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  • Contribución a la caracterización del proceso degenerativo en el cartílago articular equino

Resumen

La enfermedad degenerativa articular reviste importancia en la especie equina, pues afecta principalmente a las articulaciones sometidas a un trauma frecuente y puede llegar a ser invalidante. Esta patología se ha caracterizado como un proceso degenerativo de la matriz extracelular especialmente del cartílago articular. El colágeno y los proteoglicanos con sus glicosaminoglicanos (GAGs), son las moléculas de la matriz que contribuyen a la resistencia del cartílago.

Se utilizaron articulaciones metacarpo-falángicas de equinos de matadero, las que se clasificaron como normales o patológicas, según las características macroscópicas del cartílago. En las muestras de cartílago se cuantificaron los GAGs y se caracterizaron las proteínas extraídas con el fin de establecer su carácter colagenoso.

Los resultados indican que ambos componentes de la matriz extracelular presentan cambios cuantitativos, disminuyendo en la condición patológica lo que está de acuerdo con el proceso degenerativo, especialmente con relación al contenido de condroitín-sulfato y de colágeno.

Palabras claves: Cartílago articular equino.

Abstract

Articular degenerative disease affecting joints exposed to frequent trauma is very important in the horse. This desease has been characterized as an extracellular matriz degenerative process of the articular cartilage. Collagen, proteoglycans and their constituents glycosaminoglycans (GAGs) are the macromolecules contributing to the mechanical properties of cartilage. Metacarpophalangeal joints from slaughtered horses were used. According to their macroscopic features, they were classified as normal or pathological joints. GAGs were extracted and electrophoreticaly analysed. Collageneous proteins were analysed regarding to their extractability. The results show that both, collagen and total GAGs, decrease in pathological joints according with the degenerative process that has been described to occur.

Key words: Articular degenerative disease

Abstract

La enfermedad degenerativa articular reviste importancia en la especie equina, pues afecta principalmente a las articulaciones sometidas a un trauma frecuente y puede llegar a ser invalidante. Esta patología se ha caracterizado como un proceso degenerativo de la matriz extracelular especialmente del cartílago articular. El colágeno y los proteoglicanos con sus glicosaminoglicanos (GAGs), son las moléculas de la matriz que contribuyen a la resistencia del cartílago.

Se utilizaron articulaciones metacarpo-falángicas de equinos de matadero, las que se clasificaron como normales o patológicas, según las características macroscópicas del cartílago. En las muestras de cartílago se cuantificaron los GAGs y se caracterizaron las proteínas extraídas con el fin de establecer su carácter colagenoso.

Los resultados indican que ambos componentes de la matriz extracelular presentan cambios cuantitativos, disminuyendo en la condición patológica lo que está de acuerdo con el proceso degenerativo, especialmente con relación al contenido de condroitín-sulfato y de colágeno.

Palabras claves: Cartílago articular equino.

Abstract

Articular degenerative disease affecting joints exposed to frequent trauma is very important in the horse. This desease has been characterized as an extracellular matriz degenerative process of the articular cartilage. Collagen, proteoglycans and their constituents glycosaminoglycans (GAGs) are the macromolecules contributing to the mechanical properties of cartilage. Metacarpophalangeal joints from slaughtered horses were used. According to their macroscopic features, they were classified as normal or pathological joints. GAGs were extracted and electrophoreticaly analysed. Collageneous proteins were analysed regarding to their extractability. The results show that both, collagen and total GAGs, decrease in pathological joints according with the degenerative process that has been described to occur.

Key words: Articular degenerative disease

Introducción

La osteoartritis o enfermedad degenerativa articular se describe como una enfermedad progresiva, estructural y funcional que causa deterioro del cartílago, acompañado de un intento de reparación de la superficie, que se presenta tanto en humanos como en animales (Alexander, 1985; Brandt y SlowmanKovacs, 1986). Las causas de esta patología pueden ser variadas; actualmente se considera que la más generalizada es el trauma en las articulaciones sometidas a una alta movilidad (Altman, 1990).

La estructura articular está bien adaptada para soportar el peso corporal. Entre los componentes de la articulación, el cartílago es el que permite la adaptación a cambios de presiones y amortigua las fuerzas compresivas a las que está sujeto el tejido (Alexander, 1985; Hamerman, 1989). Dichas funciones se relacionan con las características de las macromoléculas, colágeno y proteoglicanos que en conjunto constituyen la matriz extracelular del cartílago (Alexander, 1985; Treadwell y Mankin, 1986; Hamerman, 1989; Howell, 1990; Caron, 1992).

En el cartílago articular predomina el colágeno tipo 11 y su conformación junto con la presencia de entrelazos son importantes para su función, ya que le confieren una alta fuerza tensil y resistencia al ataque enzimático (Eyre y col., 1984; Nakano y col., 1986). El colágeno, junto con la elastina, son las únicas proteínas que poseen grupos aldehídos en su estructura; como consecuencia de reacciones químicas entre ellos o con grupos amínicos, se forman los entrelazos del colágeno que contribuyen a su función. Los proteoglicanos son los responsables de la elasticidad y resistencia a las fuerzas de compresión del tejido. Esto se debe a que son reversiblemente compresibles dependiendo del moviento de agua y de las interacciones moleculares (Treadwell y Mankin, 1986).

El condroitín sulfato es el glicosaminoglicano (GAG) más abundante en los proteoglicanos constituyentes de la matriz del cartílago (Nakano y col., 1979); se ha observado una asociación entre la erosión o severa degeneración del tejido y la disminución en la cantidad de condroitín sulfato (Hamerman, 1989). Los factores involucrados en la destrucción de la matriz del cartílago son: una degradación enzimática y un deterioro mecánico (Dean y col., 1987; Price y col., 1992).

En los equinos esta patología degenerativa es común como consecuencia de la lesión articular y frecuentemente ellos desarrollan osteoartritis crónica post-trauma (Niebauer y col., 1988; Caron, 1992), especialmente en aquellas articulaciones de alta movilidad que se encuentran sometidas a situacione traumáticas continuas. Cabe destacar la articulación metacarpo falángica y la articulación carpal, las que han sido motivo de estudios anteriores en nuestro medio, orientados hacia el análisis de uno de los componentes de la matriz extracelular: el colágeno (Soto, 1983; Olivares, 1984; Pinto, 1990).

En el presente trabajo se caracteriza la matriz extracelular incorporando el otro componente de ésta, los proteoglicanos y más exactamente los glicosaminogllcanos que forman parte de los primeros. En el cartílago de las articulaciones metacarpo falángicas, caracterizadas como normales u osteoartríticas, se identificaron y determinaron los GAGs, así como el grado de extracción del colágeno, tratando de relacionar estos componentes con la patología articular.

 Financiado por proyecto DTI A-3135.

Materiales y métodos

Se trabajó con cartílago articular obtenido de equinos recién beneficiados en el matadero. Se obtuvo un total de 40 pares de extremidades anteriores, correspondiendo cada par a un mismo animal. De inmediato se disectó la articulación metacarpo falángica clasificándola como normal u osteoartrítica de acuerdo a las características macroscópicas de la superficie articular.

Las articulaciones clasificadas como normales presentaban una superficie lisa de color blanco nacarado brillante (Fig. 1a).

Aquellas articulaciones clasificadas como osteoartríticas fueron subdivididas, según la magnitud de su alteración, en los siguientes grados patológicos:

 (+)

si el cartílago presentaba leve cambio de coloración y mínimas líneas de roce.

(++)

si el cartílago presentaba cambio de coloración junto con líneas de roce manifiestas y pequeños focos de erosión.

(++)

si el cartílago presentaba franco cambio de coloración, líneas de roce muy, manifiestas, grandes focos de erosión y presencia de focos de osteonecrosis (Fig. 1b).

En este trabajo sólo se consideraron aquellas articulaciones clasificadas como normales y las osteoartríticas de grados (++) y (+++). El número total de pares de articulaciones seleccionadas fue de 11 con cartílago normal y 13 con cartílago patológico. De cada par se obtuvieron muestras de tejido de zonas equivalentes de acuerdo con aquella en que es más frecuente observar el daño degenerativo.

Cada muestra fue pesada en el momento de su obtención y mantenida a -70°C hasta el análisis de los componentes de la matriz extracelular.

Figura 1. Epífisis distal del metacarpo de equino.

Extracción de colágeno:

Cada muestra fue dividida en trozos pequeños (2-3 mm2 aprox.) y luego homogeneizada en Ultra-Turrax, por 2 minutos a 4°C, usando en forma consecutiva los solventes: agua, NaCI 0,45M y ácido acético MM, en una relación peso/vol 1:20. En cada uno de los extractos (acuoso, salino y ácido), se determinó por duplicado, el contenido de proteínas (Lowry y col., 1951) y el contenido de grupos aldehídos (Paz y col., 1965; adaptado por Horvath y Tábora, 1972). Ambas son determinaciones color¡métricas y para la obtención de las absorbancias respectivas se usó un espectrofotómetro Shimadzu, U V-120-01.

Para la determinación de proteínas el estándar usado fue una solución 0,1% de colágeno tipo 1 (SIGMA), solubilizado en ácido acético 0,1 M y para la determinación de aldehídos se usó acetaldehído 10-3M como estándar.

Extracción de GAGs:

Para la extracción de GAGs (adaptado de Nakano y col., 1986), el cartílago de cada muestra fue finamente cortado, pesado y dejado en acetona, para deshidratar. Luego se solubilizó por digestión enzimática con papaína (Merck-3.000 USP unit/mg) 0,1 mg/ml de buffer fosfato 0,1M, pH 6,5 que contiene EDTA 2Na 0,005M y cisteína Hcl 0,005M, por 48 hrs a 65°C. Se precipitaron las proteínas con TCA, de modo que la concentración final fuera 10% y se dejó a 4°C por toda la noche. Posteriormente se centrifugó (7.000 x g por 30 min, 0°C) y el sobrenadante se dializó contra agua destilada hervida, por 48 hrs a 4°C, con los cambios respectivos. La separación de los GAGS se logró por el tratamiento con cetilpiridinium. HCl 5% y acetato de sodio 1,8% en etanol 95%, por 24 hrs a temperatura ambiente.

Los GAGS extraídos se solubilizaron en agua destilada a una concentración de 1 % para ser sometidos a identificación por electroforesis usando como soporte tiras de acetato de celulosa de 2,5 x 17 cm (Sepraphore III, Gelman) en presencia de dos diferentes medios conductores. Uno de ellos fue ácido clorhídrico 0,1N en cloruro de potasio 0,005M (Wessler, 1971), con una intensidad de corriente constante de 2 mA por tira durante 5 hrs. El otro medio conductor fue una solución de acetato de bario 0,1M ajustado a pH 5,8 con ácido acético (Wessler, 1968) y una intensidad de corriente constante de 1 mA por tira durante 16 horas.

En ambas condiciones se utilizaron como GAGs estándares, liofilizados de condroitín sulfato (Inst. Ronzoni) y queratán sulfato (Seikagaku Kogyo) disueltos en agua destilada a una concentración de 0,2%. Sobre los soportes de acetato de celulosa se aplicaron mediante una microjeringa (Hamilton Co.) 2 μl de cada GAGs estándar y 2 μl de cada muestra al 1%. Tanto los estándares como las muestras fueron sometidas a tinción con Alcian Blue. Finalmente, las tiras electroforéticas fueron transparentadas y fotografiadas.

La cuantificación de los GAGs se realizó en soluciones al 0,001 % de cada muestra en las que se desarrolló la reacción del carbazol (Bitter y Muir, 1962) que cuantifica el ácido urónico. Para expresar este valor como concentración de GAGs se multiplicó por 2,5 (Breen y col., 1976). Para la curva estándar se utilizó glucuronato de sodio 40 μg/ml La absorbancia a 530 nm fue determinada en un espectrofotómetro Spectronic 20 (Bausch & Lomb).

Resultados

En el cuadro 1 se muestran los resultados de la extracción del componente colágeno del cartílago articular metacarpo falángico del equino, evaluado a través del contenido de proteínas y aldehídos. Se observa que, tanto en el cartílago normal como en el que presenta un proceso degenerativo, las proteínas extraídas y el contenido de aldehídos disminuyen desde el extracto acuoso al ácido.

CUADRO 1 CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS Y ALDEHÍDOS EN LOS EXTRACTOS DE CARTÍLAGO ARTICULAR NORMAL Y OSTEOARTRÍTICO DE EQUINOS (promedio ± D.E.) 

Proteínas (mg/g cartílago*)--------------

Condición

Extracto Acuoso

Extracto Salino

Extracto Ácido

Normal

29,1 ± 4,0

8,0 ± 1,5

1,1 ± 0,7

Patológico

60,7 ± 19,0 p < 0,001

20,4 ± 6,6 p < 0,001

4,8 ± 1,5 p < 0,001

% cambio

108

155

336

  Aldehídos (mg/g cartílago*)

Normal

2,6 ± 0,75

1,1 ± 0,36

0,7 ± 0,35

Patológico

4,2 ± 2,07 p < 0,05

2,3 ± 1,27 p< 0,01

1,7 ± 0,45

p < 0,001

% de cambio

61

109

142

*Peso húmedo Test t-Student. D.E.=desviación estándar.

En todos los extractos provenientes de cartílagos articulares clasificados como osteoartríticos, el contenido promedio de proteínas y de aldehídos es significativamente mayor (p < 01 a p < 0,001)que los valores representativos de la normalidad.Esta diferencia expresada como porcentaje de cambio en el contenido de proteínas en los extractos de de la condición patológica, fluctúa entre 108% y 336% mientras que el porcentaje de cambio en el contenido de aldehídos de los extractos en la misma condición está entre el 61% y 142%, aumentado también desde el extracto acuoso al ácido.

La relación aldehido/proteína, indicativa de característica colagenosa de la proteina,extraída, se muestra en el cuadro 2.Se observa una aumento de esta relación desde el extracto acuoso al ácido, en ambas condiciones, siendo este aumento menor en los extractos provenientes de los cartílagos que presentan el proceso degenerativo.

CUADRO 2 RELACIÓN ENTRE ALDEHÍDOS Y PROTEÍNAS EN LOS EXTRACTOS DE CARTÍLAGO ARTICULAR NORMAL Y OSTEOARTRÍTICO DE EQUINOS

-------------------mg Aldehídos/ g Proteínas

Condición Extracto Acuoso Extracto Salino

Extracto Ácido

Normal 89 130

630

Patológico 69 110

350

En el cuadro 3 se observa que los GAGs extraídos desde el cartílago normal y del osteoartrítico, cuantificados por el contenido de ácido urónico, muestran una disminución significativa (p < 001) en la condición patológica, lo que representa un 38,6% de cambio.

CUADRO 3 CONCENTRACIÓN DE ÁCIDO URÓNICO Y GAGs EN CARTÍLAGO ARTICULAR NORMAL Y OSTEOARTRÍTICO DE EQUINOS (promedio ± D.E.)

Condición

ÁcidoUrónico (mg/g cartílago*)

GAGs (mg/g cartílago*)

Normal

6,19 ± 1,36

15,45 ± 3,42

Patológico

3,80 ± 1,19 p < 0,001

9,49 ± 2,97 p < 0,001

% de cambio

38,6

38,6

*peso húmedo. Test t-student.

En la Figura 2 se muestra el comportamiento electroforético de migración de los GAGs, extraídos del cartílago articular normal y patológico de equinos, sometidos al HCl/KCl como medio conductor, junto a sus respectivos estándares. En todos los casos se observa sólo una mancha coincidente con la de los estándares condroitín sulfato y queratán sulfato. Un comportamiento similar se observa al someter a los GAGs a electroforesis en acetato de bario, sólo que la velocidad de migración es mayor. A pesar de los antecedentes anteriores, en ambos medios conductores se observó una disminución significativa en el diámetro de la mancha en la condición de osteoartritis, así como una notoria disminución de In intencidad del color (cuadro 4)

Figura 2. Migración electroforética de GAGs extraídos de cartílagos normal y patológico

CUADRO 4 ELECTROFORESIS EN HC1/KC1 Y EN ACETATO DE BARIO DE LOS GAGs EXTRAÍDOS DE CARTÍLAGO ARTICULAR NORMAL Y OSTEOARTRÍTICO DE EQUINOS (Promedio ± D.E.)

Condición

HCI/KCI diámetro mancha (cm)

Acetato de Ba diámetro mancha (cm)

Normal

1,60 ± 0,27

2,19 ± 0,32

Patológico

1,15 ± 0,20 p < 0,001

1,96 ± 0,14 p < 0,05

Test t-student.

Discusión

Los resultados presentados y relacionados con los constituyentes de la matriz extracelular del cartílago indican, con respecto al componente colágeno, que las proteínas extraídas con ácido acético tienen un predominio de carácter colagenoso. Este hecho se refleja en un mayor valor numérico de la relación aldehído/proteína en estos extractos comparada con la relación obtenida en los extractos acuosos o salinos (Cuadro 1 y Cuadro 2), cuyas proteínas corresponden en mayor proporción a las del tipo no colagenoso.

La mayor cantidad de proteínas extraídas y su contenido de aldehídos en la condición de osteoartritis (Cuadro 1), indicaría que las proteínas, incluyendo las que tienen grupos aldehídos en su estructura, son más extraíbles en esta situación, reafirmando entre otros, el antecedente de un menor grado de posibilidades de entrelazamiento del colágeno en procesos patológicos. Este hecho se asocia a diferentes patologías del colágeno y ha sido motivo de investigaciones en diversos grupos en los últimos veinte años (Bailey y col., 1974; Gunson, 1979; Eyre y col., 1984; Olivares, 1984; Nakano y col., 1986; etc.). Es así como Olivares (1984), al realizar tinciones de cartílagos normales y osteoartríticos de equinos, con el reactivo para aldehídos MBTH (N metil benzotiazolidon hidrazona), evidenció en la condición patológica una distribución celular atípica, una fragilidad del tejido y una zona de transición cartílago-hueso poco diferenciada. Tanto la fragilidad como las características de tinción diferente del cartílago osteoartrítico, observada por Olivares (1984), se relacionan con un menor contenido de proteína colagenosa, representada por la relación Aldehídos/Proteínas obtenida en este trabajo (Cuadro 2).

El resto de las proteínas extraídas podría incluir a las originadas por la degradación de los proteoglicanos indicando que existe un grado de alteración importante del tejido, no sólo en su estructura, sino también en su función de síntesis y de degradación, relacionada probablemente con un menor número de condrocitos. Estas células influencian el balance de los componentes macromoleculares de la matriz extracelular al estar involucradas en el recambio fisiológico que incluye los procesos de síntesis y degradación de colágeno y proteoglicanos (Hamerman, 1989).

La alteración del cartílago articular, provocada por enfermedades sistémicas, fallas nutricionales, fallas genéticas y. lo más generalizado, traumas repetitivos, pueden inducir la disminución de los condrocitos y/o cambios metabólicos de estas células, con lo que se rompe el equilibrio del recambio de componentes de la matriz; se ha observado un aumento de actividades degradativas, como la colagenolítica dada por la liberación de colagenasas desde diferentes células, tejidos articulares y periarticulares (Pelletier y col., 1983; Hamerman, 1989; Price y col., 1992). Todos los cambios así producidos en el componente colágeno influyen en su función de amortiguar las fuerzas tensiles.

Desde el punto de vista metodológico, las técnicas utilizadas para cuantificar e identificar los GAGs no permitieron definir la participación diferenciada de condroitín o de queratán sulfato que corresponden a los más abundantes en el cartílago. Al cuantificar el ácido urónico no puede considerarse la participación del queratán sulfato ya que éste no lo posee en su estructura. En la tinción electroforética el colorante catiónico Alcian Blue se une a ambos GAGs y dado que los medios conductores utilizados no permitieron una separación de ellos, la menor tinción observada en los casos patológicos estaría relacionada con el conjunto condroitín y queratán sulfato.

Los resultados del componente GAGs de los proteoglicanos del cartílago articular metacarpo-falángico de equinos revelan una disminución de 38,6% de condrotín sulfato en aquellos cartílagos articulares caracterizados como osteoartríticos, lo que es coincidente con los resultados obtenidos por Nakano y col. (1979) en cartílagos articulares normales y osteoartríticos de porcinos.

Lo anterior indica que en esta patología también se altera la síntesis y/o la degradación de los proteoglicanos y sus GAGs. Asociado a este cuadro se describe una disminución, tanto en el contenido de proteoglicanos como en el tamaño de sus monómeros, debido a la pérdida de GAGs y a una disminución de la agregación de proteoglicanos al ácido hialurónico (Hainegard y col., 1987; Hamerman, 1989). El aumento del proceso degradativo observado es producto del incremento de los niveles de proteasas neutras y ácidas, más allá de los límites fisiológicos de recambio y/o por una menor síntesis,consecuencia de una disminución en el número de condrocitos o una alteración severa en su metabolismo (Dean y col., 1987; Caron, 1992). Estos cambios dejan de manifiesto el compromiso de los componentes proteoglicanos GAGs de la matriz y la imposibilidad de cumplir su rol en la amortiguación de fuerzas compresivas en la enfermedad degenerativa articular.

Los resultados obtenidos en este trabajo evidencian el deterioro de la matriz del cartílago articular osteoartrítico del equino, lo que se expresa demasiado tarde en su forma clínica. Por esto es válido pensar en la posibilidad de utilizar estos antecedentes para plantear un método de diagnóstico certero y precoz de esta patología.

Referencias

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