Trabajos Originales

  • Empleo de un polisacárido de brucella abortus 1119- 3 en pruebas de inmunodifusión e inmunoensayo enzimático para dicriminar bovinos vacunados con cepa 19º

Resumen

Se evaluó la capacidad de discriminar vacunados (CDV) con Cepa 19 que ofrecía un polisacárido (PS) obtenido de Brucela abortus 1119-3, simultáneamente en las pruebas de inmunodifusión doble (IDD) y ELISA indirecto (ELISA-I).

Fueron probados tres grupos de sueros de bovinos:

A) 61 sueros de terneras (< 1 año) vacunadas con Cepa 19, dosis 45 x 109 CFU, entre 3 y 4 meses atrás. Todos positivos a las pruebas de seroaglutinación estándar (SAE) y Rosa de Bengala (RB); B) 240 sueros de 60 vacas (> 2 años) pertenecientes a rebaños con alta prevalencia de brucelosis, vacunadas cuando terneras y revacunadas con Cepa 19, dosis 4,5 x 108 CFU, vía conjuntival; estos sueros fueron seleccionados como sigue: Día 0 = negativos SAE y RB; Días 45; 90 y 180 posrevacunación (prv), todos positivos a SAE y RB; y C) 30 sueros de vacas (> 2 años) no revacunadas, alojadas en los mismos predios que grupo B; sus sueros al Día 180 fueron positivos a SAE, RB e IDD, por lo tanto se consideraron infectadas y se procesaron por ELISA-I.

La prueba de IDD mostró un 100% de CDV en grupos A, en tanto en grupo B alcanzó un 91,7% al Día 45 prv y 100% a los 90 y 180 días.

Para el ELISA-I se utilizaron tres líneas de corte (-/+); las mejores CDV que ofreció fueron 90,2% para el grupo A. Mientras que en grupo B al Día 45 brindó 86,7% de CDV, al Día 90 alcanzó 90,0% y al Día 180 su máximo rendimiento 95%. En el grupo C todos los sueros fueron clasificados como positivos por el ELISA-I en concordancia con SAE, RB e IDD.

Se concluye que el antígeno PS en IDD ofrece excelente capacidad para discriminar bovinos vacunados y revacunados con Cepa 19. En tanto en ELISA-1 son necesarias nuevas experiencias para mejorar su rendimiento.

Palabras claves: brucelosis - revacunación - diagnóstico - antígenos solubles - control

Abstract

A hot-water extracted polysaccharide (PS) obtained from Brucella abortus 1119-3 was evaluated using both agar gel immunodiffusion (AGID) and indirect enzyme linked immunosorbent assay (I-ELISA) tests. The ability to discriminate vaccinated (ADV) with 5-19 from infected cattle was determined.

Three groups of sera were tested: A) 61 from < 1 year old heifers vaccinated with S-19 B. abortus (45 x 109 CFU) 3 to 4 months before. These sera were positives to standard agglutination test (SAT) and Rose Bengal test (RBT); B) 240 sera from 60 > 2 years old cows that were living with brucellosis high prevalence herds, vaccinated with S-19 when they were heifer calves and revaccinated with S-19 (45 x 108 CFU) through the conjuntival route. These sera were obtained at days 0 (negatives to SAT and RBT), 45, 90 and 180 (positives to SAT and RBT) after revaccination; and C) 30 sera from nonrevaccinated adult cows living together with group B, presumed as infected animals at day 180 because they were positives to SAT, RBT and AGID test.

The AGID test gave 100% of ADV in group A, and in group B the ADV were: days 45 (91.7%); 90 (100%) and 180 (100%). For I-ELISA test three differents cut-offs were used, thus the highest ADV was 90.2% in group A and for group B were: day 45 (86.7%); day 90 (90.0%) and day 180 (95.0%). The I-ELISA test classified all sera as positive in group C. The PS antigen appears to be a very useful tool especially in AGID test to differentiate S-19 vaccinated and revaccinated animals from infected cattle in brucellosis high prevalence areas.

Key words: brucellosis - vaccination - diagnosis - control

Abstract

Se evaluó la capacidad de discriminar vacunados (CDV) con Cepa 19 que ofrecía un polisacárido (PS) obtenido de Brucela abortus 1119-3, simultáneamente en las pruebas de inmunodifusión doble (IDD) y ELISA indirecto (ELISA-I).

Fueron probados tres grupos de sueros de bovinos:

A) 61 sueros de terneras (< 1 año) vacunadas con Cepa 19, dosis 45 x 109 CFU, entre 3 y 4 meses atrás. Todos positivos a las pruebas de seroaglutinación estándar (SAE) y Rosa de Bengala (RB); B) 240 sueros de 60 vacas (> 2 años) pertenecientes a rebaños con alta prevalencia de brucelosis, vacunadas cuando terneras y revacunadas con Cepa 19, dosis 4,5 x 108 CFU, vía conjuntival; estos sueros fueron seleccionados como sigue: Día 0 = negativos SAE y RB; Días 45; 90 y 180 posrevacunación (prv), todos positivos a SAE y RB; y C) 30 sueros de vacas (> 2 años) no revacunadas, alojadas en los mismos predios que grupo B; sus sueros al Día 180 fueron positivos a SAE, RB e IDD, por lo tanto se consideraron infectadas y se procesaron por ELISA-I.

La prueba de IDD mostró un 100% de CDV en grupos A, en tanto en grupo B alcanzó un 91,7% al Día 45 prv y 100% a los 90 y 180 días.

Para el ELISA-I se utilizaron tres líneas de corte (-/+); las mejores CDV que ofreció fueron 90,2% para el grupo A. Mientras que en grupo B al Día 45 brindó 86,7% de CDV, al Día 90 alcanzó 90,0% y al Día 180 su máximo rendimiento 95%. En el grupo C todos los sueros fueron clasificados como positivos por el ELISA-I en concordancia con SAE, RB e IDD.

Se concluye que el antígeno PS en IDD ofrece excelente capacidad para discriminar bovinos vacunados y revacunados con Cepa 19. En tanto en ELISA-1 son necesarias nuevas experiencias para mejorar su rendimiento.

Palabras claves: brucelosis - revacunación - diagnóstico - antígenos solubles - control

Abstract

A hot-water extracted polysaccharide (PS) obtained from Brucella abortus 1119-3 was evaluated using both agar gel immunodiffusion (AGID) and indirect enzyme linked immunosorbent assay (I-ELISA) tests. The ability to discriminate vaccinated (ADV) with 5-19 from infected cattle was determined.

Three groups of sera were tested: A) 61 from < 1 year old heifers vaccinated with S-19 B. abortus (45 x 109 CFU) 3 to 4 months before. These sera were positives to standard agglutination test (SAT) and Rose Bengal test (RBT); B) 240 sera from 60 > 2 years old cows that were living with brucellosis high prevalence herds, vaccinated with S-19 when they were heifer calves and revaccinated with S-19 (45 x 108 CFU) through the conjuntival route. These sera were obtained at days 0 (negatives to SAT and RBT), 45, 90 and 180 (positives to SAT and RBT) after revaccination; and C) 30 sera from nonrevaccinated adult cows living together with group B, presumed as infected animals at day 180 because they were positives to SAT, RBT and AGID test.

The AGID test gave 100% of ADV in group A, and in group B the ADV were: days 45 (91.7%); 90 (100%) and 180 (100%). For I-ELISA test three differents cut-offs were used, thus the highest ADV was 90.2% in group A and for group B were: day 45 (86.7%); day 90 (90.0%) and day 180 (95.0%). The I-ELISA test classified all sera as positive in group C. The PS antigen appears to be a very useful tool especially in AGID test to differentiate S-19 vaccinated and revaccinated animals from infected cattle in brucellosis high prevalence areas.

Key words: brucellosis - vaccination - diagnosis - control

Introducción

El control de brucelosis bovina tiene como estrategias fundamentales, la vacunación y la eliminación de los reactores positivos a las pruebas serológicas para Brucella.

Estas medidas posibilitaron, en diversos países, reducir marcadamente las prevalencias globales; tal es el caso de Chile donde en un período de 17 años se redujo la prevalencia de 7% a un 2,4%. Sin embargo, aún existen áreas con predios que presentan alto número de reactores y problemas reproductivos debidos a la enfermedad (Abalos y col., 1994). En estos casos es cuando las alternativas de vacunación y diagnóstico adquieren importancia para incrementar la eficiencia del control.

La vacunación tradicional -terneras entre 3 y 8 meses de vida- con B. abortus cepa 19 sólo permite alcanzar una protección de rebaño del 60-70%, la cual decae más aún en regiones de alta prevalencia (Nicoletti, 1990). Además los anticuerpos producidos persisten un tiempo más o menos prolongado interfiriendo en el diagnóstico mediante pruebas serológicas clásicas, tales como seroaglutinación estándar (SAE), Rosa de Bengala (RB) y Fijación del Complemento (FC), entre otras (Wright y Nielsen, 1990).

Una alternativa es la revacunación con Cepa 19, dosis reducida, vía ocular, como un refuerzo al esquema tradicional. Tal opción fue ensayada en diversas regiones, incluso en Chile, donde Pinochet y col. (1991) verificaron la persistencia de anticuerpos y comprobaron el incremento de la protección inmunitaria ante desafío natural en predios con prevalencias superiores al 20%.

Es evidente que esta alternativa u otras similares requieren del apoyo diagnóstico de alta eficiencia, tanto en sensibilidad (Se) y especificidad (Sp) cuanto en capacidad para discriminar vacunados (CDV) de bovinos infectados naturalmente.

Las pruebas clásicas, SAE y RB, usadas rutinariamente en los programas de control ofrecen excelente Se, pero debido a que utilizan -como antígeno- la célula Brucella entera, tienen menor Sp y son incapaces de descartar respuestas vacunales a Cepa 19.

En las dos últimas décadas se realizaron numerosos esfuerzos en la búsqueda de antígenos solubles de Brucella, capaces de conjugar con eficiencia, Sp y CDV en pruebas de inmunodifusión radial (IDR) e inmunodifusión doble (IDD) (Díaz y col., 1979; 1981; Cherwonogrodzky y Nielsen, 1988; Pinochet y col., 1989; 1990).

Así Pinochet y col. (1990) obtienen un polisacárido (PS) de B. abortus 1119-3, por extracción salina y doble precipitación con etanol, el que demostró excelentes Sp y CDV -en IDD e IDR- cuando fue comparado simultáneamente con otros antígenos solubles frente a sueros de bovinos con diferentes estados epidemiológicos de infección brucelar (Daffner, 1994).

También este PS ha sido utilizado en pruebas de unión primaria, tal es un ELISA indirecto (ELISA-I) con buenos niveles de Se y Sp, 89,5 y 94,8%, respectivamente; así mismo demostró óptima capacidad para identificar -como negativos- a terneras recientemente vacunadas con Cepa 19 (Ábalos y col., 1994), con el mismo antígeno en un ELISA-I, reportan un 100% de Se frente a sueros de bovinos infectados naturalmente y un 97,7% de Sp utilizando sueros de área libre de brucelosis.

Conocido es que los valores de rendimiento diagnóstico del ELISA están influenciados por diversos factores, siendo uno de ellos el criterio que se utilice para establecer el umbral diagnóstico, línea de corte (-l+) o cut off.

En este sentido, el objetivo fue evaluar en sueros de terneras vacunadas y vacas revacunadas, la CDV ofrecida por el antígeno PS en las pruebas de inmunodifusión doble y ELISA-I, utilizando -para el último- diferentes criterios para determinar la línea de corte.

 Trabajo realizado con aportes de IFS B/1800-1 e IAEA RC 6523/SD, como preliminar de tesis del primer autor

Materiales y métodos

- Sueros bovinos[1]

El tamaño muestral se obtuvo por la ecuación n = 4 pq/e2 de acuerdo a Wright y Nielsen (1988), utilizando un nivel de confianza de 95%, los que fueron seleccionados para formar los siguientes grupos:

A) Terneras < 1 año (n = 61) de un rebaño con prevalencia de brucelosis (5%), vacunadas con Cepa 19 dosis estándar (45 x 109 UFC*) a los 5 meses de edad. Los sueros (una muestra) fueron obtenidos entre 90 y 120 días postvacunación (pv) y eran positivos a SAE (≥ 50) y RB, como consecuencia de la vacunacion. B) Vacas > 2 años (n = 60) de tres rebaños con prevalencias superiores al 20% y desórdenes reproductivos, las que habían sido vacunadas cuando terneras con Cepa 19 dosis edad igual a grupo A. Estos animales formaron parte de un ensayo de revacunación (rv) con Cepa 19, dosis reducida (4,5 x 108 UFC) vía ocular. De ellas se seleccionaron cuatro muestras (total 240 sueros) con las características siguientes: Día 0 = negativos a SAE (< 50) y RB, Días 45; 90 y 180 posrevacunación (prv) = positivos a SAE (≥ positivos a SAE (≥ 50) y RB. C) Vacas > 2 años (n = 30) de los mismos rebaños que el Grupo B, pero no revacunadas (nrv), las que formaron parte del grupo control dentro del ensayo de revacunación. De ellas se escogieron los sueros del Día 180 prv, todos eran positivos a SAE (≥ 50), RB e IDD; por lo tanto fueron consideradas serológicamente como vacas infectadas.

Como sueros control se utilizaron: a) un pool (+) de 10 sueros de bovinos infectados naturalmente, demostrado por cultivo de Brucella abortus y positivos a SAE, RB, FC, ELISA-I e IDD. b) un pool (-) de 10 sueros de bovinos no infectados provenientes de área libre de brucelosis y negativos a las citadas pruebas. c) un pool (VAC) de 10 sueros de bovinos recientemente vacunados con Cepa 19 positivos a SAE, RB y FC; y negativos a ELISA-I e IDD con antígeno PS.

- Antígeno:

Un polisacárido PS[2] obtenido de B. abortus 1119-3 por extracción salina en caliente con doble precipitación etanólica -método no hidrolítico- (Díaz y col., 1981), con modificaciones de Pinochet y col. (1990). Contiene 230 .µg de hexosas/ml y 0,5% de proteínas. Se utiliza de IDD a una concentración de 500 µg/ml de agua destilada, mientras que en ELISAI se usa a 4,6 µg/ml de PBS pH 7,4 +/-0,20.

- Pruebas serológicas:

1. IDD: se realizó para sueros Grupos A y B, siguiendo las recomendaciones de Pinochet y col. (1990). Se utilizó agarosa [MERCK] 0,7% en buffer TRIS HCL 0,1% pH 7,2 con 10% de NaCL, en placas Petri de plástico diámetro de 100 mm. Se empleó un sacabocado en forma de roseta con seis pocillos periféricos y uno central de 3 mm de diámetro, con separación de 3 mm entre ellos. Los sueros se usaron sin diluir, 15 µl por pocillo; se incubó a 25°C en cámara húmeda. Las lecturas se realizaron a las 24 y 48 horas, registrando a la última como definitiva. 2. ELISA-I: se realizó para los tres grupos de sueros siguiendo las recomendaciones de Abalos y col. (1994) y Daffner (1994); brevemente:

a) Fase sólida: se utilizaron placas NUNC 269620, sensibilizadas con 100 µl de la dilución del antígeno PS señalada arriba y el tiempo de adsorción fue una hora a temperatura ambiente, luego una hora a 35°C y posteriormente 48 horas a -20°C.

b) Fase líquida: los volúmenes de trabajo fueron 100.µl en todos los pasos; se emplearon ciclos de tres lavados con PBS + Tween 20. Los sueros se utilizaron diluidos 1:200, en PBS + Tween 20, se distribuyeron -por duplicado y cuadruplicado- los sueros a probar y controles, respectivamente. Las incubaciones se realizaron a 37°C con agitación permanente. Se utilizó un suero policlonal anti IgG bovina molécula completa (SIGMA) conjugado con HRPO (Horse radish peroxidase) diluido en PBS 1:6000. Como sustrato/cromógeno se utilizó ABTS 1mM con 4,4 mM de H202 en solución buffer citrato de sodio/ácido cítrico 0,05 M pH 4,5. La reacción se detuvo con SDS 4%.

c) Lectura: se utilizó un equipo IMMUNOSKAN Plus con filtro de 405 nm y programa BREIA 1.01[3]  que calcula los promedios () de densidad óptica (DO) y entrega porcentajes de positividad (PP) de los sueros probados respecto del control positivo que representa al 100%. Para determinar la óptima línea de corte (-/+) en los grupos A y B se utilizaron, de acuerdo a Ábalos y col. (1994) y Daffner (1994), las .siguientes ecuaciones: 1)   PP vacunados (VAC); 2)  PP VAC x 2; 3)  PP VAC + 1 desvío estándar (D.E.). En tanto en el grupo C el cut off utilizado se estableció en el valor 30% de PP, siguiendo las recomendaciones de Daffner (1994) para animales no revacunados.

TABLA 1 CAPACIDAD DE DISCRIMINAR VACUNADOS (CDV) BRINDADA POR LAS PRUEBAS DE INMUNODIFUSIÓN DOBLE (IDD) Y ELISA-1 EN 61 SUEROS DE TERNERAS VACUNADAS CON CEPA 19 (dosis y esquema tradicional)

SUEROS NEGATIVOS
IDD ELISA-I % CDV
- (1) (2) (3) -
61 --- ---- - 100,0
- 32 - - 52,5
- - 55 - 90,2
- - - 52 85,3
Líneas de corte (-/+): (1) =  PP [VAC] (2) =  PP [VAC] x 2 (3) =  PP [VAC] + 1 DE

- Análisis de resultados:

La CDV se determinó para ambas pruebas, en los grupos A y B, mediante la ecuación: (N° de sueros negativos / N° de sueros probados) x 100. Las comparaciones de rendimientos en CDV de cada prueba se realizaron por X2 de Mc Nemar según Landis y Koch (1977).

_____________________________

Notas

[1]

Fueron obtenidos de la Seroteca del Laboratorio de Enfermedades Infecciosas, Departamento Medicina Preventiva, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile.

[2]

Pertenece al Laboratorio de Enfermedades Infecciosas, Departamento Medicina Preventiva, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile.

[3]

Software proporcionado por IAEA, Viena, Austria.

Resultados

En el grupo A la prueba de IDD identificó como negativos a la totalidad de los sueros probados (100% de CDV); mientras que el ELISA-I entregó positivos en las tres líneas de corte empleadas (ver Tabla 1). La mayor CDV del ELISA-1 (90,2%) se observa al emplear la ecuación ( PP VAC x 2), pero no presenta diferencias significativas (p > 0,05) con el rendimiento en CDV (85,3%), al aplicar la ecuación ( PP VAC + 1 DE). No obstante, ambos rendimientos difieren significativamente (p < 0,05) con el proporcionado por IDD.

En la Tabla 2 se observa la distribución de valores de PP (promedios, desvío estándar y rangos) ofrecidos por el ELISA-I en cada uno de los grupos analizados.

TABLA 2 VALORES DE PORCENTAJE DE POSITIVIDAD (PP)CON SU PROMEDIO (X), DESVÍO ESTÁNDAR (DE) YRANGO ENTREGADOS POR LA PRUEBA DE ELISA-IEN LOS TRES GRUPOS DE SUEROS BOVINOSESTUDIADOS, SEGÚN DÍAS POSREVACUNACIÓN (prv) 

Grupo DIA prv VALORES DE PP
(n) DE Rango
A 90-120 (61) 17,4 7,3 4/59
0 (60) 20,2 5,6 10/42
45 (60) 30,7 14,7 18/88
B 90 (60) 28,9 9,8 14/68
180 (60) 25,3 8,5 11/53
C 180 (30) 47,2 12,4 32/121

Todos los sueros de vacas revacunadas -grupo B- día 0 fueron negativos a IDD, en tanto el ELISAI clasificó a 58 como negativos empleando el cut off señalado para grupo C. Los rendimientos en CDV días 45; 90 y 180 prv, ofrecidos por ambas pruebas, se presentan en Tabla 3. La prueba de IDD alcanzó el 100% de CDV a partir del Día 90; mientras que el ELISA-I logró como máximo un 95,0% al Día 180, empleando como línea de corte la ecuación ( PP VAC x 2). Ambos resultados no difieren significativamente (p > 0.05). En el Día 45 prv, la IDD alcanza un 91,7% de CDV, en tanto el ELISA-I ofrece un 86,7% al aplicar la ecuación señalada anteriormente; tampoco estos resultados presentan diferencias significativas (p > 0.05).

TABLA 3 CAPACIDAD DE DISCRIMINAR VACUNADOS (CDV) BRINDADA POR LAS PRUEBAS DE INMUNODIFUSIÓN (IDD) Y ENZIMOINMUNOENSAYO INDIRECTO (ELISA-I) EN SUEROS DE VACAS REVACUNADAS CON CEPA 19 OBTENIDOSA LOS 45,90 y 180 DÍAS POSREVACUNACIÓN (prv)

DÍA SUEROS NEGATIVOS (% CDV)
prv IDD ELISA-I
- - (1) (2) (3)
45 55 (91,7) 34 (56,7)

52 (86,7)

42 (70,0)
90 60 (100,0) 36 (60,0)

54 (90,0)

44 (73,3)
180 60 (100,0) 38 (63,3) 57 (95,0) 51 (85,0)
Líneas de corte (-/+): (1) = PP [VAC] (2) = PP [VAC] x 2 (3) =  PP [VAC] + 2

En el grupo C, vacas no revacunadas y consideradas infectadas mediante SAE, RB e IDD al Día 180, el ELISA-I clasificó a todas como positivas empleando un cut off preestablecido en 30% de PP. La  de valores de PP (47,2%) permite diferenciar, en su mayoría, a estos bovinos de aquellos revacunados que al Día 180 prv expresan una  de PP de 25,3% (ver Tabla 2).

Discusión

Para la evaluación de pruebas diagnósticas es necesario cumplimentar con pautas, tales como las sugeridas por Alton (1977). En nuestro estudio evaluamos el rendimiento en CDV, del antígeno PS en IDD y ELISA-I, el cual ya había sido verificado cumplimentando dos de aquellas pautas, según Pinochet y col. (1990); Ábalos y col. (1994) y Daffner (1994). En este caso, al efectuar el ensayo frente a sueros de bovinos vacunados y revacunados con Cepa 19, los que representan la situación epidemiológica de áreas donde funcionan programas de control de brucelosis, nosotros consideramos haber alcanzado la tercera condición señalada por Alton (1977).

Áreas con prevalencias menores al 5% y otras con más del 20%, constituyen situaciones muy comunes en países en desarrollo donde se lucha contra brucelosis bovina. Tal característica, más la proporcionada por sueros obtenidos a distintos tiempos posvacunación -más aún en revacunación- constituyen un riguroso desafío al rendimiento del antígeno PS. ya que dichos sueros poseen diferentes niveles de anticuerpos, producto de la actividad conjunta de Cepa 19 y cepas virulentas de B. abortus.

Nuestros resultados en IDD con el PS frente a sueros de terneras vacunadas [dosis estándar] concuerdan con reportes previos (Cherwonogrodzky y Nielsen, 1988; Pinochet y col., 1990 y 1991), donde esta técnica también ofreció un 100% de CDV con sueros obtenidos a similares tiempos posvacunación. En este sentido, se torna indiscutible la excelente CDV del antígeno PS en inmunodifusión doble frente a sueros obtenidos entre 90 y 120 días posteriores a la vacunación con Cepa 19 a terneras de cinco meses de edad. Sin embargo restaría ahora evaluar, para contar con una herramienta eficiente en diferentes situaciones, si el rendimiento se mantiene cuando las terneras son vacunadas a los 8 meses de edad.

Respecto del ELISA-I con PS en este grupo etario, la CDV alcanzada por nosotros (90,2%) empleando el cut off ( PP VAC x 2) supera los resultados previos de Ábalos y col. (1994) -en la misma área de estudio- que indicaban un 89,6% de terneras negativas dentro de rebaños donde se vacunaba anualmente, pero con un cut off establecido en 61 % de PP con la ecuación ( PP VAC + 3 DS). Nosotros consideramos que el cut off [34,8%] obtenido por la ecuación ( PP VAC x 2) resulta adecuado a las condiciones de terreno en esta área de Chile, ya que en predios que aún registran altas prevalencias el mayor nivel de actividad de Brucella abortus hace que las terneras sufran infecciones a temprana edad. Entonces si se utilizara el cut off ( PP VAC + 3 DS) se podría incursionar en clasificaciones erróneas. Incluso nuestros resultados también indican que podría emplearse una línea de corte (-/+) con la ecuación ( PP VAC + 1 DS), la que ofrece un 85,3% de CDV –valor menor- pero que no difiere significativamente del 90,2% obtenido con la ecuación ( PP VAC x 2).

Nuestros resultados con sueros de terneras vacunadas -positivos a SAE y RB-, empleando a la vez IDD y ELISA-I con antígeno PS, revelan el valor de utilizar en forma conjunta una o dos pruebas clásicas, una no convencional y un enzimo-inmunoensayo en programas de control de brucelosis -con esquema tradicional de vacunación- ya que se conjugan Se, Sp y CDV para hacer más eficiente el diagnóstico.

En el grupo B, vacas revacunadas con dosis reducida de Cepa 19, los resultados brindados por la prueba de IDD comienzan con uri 100% de negativos al Día 0; y si bien alcanzan el 100% de CDV recién al Día 90 prv, resultan muy satisfactorios en la actualidad, ya que no existen otras pruebas que posibiliten tal discriminación de vacunados. Incluso, al Día 45 prv ofrece un rendimiento óptimo (91,7%). También cabe destacar que no se registran datos, en la bibliografía consultada, donde se haya evaluado la CDV frente a sueros de vacas rv y positivos a SAE y RB en los Días 45; 90 y 180 prv. En este sentido, Pinochet y col. (1991) emplearon el mismo antígeno PS en IDD, pero con sueros positivos y negativos a las pruebas clásicas citadas; en cambio en nuestro estudio los sueros son -exclusivamente- de animales positivos a SAE y RB como consecuencia de la revacunación.

Por consiguiente, consideramos de gran utilidad práctica el empleo de este antígeno en IDD, especialmente en aquellos predios con alta prevalencia donde se haya acudido a la revacunación de adultos con Cepa 19 para disminuir la incidencia de brucelosis, ya que permitirá eliminar con suficiente precocidad a los animales realmente infectados.

Respecto del ELISA-I con sueros de vacas rv, el Día 0 comienza clasificando como positivos -entre 31 y 42% de PP- a dos sueros dentro de los 60 que habían sido negativos a IDD. En terreno, esta incorrecta clasificación conduciría a excluir de la revacunación a algunos animales por considerarlos como infectados. En la selección de una línea de corte que permita una CDV óptima (ver Tabla 3), aparenta serla la ecuación ( PP VAC x 2) ya que ofrece un 86,7% de CDV al Día 45 prv, 90,0% al Día 90, y un 95,0% al Día 180 prv. Pero el valor de PP para ese cut off alcanza 61,4% y 57,8% en los Días 45 y 90 prv, respectivamente (ver Tabla 2). Tales cifras resultan demasiado altas en áreas donde haya elevada actividad de B. abortus, pues bovinos -con antecedentes vacunales desconocidos- y recientemente infectados pueden ubicarse debajo de ese cut off e interpretarse como negativos cuando en realidad son positivos.

Si se decidiera utilizar la ecuación ( PP VAC) se tendría un cut off adecuado para clasificar animales infectados -de 30,7% al Día 45 prv-, pero la CDV alcanza como máximo un 63,3% al Día 180 prv según se observa en Tablas 2 y 3; resulta obvio que tal capacidad carece de utilidad. Por consiguiente, de las tres ecuaciones empleadas, el cut off [33,8%] al Día 180 prv obtenido por ( PP [vac] + 1 DS) = (25,3 + 8,5) resultaría el más adecuado para usar en sueros de bovinos revacunados con Cepa 19 y procedentes de predios con alta prevalencia. No obstante la CDV que ofrece es 85,0% (Tabla 3), rendimiento poco óptimo en terreno ya que deberían transcurrir seis meses prv para lograrlo; así mismo un 15% de los animales serían incorrectamente clasificados en tal situación.

Nosotros no disponemos, a la actualidad, con otros rendimientos del PS en ELISA-I frente a sueros de vacas adultas revacunadas, procedentes de áreas con prevalencias diferentes, como para profundizar este punto de la discusión; sólo intentamos aproximaciones a la utilidad práctica que tendría el ELISA-I con este antígeno.

En cuanto al ELISA-I en sueros de vacas consideradas infectadas por serología -grupo C-, resulta oportuno señalar que además de concordar con los resultados previos de SAE, RB e IDD, el promedio de valores de PP (47,2%) con un rango de 32% a 121 % ubica a esta categoría de animales por encima -excepto en un caso- del cut off 33,8% obtenido por la ecuación ( PP VAC + 1 DS) en los sueros del grupo B. Con lo que estamos reafirmando, a pesar que la CDV disminuya en rendimiento, la importancia de escoger esa ecuación -pero recién a los 180 días prv- cuando se intente discriminar respuestas vacunales de aquellas por infección natural con B. abortus.

Por otro lado, es necesario recordar que los valores de cut off relativamente altos podrían ser debidos al conjugado policlonal utilizado en este ELISA-I; futuros estudios con un conjugado monoclonal que detecte sólo IgG, podrían disminuir el problema señalado.

Por último, basados en el comportamiento del antígeno PS en IDD frente a sueros de terneras vacunadas y vacas revacunadas, los resultados del presente estudio aparecen como altamente favorables, ya que a los 90 días posvacuna la CDV alcanza el 100%. Respecto del ELISA-I con PS, si bien los resultados no alcanzan la eficiencia de IDD, aparecen como alentadores para profundizar estudios con bovinos de áreas con diferentes prevalencias -empleando un conjugado monoclonal-, en la búsqueda de umbrales diagnósticos que le incrementen la capacidad de discriminar vacunados.

Referencias

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