes edades de los grupos con o sin pretratamiento con ECGR y con o sin desafío por S. typhimurium. volver

PESO VIVO PROMEDIO (g)

EDAD (días)

G1

G2

G3

G4

1

36,30

36,48

36,10

36,19

7

62,46

64,00

60,95

62,06

14

116,73

113,13

113,06

118,50

21

168,35

170,81

164,65

170,43

28

225,70

237,03

230,40

244,20

Las diferencias entre los pesos vivos promedios de los cuatro grupos de aves, no son significativos desde el punto de vista estadístico. El estudio se hizo por el Análisis de Covarianza y con pruebas de hipótesis F, con p 0,01. F calculado =0,3069; F tabular = 5,42 para el mismo nivel de significación.

Discusión

Este estudio, como otros realizados en esta línea, confirman que la flora bacteriana intestinal normal de aves, confiere una significativa protección contra la subsiguiente infección por salmonelas.

Durante el ensayo, la incidencia de infección por S. typhimurium medida a través de exámenes bacteriológicos de tórulas cloacales en el grupo ex­perimental (G4), fue considerablemente menor que en el grupo control (G3); en este último grupo, se observó un gran número de aves infectadas por S. typhimurium, en contraste al grupo experimen­tal, que en los primeros controles sólo presentó dos aves positivas, aumentando levemente en los sucesivos controles. Estos resultados no son tan concluyentes como los logrados con flora bacteria­na normal de ciegos (Rosende y Yuri, 1986), lo que se debe, probablemente, a que la fuente de FBINA de aves es de menor calidad que el conteni­do del ciego, en donde se encuentra la mayor con­centración de microorganismos con capacidad de E C (Hunhtanen y Pensack, 1965).

Los resultados de las muestras de fecas confir­man que este método es útil como complemento de los cultivos, es así, como en el grupo 3 (contro­les desafiados) todos los controles resultaron posi­tivos y en el grupo 4 (experimental) sólo el primer control bacteriológico fue negativo, probablemen­te por la cantidad de fecas recolectadas que no era suficiente para pesquisar el escaso número de sal­monelas excretadas en este nivel del ensayo.

Los grupos controles 1 y 2, no desafiados, man­tuvieron negativos los controles bacteriológicos tanto de tórulas cloacales, como de fecas, lo cual permite asegurar que no existió contaminación ajena a la conferida por el desafío.

Los controles de peso de las aves nos permiten asumir que el tratamiento con ECGR no tuvo efec­to negativo que se manifieste a través de diferen­cias de peso. Asimismo, se asume que la patogeni­cidad de la cepa de S. typhimurium es baja, aun­que es adecuadamente infectante. Las diferencias que aparentemente existen entre los pesos vivos promedios de los cuatro grupos no son, desde el punto de vista estadístico, significativas (cuadro 2).

A través de los resultados obtenidos, se pudo comprobar que el ECGR constituye una fuente adecuada de FBINA capaz de colonizar el tracto digestivo de pollitos de un día de edad.

Finalmente, aunque los resultados de esta ex periencia indican que la administración de ECGF empleada como fuente de FBINA, constituye un método efectivo y práctico, su uso, en forma rutinaria requiere de adecuados controles microbiológicos que detecten la presencia de agentes patóge nos no deseables. Por otra parte, el margen de si aplicación con fines preventivos demuestra la necesidad de exponer, en las etapas iniciales de si crianza, a las aves al contacto con una cama que le permita colonizar su tracto digestivo, aproximando de esta forma el manejo a lo que ocurre en condiciones naturales.

Referencias

BARNES, E.M., C S. IMPEY. The isolation and properties of the predominant anaerobic bacteria in the caeca of chickens and turkeys. Br. Poult. Sci. 11: 467-481, 1970.

BARNES, E.M., G.C. MEAD, D.A. BARNUN. The intes­tinal flora of the chicken in the period 2 to 6 weeks of age, with particular reference to the anaerobic bacte­ria. Br. Poult. Sci. 13: 311-326, 1972.

CALZADA, B.J. Métodos estadísticos para la investiga­ción. 2 ed. Lima, 1964. p. 366 - 368.

HUHTANEN, C.N., J.M. PENSACK. The development of the intestinal flora of the young chick. Poult. Sci. 44: 825-830, 1965.

JAYNE-WILLIAMS, D.J., R. FULLER. The influence of the intestinal microflora on nutrition. In: Bell, D.J., and B.M., Freeman, eds. 'Physiology and Biochemis­try of the domestic fowP'. London, Academic Press, 1971. v. 1; pp. 73 - 91.

LLOYD, A.B., R.B. CUMMING, R.D. KENT. Prevention of Salmonella typhimurium infection in poultry by pretreatment of chickens and poult with intestinal extracts. Aust. Vet. J. 53: 82 - 87, 1977.

RIGBY, C.E., J.R. PETTIT. Some factors affecting Sal­monella typhimurium infections and shedding in chic­kens raired on litter. Avian Dis. 23: 442-455, 1979.

RIGBY, C.E., J.R. PETTIT. Observation on competitive exclusion for preventing Salmonella typhimurium in­fection of broiler chickens. Avian Dis. 24: 604-615, 1980.

ROSENDE, S., M.A. JURI. Exclusión competitiva de Sal­monella typhimurium en pollitos de un día de edad por la flora bacteriana normal del ciego de aves adul­tas. Avances en Ciencias Veterinarias 1: 26-29, 1986.

SALANITRO, J.P., J.G. FAIRCHILD, P.A. MUIRHEAD. Intestinal microflora of broiler chicken. In: Proceeding of 22nd Western Poultry Disease Conference and 7th Poultry Health Symposium. Davis, California, Ed. Agr. Extension. University of California, 1973. pp. 86-90.

WILLIAMS, J.E.; E.T. MALLISON, G.H. SNOEYENBOS. Samonellosis and Arizoonosis. In: Hitchner, S.B., et al, eds. Isolation and Identification of Avian Pathogens. Texas, American Association of Avian Pathologist, Department of Veterinary Microbiology, 1980. pp. 14­33.

Recibido noviembre 1987, aprobado diciembre 1987.