Trabajos Originales

  • Inoculación experimental de Escherichia Coli K99+ST+ en terneros. Estudio clínico y anátomo patológico

Resumen

Se reprodujo experimentalmente la colibacilocis en terneros recién nacidos, con el objetivo de determinar la respuesta clínica y anátomo patológica. Se utilizaron 19 animales Holstein Friesian asignados aleatoriamente en 4 grupos; el grupo 1 constituido por terneros que ingirieron calostro, los 3 restantes constituidos por individuos privados de calostro. En la inoculación se empleó una cepa de Escherichia coli K99+ enterotoxigénica, en una dosis de 100 ml de inóculo vía oral, con una concentración de 6 x 108 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml.

Los grupos II y III, una vez aparecida la signología fueron tratados con gentamicina, suero poliónico y suero glucosado al 5%. Los individuos tratados respondieron favorablemente a los fármacos administrados. Las muertes atribuidas al cuadro experimental sólo se presentaron en el grupo IV, no tratados. Las lesiones macro y microscópicas son coincidentes con las establecidas en la literatura.

Palabras claves: E. coli, diarrea, terneros.

Abstract

Colibacillosis was experimentaly produced in newlyborn calves ira orden to determine the clinical and anatomical pathologic response. Nineteen Holstein Friesian calves were randomly assigned to four groups: group I consisted of calves which ingested colostrum and the other 3 groups consisted of colostrum-deprived calves. An enterotoxigenic strain of Escherichia coli K99+ was employed for the inoculation, in a doce of 100 ml of inoculum per os of an inoculum containing 6 x 108 colony-forming units per ml.

Groups II and III were treated as soora as clinical signs appeared, with gentamicin, electrolytes and 5% glucose solution. Treated calves responded favorably to the drugs adrninistered. Deaths atributed to exper-mentally-induced disease were only obserbed in Group IV, untreated calves. The macro and miscroscopy lesions were similar to those described in the literature.

Key Words: E. coli, calves, diarrhea.

Abstract

Se reprodujo experimentalmente la colibacilocis en terneros recién nacidos, con el objetivo de determinar la respuesta clínica y anátomo patológica. Se utilizaron 19 animales Holstein Friesian asignados aleatoriamente en 4 grupos; el grupo 1 constituido por terneros que ingirieron calostro, los 3 restantes constituidos por individuos privados de calostro. En la inoculación se empleó una cepa de Escherichia coli K99+ enterotoxigénica, en una dosis de 100 ml de inóculo vía oral, con una concentración de 6 x 108 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml.

Los grupos II y III, una vez aparecida la signología fueron tratados con gentamicina, suero poliónico y suero glucosado al 5%. Los individuos tratados respondieron favorablemente a los fármacos administrados. Las muertes atribuidas al cuadro experimental sólo se presentaron en el grupo IV, no tratados. Las lesiones macro y microscópicas son coincidentes con las establecidas en la literatura.

Palabras claves: E. coli, diarrea, terneros.

Abstract

Colibacillosis was experimentaly produced in newlyborn calves ira orden to determine the clinical and anatomical pathologic response. Nineteen Holstein Friesian calves were randomly assigned to four groups: group I consisted of calves which ingested colostrum and the other 3 groups consisted of colostrum-deprived calves. An enterotoxigenic strain of Escherichia coli K99+ was employed for the inoculation, in a doce of 100 ml of inoculum per os of an inoculum containing 6 x 108 colony-forming units per ml.

Groups II and III were treated as soora as clinical signs appeared, with gentamicin, electrolytes and 5% glucose solution. Treated calves responded favorably to the drugs adrninistered. Deaths atributed to exper-mentally-induced disease were only obserbed in Group IV, untreated calves. The macro and miscroscopy lesions were similar to those described in the literature.

Key Words: E. coli, calves, diarrhea.

Introducción

 Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) produce diarrea en terneros preferentemente menores de 4-5 días de vida (Tzipori, 1981; Bachman, 1983; Fedida y col., 1983b; Chantal y col., 1984; Campero y Odeón, 1986; Núñez, 1986; Snodgrass y col, 1986; Hjerpe, 1990; Zurita y col., 1990). Esto raramente ocurre en animales mayores y nunca en animales adultos (Acres, 1985).

La infección del ternero por ETEC se produce en un breve período posterior al nacimiento, por transmisión orofecal; una vez ingresada rápidamente prolifera en grandes cantidades colonizando el intestino delgado (Acres, 1985).

El síndrome entérico se caracteriza por el cuadro clínico de diarrea, el cual se produce por la presencia de a lo menos dos factores de patogenicidad: el factor de adhesión y la enterotoxina; el primero permite adherirse al enterocito y colonizarlo, y el segundo es el responsable de las pérdidas de fluidos y electrolitos (Tzipori, 1981; Desmettre y col.,1982; Contrepois y Gouet, 1983b; Desmettre, 1983; Gouet, 1983; Moulin y col., 1983; Pohl y col., 1984; Acres, 1985; Tzipori, 1985).

Entre los antígenos de adhesión aislados de ETEC de terneros se encuentran: K99, F41, Att25 o FY (Contrepois y Gouet, 1983b; Pohl y col., 1984; Snodgrass y col., 1986), F210, F92b y tipo 1 (Acres, 1985), pudiendo coexistir más de un antígeno de adhesión por cepa (Contrepois y Gouet, 1983b).

La producción de pili K99 y de la toxina termoestable está altamente correlacionada con la presencia de los serogrupos (Acres, 1985; Tzipori, 1985); sin embargo, esto no permite afirmar que todas las cepas portadoras de pili K99 sean positivas a la toxina, ni a la inversa (Pohl y col., 1984).

La toxina termolábil (LT) se ha aislado de cepas de ETEC porcinas humanas, y en casos excepcionales se ha aislado de terneros (Tzipori, 1985; Mainil y col., 1990).

La toxina termoestable se subdivide en STa y STb (Gerday y col., 1984; Acres, 1985; Dove y col., 1987). La toxina aislada de cepas de ETEC bovina es STa (Contrepois y Gouet, 1983b; Mainil y col., 1984; Acres, 1985; Tzipori, 1985). Se ha demostrado la existencia de dos toxinas STa (Pohl y col.,1984) ; éstas serían: STa l o STaP (homóloga a la toxina STa de cepas de ETEC porcinas) y STa2 o STaH (homóloga a la toxina de cepas de ETEC humanas).

Las cepas de E. coli productoras de diarreas en terneros sólo producen un tipo de enterotoxina (STAP) (Mainil y col., 1984; Mainil y col., 1990). Esta toxina es una proteína pobremente inmunógena y no contribuye a la inmunidad (Mainil y col., 1990).

La diarrea producida por ETEC, se caracteriza por la frecuente emisión de fecas líquidas o muy líquidas de color amarillo pálido; en 24 horas disminuye el apetito o desaparece por completo, la temperatura es variable, la deshidratación es rápida en ausencia de tratamiento, llevando a endoftalmia, aplastamiento de la vena yugular, extremidades frías, adinamia marcada, evolucionando a la muerte dentro de horas o días (Vallet, 1983; Chantal y col., 1984). La muerte del ternero se produce por la gran pérdida de fluidos extracelulares, lo que lleva a un schock hipovolémico (Massip y col., 1983; Hjerpe, 1990) y por los desbalances bioquímicos que generan una acidosis e hiperkalemia (Kasari y Naylor, 1985; Kasari, 1990; Tremblay, 1990).

Experiencias de diversos autores, relacionadas con la reproducción experimental de la diarrea infecciosa producida por E. coli K99+, St+ en terneros, han utilizado diferentes dosis en la inoculación, así, Bertini, (1983) empleó 1010 - 1011, Contrepois y Gouet (1993b) utilizaron 1010; Chantal y col. (1984); Chantal y col., (1985) y Lacheretz y col. (1987), emplearon dosis de 0,4 - 2,2 x 1011 UFC. Prieels y col. (1989) inocularon 15 x 1010 UFC. En todos los cuadros experimentales se desencadenó una intensa diarrea y la muerte se produjo entre 24 y 48 horas post inoculación.

El presente estudio tiene como objetivo fundamental evaluar la respuesta clínica, medicamentosa y patológica de un cuadro experimental, utilizando cepas de campo de Escherichia coli enterotoxigénica.

Trabajo financiado por proyecto FONDECYT 0787-89.

Materiales y métodos

Animales de Experimentación

Se utilizaron 19 terneros recién nacidos Holstein Friesian, provenientes de la Región Metropolitana que contaban con buenas medidas sanitarias y de manejo. Para incorporar los animales al ensayo se les exigió presentar buenas condiciones físicas y estar clínicamente sanos. Los animales fueron estudiados por un período de 180 días.

De acuerdo con los objetivos del estudio los terneros fueron asignados aleatoriamente a 4 grupos experimentales.

Grupo I, compuesto por 4 terneros que consumieron calostro directamente de sus madres por 24 a 72 horas. Este grupo fue utilizado como referencia de los grupos II, III y IV.

Los grupos II, III con tratamiento y IV, sin tratamiento constituidos por 5 terneros cada uno, privados de calostro e inoculados por vía oral con una cepa de Escherichia coli K99+ enterotixigénica.

Los animales se mantuvieron durante los primeros 90 días de vida en un galpón acondicionado donde dispusieron para su alojamiento de cunas de madera individuales. Todos los terneros fueron sometidos al mismo régimen alimenticio, el cual estuvo constituido por un sustituto lácteo comercial[1] y como dieta sólida se usó una ración completa constituida por un concentrado comercial[2] de iniciación.

Exámenes clínicos

En el examen clínico se consideraron los signos vitales y un examen general del animal.

El estado de hidratación se evaluó a través de la persistencia del pliegue cutáneo a nivel cervical, retracción del globo ocular, características de la mucosa ocular, nasal y bucal, temperatura de los miembros, aplastamiento de la vena yugular y características del decúbito.

Se examinaron las características físicas de las heces, referido específicamente a su consistencia y coloración.

En los 4 grupos se realizaron dos exámenes clínicos diarios a las 9:00 y 16:00 horas durante el primer mes de estudio. Posteriormente y hasta los 180 días de vida se realizó un examen clínico semanal. Los resultados de los distintos exámenes realizados fueron anotados en una ficha individual.

Los animales muertos fueron sometidos a un estudio anátomo patológico macroscópico e histológico. De cada ternero se tomaron muestras de íleon, hígado, miocardio, riñón y eventualmente de encéfalo, bazo y pulmón, de acuerdo a las lesiones macroscópicas observadas, fijados en formalina tamponada en buffer fosfatocitrato (pH 7,0) en frascos individuales. Los órganos de cada animal fueron sometidos a las técnicas de rutina de inclusión en parafina, cortados a 5µm de espesor, con un micrótomo Leitz 1212 y teñidas con hematoxilina y eosina (variante Lillie-Mayer, 1965, descrita por Lynch y col., 1972) a fin de caracterizar las alteraciones histológicas.

Inoculación

Los terneros fueron inoculados con una cepa de campo de Escherichia coli K99+, ST+, aislada desde terneros diarreicos de la Región Metropolitana de nuestro país.

La preparación del inóculo se realizó sembrando la cepa en 10 ml de TSB (caldo soya tripticasa) pH 7,2 e incubándola a 37°C por 18 horas; posteriormente este cultivo se sembró en 90 ml de TSB, incubándolo por 4 horas a 37°C.

La concentración bacteriana utilizada fue de 6 x 108 UFC (Unidades Formadoras de Colonias) por ml.

La inoculación se realizó administrando 100 ml del cultivo por vía oral. Ésta se efectuó como promedio a las 40,6 horas de vida, en todos los individuos de los grupos II, III y IV.

Tratamiento medicamentoso

Resultados y discusión

Los signos vitales para los diferentes grupos (Figura 1) señalan que la temperatura rectal, en 9 de los 15 terneros inoculados (60%), se presentó sobre el rango normal para la especie (Rosenberger, 1981); este parámetro tuvo una variación de 39,7°C a 41,5°C, persistiendo por 12 a 48 horas. Este hecho no es mencionado como frecuente en la diarrea colibacilar (Vallet, 1983; Núñez, 1986). La hipertermia puede ser explicada por la absorcion de endotoxinas bacterianas producto de una septicemia (Templeton y col., 1988), la cual se debe a la masiva colonización de la mucosa por ETEC (Chantal y col., 1985). El aumento de la temperatura rectal a las 8 horas PI, es significativamente mayor a la presentada en el grupo referencia (p < 0,05).

 

Figura 1:   Variaciones de la temperatura rectal de terneros inoculados con Escherichia coli K99+ y sin tratamiento.

En las frecuencias respiratorias y cardíaca también se observó un incremento en aquellos terneros que presentaron hipertermia (Figuras 2 y 3), sin embargo no hubo diferencias significativas (p > 0,05).

Figura 2: Frecuencia respiratoria de terneros inoculados con Escherichia coli K99+.

Figura 3: Frecuencia cardíaca de terneros inoculados con Escherichia coli K99+.

En el grupo II (tratamiento 1 hr.), las manifestaciones sistémicas observadas fueron: congestión de la mucosa conjuntival, deshidratación leve a moderada; un animal presentó extremidades frías y tendencia al decúbito y otro presentó fiebre (40,1°C), (Cuadro 1).

CUADRO 1 SIGNOS CLÍNICOS RELEVANTES EN TERNEROS INOCULADOS CON E. COLI K99+, 48 HORAS POST INOCULACIÓN (P1)

Signos clínicos

Grupo II

Grupo III

Grupo IV

Diarrea líquida

+ + + + +

- + + + -

+ +++ +

Color de heces

A A A A A

- A A A -

AR AAA AB

Deshidratación Pliegue cutáneo (seg)

2 2 2 3 1

- 232 -

4 242 4

Retracción del globo ocular

- - - - -

- - - - -

+ - - - +

Aplastamiento de la vena yugular

- - - - -

- - - - -

+ - + - +

Fiebre

- - + - -

- + + + -

+ +++ +

Congestión de la mucosa ocular

+ + + + -

- - + + -

+ - ++ +

Inyección de vasos epiesclerales

- - - - -

- - - + -

+ - ++ +

Extremidades frías

+ - - - -

- - - - -

+ - + - +

Tremor muscular

- - - - -

- - - + -

+ - ++ +

Secreción nasal

- - - - -

- - - + -

+ - ++ -

Depresión

- - - - -

- - + + -

- - ++ +

Decúbito

+ - - - -

- - - + -

+ - ++ +

Apetito

N N N N N

N N N N N

S SDD N

A: Amarillo, R: Rojizo B: Blanquecinas N: Normal D: Disminuido S: Suprimido. -------------------

La diarrea se presentó a las 5 ± 2,3 horas con un rango de 2-7 horas posterior a la inoculación. Las heces se presentaron líquidas de color amarillo claro; dos terneros presentaron estrías de sangre fresca. (Figura 4-II, Cuadro l).

El cuadro clínico tuvo una duración variable; posterior al cuadro experimental se manifestaron diarreas recidivantes, onfalitis purulenta, abscesos y traqueobronquitis crónica. Este mismo grupo registra la muerte de dos de sus integrantes: a los 10 días de vida muere el primer animal, el cual no presentó ninguna manifestación previa. La segunda muerte se registró en un ternero de 60 días; éste cursó con fiebre moderada durante 48 horas previo al inicio de una diarrea líquida de color amarillento; el animal no respondió al tratamiento, produciéndose la muerte a las 3 horas de iniciada la diarrea.

En el Grupo III (tratamiento 6 hrs.), el cuadro experimental se manifestó sólo en 3 de los 5 terneros. En dos animales se observó congestión de la mucosa conjuntival y depresión, en otro ternero se produjo secreción nasal, inyección de los vasos epiesclerales y tendencia al decúbito. Los tres terneros que cursaron el cuadro entérico presentaron fiebre (cuadro 1). La diarrea se presentó a las 6,3 ± 0,5 horas con un rango de 6-7 horas post inoculación, la cual tuvo una duración variable (Figura 4-III). Las heces fueron de consistencia líquida y de color amarillo claro. Posterior al proceso entérico dos animales presentaron onfalitis purulenta. En los 2 animales que no desarrollaron el cuadro experimental, uno presentó a los 9 días de vida una diarrea líquida de color amarillo que persistió por 48 horas. De la muestra de heces se aisló ETEC. El segundo ternero cursó a los 30 días de vida una glositis necrótica, la que remite a los 7 días después de iniciado el tratamiento.

En el grupo IV (sin tratamiento), los 5 terneros presentaron manifestaciones sistémicas caracterizadas por congestión de la mucosa conjuntival, inyección de vasos epiesclerales, fiebre marcada la que alcanzó los 41,5°C. Se observó además disminución del apetito llegando a ser nulo, debilidad de las extremidades, tremor muscular, depresión, disminución del reflejo de succión, derrame conjuntival, decúbito lateral, miembros fríos, pliegue cutáneo variable (2-4 segundos), retracción del globo ocular y aplastamiento de la vena yugular. (Cuadro 1).

La diarrea en este grupo comenzó a las 2,6 ± 1,1 horas con un rango de 1-4 horas posterior a la inoculación. Ésta tuvo una duración variable (Figura 4-IV). Las heces fueron de consistencia líquida, de color amarillo claro y un animal presentó estrías de sangre, en otro las heces se observaron blanquecinas. Este grupo consigna la muerte de todos sus integrantes, de los cuales 3 mueren producto de una intensa diarrea (60%). Ésta comenzó entre 9 y 16 horas post inoculación. La cuarta muerte ocurrió por asfixia a los 8 días de vida a causa de una laringitis necrótica (Figura 4-IV).

Figura 4: Consistencia de la heces de terneros inoculados con E. coli K99+. Grupos : II-III sometidos a tratamiento, IV no tratados Heces: Normal (-) semilíquida (---) líquida ( ▬ ) Terneros: 1-2-3-4-5) Muertes (▲▲▲)

El último animal cursó diarreas recidivantes, hipopion unilateral, subluxación del cristalino, epífora, secreción nasal serosa, artritis bilateral del carpo, retracción de los tendones flexores y abscesos en la encía. Su muerte se produce por un cuadro diarreico a los 68 días de vida.

Las muertes ocurridas en el grupo sin tratamiento entre las 9 y 16 horas post inoculación (P1) fueron generadas por la intensa deshidratación producto de una diarrea acuosa, produciendo la muerte por un shock hipovolémico y paro cardiorrespiratorio. Estos resultados son semejantes a los obtenidos por Chantal y col., (1984); Chantal y col., (1985); Lacheretz y col., (1987); en estos estudios, la muerte se produjo como promedio a las 25 horas PI.

La presentación de la diarrea en los grupos II-I1I y IV respectivamente, coincide plenamente con lo descrito por Chantal y col., (1984), quienes describen que la diarrea se manifestó a las 6 horas post inoculación (PI). En el estudio realizado por Massip y col., (1983), ésta se presentó entre las 12 y 15 horas PI. Por otra parte Prieels y col., (1989), observaron el cuadro diarreico dentro de las 24 horas PI.

En el grupo III (tratado a las 6 horas), de los terneros que no presentaron diarreas, se logró aislar de sus heces E. coli K99, lo que ha sido previamente descrito por Prieels y col., (1989). Esta situación puede ser explicada por factores individuales de resistencia a ETEC.

El cuadro clínico presentado coincide con lo citado por Vallet, (1983); Chantal y col., (1984), caracterízándose por heces líquidas de color amarillo y disminución del apetito. La deshidratación es rápida en ausencia de tratamiento llevando a endoftalmia, aplastamiento de la vena yugular, extremidades frías y adinamia.

En relación al tratamiento instaurado a los grupos 2 y 3, en términos generales, dado el diseño de esta investigación, en los cuales se estableció precocidad de los tratamientos (1 y 6 horas), no fue posible evidenciar diferencias entre los grupos tratados. Sin embargo, la utilización del antibiótico adecuado y la sueroterapia fueron de gran valor. La remisión clínica del cuadro entérico fue entre 2 y 5 días de terapia (Figuras 4-II y lll).

La elección del antibiótico, en este caso gentamicina, se realizó teniendo presente la sensibilidad de la cepa, a fin de tener éxito en la terapia y no generar una selección de cepas resistentes.

Los animales que murieron debido a la inoculación experimental, presentaron alteraciones macroscópicas, deshidratación marcada o moderada, congestión en grado variable de hígado, miocardio, riñón, ganglios linfáticos mesentéricos y ocasionalmente en encéfalo, este último asociado a un ligero edema. El intestino delgado especialmente íleon se presentó marcadamente congestivo y con presencia de un gran contenido líquido intraluminal de tipo seroso. Además en la mayor parte de los casos se presentaron petequias y equimosis endocárdicas y miocárdicas.

Histológicamente, se observó tumefacción turbia de los túbulos renales y de los hepatocitos, los ganglios linfáticos mesentéricos se observaron hiperreactivos y con una marcada actividad linfopoyética. En pulmón se describió en algunos animales congestión, edema pulmonar leve y focos neumónicos y bronconeumónicos. El bazo se presentó congestivo y hemorrágico. En íleon se observó diferentes grados de congestión en especial en la lámina propia, además de una necrosis severa de la vellosidades intestinales que incluso comprometían las criptas de Lieberkühn e infiltración linfocitaria de submucosa (Figura 5).

Figura 5 Íleon. Vellosidades intestinales de un ternero inoculado con E. Coli K99+ y que demuestra una marcada necrosis especialmente del ápice. Además se observan zonas hemorrágicas (flechas). HE. 150x.

La congestión marcada del íleon y la hiperreactividad de los ganglios mesentéricos, es coincidente con lo señalado por Chantal y col., (1985), como igualmente la necrosis de las vellosidades intestinales ha sido descrita en terneros inoculados experimentalmente con ETEC (Bijwal y col., 1985).

En general, los hallazgos anatomopatológicos obtenidos en el presente estudio, fueron semejantes a los descritos por Hurtel (1983). La reproducción experimental de la colibacilosis en terneros debe considerar como necesario que ésta se realice lo más precozmente posible (Berlin, 1983). En experiencias previas se han utilizado diferentes tiempos de inoculación, así Chantal y col., (1984); Chantal y col., (1985); Lacheretz y col., (1987), inocularon a terneros de 15 horas de vida. Por otra parte Prieels y col., (1989), realizaron ésta dentro de las primeras 24 horas de vida.

En nuestro estudio, la inoculación se realizó a las 40,6 ± 1 hora de vida; si bien ésta fue más tardía a la realizada por otros autores, se efectuó dentro del período de susceptibilidad del ternero a ETEC (Contrepois y Gouet, 1983b; Chantal y col., 1984; Acres, 1985; Tzipori, 1985).

Un factor importante en la reproducción de la enfermedad, es la concentración de bacterias a inocular. La dosis utilizada en el presente estudio (6 x l08 UFC), por ml. fue semejante a las empleadas por Desmettre y col., (1982); Massip y col., (1983);

Bachmann, (1983); Contrepois y Gouet, (1983b); Chantal y col., (1984), Chantal y col., (1985); Lacheretz y col., (1987).

Referente a los exámenes microbiológicos y parasitarios efectuados a los animales experimentales, una vez presentada la signología; en todos ellos se recuperó Escherichia coli K99+ ST+. En ninguno de ellos se determinó la presencia de rotavirus, coronavirus, ni Coptosporidiuriz; descartándose por consiguiente que en el cuadro experimental hayan participado otros agentes causales ajenos a E. coli enterotoxigénica.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a los profesores Texia Gorman y Haroldo Toro por su aporte en el diagnóstico de Cryptosporidium y coronavirus respectivamente.

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Recibido el 1 de junio de 1993, aprobado el 6 de junio de 1994.