Trabajos Originales

  • Función protectora en el modelo murino de la inmunoglobulina G equina antilipoproteína de 17 kDa de rhodhococcus equi

Resumen

R.equi es el agente productor de patologías más importante en el potrillo Pura Sangre de Carrera (PSC) de 0-6 meses de vida. Puede causar bronconeumonía crónica supurativa, enteritis ulcerativa y linfangitis mesentérica o superficial. Esta enfermedad tiene distribución mundial y produce una mortalidad de 322% en haras de potrillos de esta raza.

El reservorio natural de R.equi es el suelo y la infección se adquiere por la inhalación o ingestión del alimento contaminado. No es sensible a los antibióticos convencionales y hasta el momento la única forma de profilaxis conocida es la administración parenteral de suero hiperinmune anti-R.equi obtenido en caballo adulto.

Recientemente se ha identificado que las cepas virulentas expresan una lipoproteína de 17 kDa, que es inmunogénica y está codificada por un plásmido de 85-90 kb.

Es nuestro propósito la producción de anticuerpos purificados contra esta lipoproteína de 17 kDa, para estudiar su rol en la defensa del potrillo hipogamaglobulinémico y así evaluar la posibilidad de administración parenteral en el huésped susceptible en haras enzoóticas.

Palabras claves: Rhodococcus equi.

Abstract

Rhodococcus equi is the most important pathogen that affects in PSC foal (0-6 months of age) in Argentina. It causes pyogranulomatosa chronic pneumonia, ulcerative enteritis, and mesenteric or superficial, linphagitis and linphadenitis. This disease is widespread all over the world, but in Argentina it causes 3-22% morbility, with 87-92% mortality in Immunodeficient PSC foal. Distributed all over the country especially in the West of Buenos Aires Provincia, where the most important stud farms can be found. It is considered zoonosis specially in immunodeficient human and death, or fatal marker for any AIDS sick patient. R.equi is a soil organism, the foal acquires the infection by inhalation or ingestion of contaminated feed. Here Riequiisolation wasn't susceptible to conventional antibiotic, only sensitive to association Riphampicin-Ertritromicin or Gentamicin-Riphampicin, orally (with yogurt) and high dosis, parenteraly. Today the administration hyperimmune serum (1-2 litre all group of farm foals) against whole R.equi virulente, made from adult from healthy horse, is the only (hypothetic) way of control. Recently it has been established, that virulent Argentinian cultures show, a 15 - 17 - 19 kDa Lipoprotein, codified by a 85-90 kBa, very frail and termorregulated plasmid. Our purpose is produce purifield policlonal antibodies (IgG anti-lipoprotein 17 Kda) to be administered parenterally in susceptible host. For the study of role the Humoral Immunity in the colaboration and protection of the foal, and the use in minor dosis of the antibody, with better specific efficiency. For this reason, we tried it on 114 immunodeficiente Balb1c mice (using Indometacin as immunodepressor). Different concentration of equine IgG anti liprotein 17 kDa, was administered and challenged with dosis virulent R.equi. This mice serum was monitored for the IgG anti 17 -kDa levels by Elisa (17 kDa - ELISA), techniques of Immunohistochemistry and culture on infected mice lung, spleen, liver and feces. The results show protective dosis in the inmuno dificent Balb-c mice. At present we continue our job on the foal high endemic farm, with the use of the same and other dosis.

Key words: Rhodococcus equi. R.equi, anti 17 kDa IgG. Foal.

Abstract

R.equi es el agente productor de patologías más importante en el potrillo Pura Sangre de Carrera (PSC) de 0-6 meses de vida. Puede causar bronconeumonía crónica supurativa, enteritis ulcerativa y linfangitis mesentérica o superficial. Esta enfermedad tiene distribución mundial y produce una mortalidad de 322% en haras de potrillos de esta raza.

El reservorio natural de R.equi es el suelo y la infección se adquiere por la inhalación o ingestión del alimento contaminado. No es sensible a los antibióticos convencionales y hasta el momento la única forma de profilaxis conocida es la administración parenteral de suero hiperinmune anti-R.equi obtenido en caballo adulto.

Recientemente se ha identificado que las cepas virulentas expresan una lipoproteína de 17 kDa, que es inmunogénica y está codificada por un plásmido de 85-90 kb.

Es nuestro propósito la producción de anticuerpos purificados contra esta lipoproteína de 17 kDa, para estudiar su rol en la defensa del potrillo hipogamaglobulinémico y así evaluar la posibilidad de administración parenteral en el huésped susceptible en haras enzoóticas.

Palabras claves: Rhodococcus equi.

Abstract

Rhodococcus equi is the most important pathogen that affects in PSC foal (0-6 months of age) in Argentina. It causes pyogranulomatosa chronic pneumonia, ulcerative enteritis, and mesenteric or superficial, linphagitis and linphadenitis. This disease is widespread all over the world, but in Argentina it causes 3-22% morbility, with 87-92% mortality in Immunodeficient PSC foal. Distributed all over the country especially in the West of Buenos Aires Provincia, where the most important stud farms can be found. It is considered zoonosis specially in immunodeficient human and death, or fatal marker for any AIDS sick patient. R.equi is a soil organism, the foal acquires the infection by inhalation or ingestion of contaminated feed. Here Riequiisolation wasn't susceptible to conventional antibiotic, only sensitive to association Riphampicin-Ertritromicin or Gentamicin-Riphampicin, orally (with yogurt) and high dosis, parenteraly. Today the administration hyperimmune serum (1-2 litre all group of farm foals) against whole R.equi virulente, made from adult from healthy horse, is the only (hypothetic) way of control. Recently it has been established, that virulent Argentinian cultures show, a 15 - 17 - 19 kDa Lipoprotein, codified by a 85-90 kBa, very frail and termorregulated plasmid. Our purpose is produce purifield policlonal antibodies (IgG anti-lipoprotein 17 Kda) to be administered parenterally in susceptible host. For the study of role the Humoral Immunity in the colaboration and protection of the foal, and the use in minor dosis of the antibody, with better specific efficiency. For this reason, we tried it on 114 immunodeficiente Balb1c mice (using Indometacin as immunodepressor). Different concentration of equine IgG anti liprotein 17 kDa, was administered and challenged with dosis virulent R.equi. This mice serum was monitored for the IgG anti 17 -kDa levels by Elisa (17 kDa - ELISA), techniques of Immunohistochemistry and culture on infected mice lung, spleen, liver and feces. The results show protective dosis in the inmuno dificent Balb-c mice. At present we continue our job on the foal high endemic farm, with the use of the same and other dosis.

Key words: Rhodococcus equi. R.equi, anti 17 kDa IgG. Foal.

Introducción

Rhodococcus equi (R.equi), causa una neumonía piogranulomatosa crónica y diarreas en potrillos de cualquier raza. Es un germen Gram positivo, aerobio muy pleomórfico que produce un pigmento rosado-salmón cuando es cultivado en caldo Infusión cerebro-corazón (Prescott, J.F., 1991).Es un Actinomicetal nocardioforme con pared celular tipo IV. Fue aislado por primera vez por Magnnusson en 1923 y lo llamó Corynebacterium equi. Posteriormente y por sus características particulares, constituyó un género aparte y se lo llamó Rhodococcus por ser un coco rojo y equi por afectar a los equinos. El prototipo de este género lo constituye Rhodococcus rhodocrous, conocido por sus actividades metabólicas.

R.equi produce dos (2) exotoxinas, que constituyen el llamado Factor equi. Considerado un importante factor de virulencia, pero los Anticuerpos (Ac) contra él, no generan protección. (Fernández, A.S. y col., 1994 g.).

Se le dice parásito ecológico, pues sobrevive al aire libre por años, pudiéndose aislar del suelo, pasturas y heces de yeguas y potrillos sanos. (Fernández y col., 1995).

Es una enfermedad zoonótica, de individuos inmunocomprometidos, siendo causante de muerte en enfermos de SIDA. Sin embargo se lo ha descrito como productor de otras patologías en humanos. (Fernández, A.S. y col., 1994 h.).

En Argentina fue aislado desde la década del '70 en múltiples ocasiones, recuperado de lesiones purulentas de pulmón, ganglios, útero. En la actualidad, de ombligo, pústulas de piel y lesiones purulentas en cerebro, corazón, articulaciones de potrillos hipogamaglobulinémicos y en animales con niveles aceptables de Inmunidad postcalostral. (Fernández, A. S. y col., 1993).

R.equi, tiene distribución mundial y afecta haras enzoóticas, donde produce grandes desastres económicos, por el valor de los potrillos que mata. En Argentina tiene una prevalencia del 22-27% y una mortalidad del 95-97%.

Su resistencia a antibióticos convencionales hace muy difícil su tratamiento. Los quimioterápicos de elección son rifampicina y eritromicina combinados en menor grado con cloranfenicol y gentamicina. (Fernández, A.S. y col. 1995 d).

Se ha reportado que R.equi porta una serie de plásmidos: los de 80-95 kBa son termorregulados y responsables de la expresión de 15 - 17 - 19 kDa lipoproteinas (17 kDa) (VapA virulense de associated proteins) o 'baselinek, que aparece en la corrida electroforética, de los geles de poliacrialamida (Page), las cuales han sido demostradas en las cepas más letales y en los aislamientos más frescos. (Tan, C. and Prescott, 1995).

Dichas lipoproteínas son elementos diferenciales entre cepas virulentas y la vacuna. (Fernández y col., 1994 c.).

Es muy probable que el momento de mayor susceptibilidad a la infección coincida con la hipogama globulinemia transitoria del neonato equino de 0-6 meses de edad (16-20%). Gerhard, H. y col., 1986, y en caballos viejos con inmunosupresión (25-30%).

De ahí que la buena transferencia materna de anticuerpos (Ac) preformados, vía calostro intestinal, desempeñe un papel muy importante en la profilaxis de la enfermedad. (Ellefson, D. y col., 1992.).

No existe hasta el momento vacuna disponible. Se ha intentado, desde su aislamiento, la producción de bacterinas y vacunas subcelulares, hechas con parcelas de la bacteria, pero no fueron efectivas.

La mayoría de nuestros aislamientos procedieron de madres vacunadas 2-3 veces con vacunas comerciales. (Fernández, A.S. y col., 1994 e.).

Es nuestro propósito demostrar que los Acs contra la Lipoproteína de 17 kDa pueden desempeñar un rol interesante en la enfermedad y además disminuir el volumen de la dosificación, por administración de IgG específica. (Barton, C.M. y col., 1981. Brown y col., 1991).

Materiales y métodos

Preparación de la Inmunoglobulina G anti 17 kDa equina (IgG anti 17 Kda)

El inóculo fue obtenido a partir de una cepa patógena de R, equi aislada y posteriormente expandida en medio infusión cerebro corazón líquido.

Con pruebas bioquímicas y Fenómeno CAMP identificatorio (ATCC 37701). Además de SDSPAGE e Immunoglotting revelado por ELISA, contra suero de animal convaleciente a la infección (suero Co) que demarcaban la presencia de 17 kDa lipoproteína.

De este cultivo fue extraída 17 kDa por el Método de Triton X 114. Prescott, 1994.

Con esta preparación y luego de ajustar concentración de proteínas por método de Lowry L., 1959, se hizo una emulsión Adyvante hidróxido de Aluminio y se inocularon caballos mestizos en 6-8 ocasiones (1 mg/ml) de los que se extrajo asépticamente sangre para suero.

El suero se purificó por precipitación con solvente, seguida de Cromatografía con DEAE cellulosa (Sigma Co), la IgG equina total anti-17 Kda.

Luego de lo cual se hicieron los controles de rutina Inmunodifusión (pureza del antígeno) e inmunelectroforesis (pureza del anticuerpo). (Margni, R.A., 1991).

Preparación de la muestra de ratones: consistió en 114 ratones adultos sanos Balc-c.

Con el objetivo de crearles mayor susceptibilidad a R.equi, habían sido inmunodeprimidos desde una semana antes de la experiencia con Indometacina (N-metil-D Glucamina. Rhone-Merieux Lab).

A través del agua de bebida se suministró la droga, diluida primero el alcohol 95° y luego agregada al agua pH 7 (10 mg/ml). (Schwartz, R.S., 1981).

Transferencia de Anticuerpos IgG anti-17 Kda: A todos los animales se les administró 100 microlitros como dosis total y por vía intraperitoneal (IP) del:

Tratamiento 1: a 50 de ellos se los Transfundió con el equivalente de 780 mg/ml de IgO equina anti -17 kDa.

Tratamiento 2: a los 50 restantes con la mitad de concentración de IgG anti -17 kDa en solución de PBS-glicina estéril.

Tratamiento 3: los 14 ratones faltantes recibieron sólo PBS.

Desafío Entre los 1-4 días fueron desafiados con R.equi patógeno, a razón 1 x 106 células de R.equi que expresaban la proteína de 17 kDa y el pasmido de 80-90 kBa en la misma dosis vía y solución buffer.

Cinética de las Igs Transferidas

Para detectar IgG específica y establecer título se usó la Técnica de ELISA-17 kDa directa.

Para cuantificar IgG equina total, con el propósito de verificar el comportamiento de ésta se hizo ELISA cuantitativo de IgG equina (ELISA-c), pues se trata de una transferencia heteróloga.

Cinética de las lesiones y recuperación del germen

Se realizaron técnicas de Inmunohistoquímica sobre órganos blancos, pulmón e hígado de muertos, enfermos y sacrificados. (Fernández, A.S., 1995 j) y en duplicado cultivo de los mismos órganos.

Cronograma de extracciones de sangre para suero

Se extrajo sangre para suero en cada lote 24 hr, 48 hr, 3er, 7mo día 1 vez por semana hasta 58avo día, 1 vez cada 15 días hasta llegar al 120avo día.

 

Foto 1

 

Foto 2

 

Foto 3

 

 

Foto 4

 

Foto 5

Resultados

Los ratones controles murieron todos entre 3er y 7mo días, se detectaron lesiones en pulmón e hígado. Las técnicas de Inmunohistoquímica muestran las lesiones típicas del germen, que corresponden a una inflamación crónica con gran aflujo de neutrófilos alveolares, células gigantes multinucleadas y posible liberación de radicales libres; destrucción lisosonal de los fagocitos y gran deposición de piocitos.

R.equi impide la unión del fagosoma con el lisosoma, por los componentes lipídicos de su pared. Es común que R.equi sobreviva dentro de la lesión causada por su actividad. (Ishino y col., 1991).

Por lo tanto, se recuperó el germen de los mismos tejidos.

- Los animales que recibieron el Tratamiento 1, no murieron ni enfermaron y tampoco se aisló el germen de sus tejidos. Las técnicas de Inmunohistoquímica resultaron negativas. Todos ellos fueron sacrificados en los mismos tiempos en que se extraían las muestras del otro tratamiento.

Los niveles de IgG equina en mg% por c-ELISA van de títulos: 14.712 hasta los 7 días. Y decaen a 2.000 en los 123 días mientras que los títulos de ELISA-17 kDa van de 64.000 en 1-3 días y decaen abruptamente, 32.000 en 5to día, 8.000 en 7mo, 4.000 en 21avo, 1.000 en 30avo día, 500 en 45avo día, 125 en 73avo día hasta el final de la experiencia.

Describen una cinética clásica de depuración (clearence) semejante a la de los sueros hiperinmunes. (Ver foto 6).

Foto 6

- En los animales que recibieron el Tratamiento 2 enfermaron y murieron 5 ejemplares 1°-7mo día, 2 entre 7-10 días, 25 entre 21avo y 37avo día y todos están muertos para el día 45avo

Se recuperó R.equi de pulmón e hígado (cultivos positivos), que denota la banda de 17 kDa y se supone que también lleva el plásmido al igual que en controles.

Los niveles de IgG anti-17 kDa por c-ELISA en mg% van de 6.400-5.120-2.560 entre 21 ayo-44 avo día y luego decaen gradualmente 800 a los 88avo día y terminando en 400 a los 123avo días.

Los títulos de ELISA-17 kDa van de 8.000 en 1-3ero día, 2.000 en 7mo día, ascendiendo 2.000-4.000 entre 21avo-45 avo día y luego disminuyendo 125 en el día 58avo y desaparecer hasta el final de la experiencia. No es una curva de una cinética clásica (Fotos 7, 8 y 9).

 
 

Foto 7

 

 Foto 9

 

 

Foto 8

Discusión

La protección brindada por plasma hiperinmune no es novedad en la terapia del potrillo hipogamaglobulinémico fisiológico y susceptible a patógenos ambientales. (Wilkins, P.A. 1994. Fernández A.S. y col. 1995 b).

Como R.equi, lo es, debemos considerar la anterior premisa. (Zaugg, J.L., 1994).

El suero policlonal poliespecífico puede aportar los Ac y demás factores pertenecientes al Sistema Inmune Inespecífico como: opsoninas (kalicreina), factores del complemento, enzimas como lisozima, proteínas de fase aguda (PCR), productos del metabolismo celular. Jeffcott. (L.B., 1974).

Sin dejar de lado, todos los mediadores a distancia que se generan, en la Respuesta Inmune Celular como INF- gamma, beta o alfa, linfoquinas, citoquinas e integrinas. Le Blanc, M.M., 1994, que colaboran, en la destrucción del germen por sus características de intracelular facultativo.

- En los establecimientos con potrillos que padecen falla total o parcial de la transferencia pasiva de la Inmunidad materno filial (menos de 200-400 mg/dl de IgG plasmática). (Crawford, T.B., 1980 y Tizard, I., 1991), después de las 24 hr de nacido, se les deberán administrar 20 ml de plasma hiperinmune poliespecífico policlonal homólogo por kg de peso vivo. (O'Reilly J. y col., 1990. Fernández, A.S. y col., 1995a).

En la infección por R.equi, el uso de plasma hiperinmune específico anti-R.equi entero, también ha sido reportado, con fines profilácticos y terapéuticos en potrillos desafiados experimentalmente contra éste. La dosis administrada fue de 15-20 ml de plasma monoespecífico policlonal homólogo, por kg de peso vivo (2 litros) vía endovenosa.

Con respecto a la resolución de lesiones existentes, como en la evolución de la enfermedad. (Prescott, J.F., 1989).

Por lo tanto, la única forma de prevención demostrada, hasta ahora, es la administración de suero hiperinmune, proveniente de caballo sano adulto (no susceptible), inoculado con varias dosis de R.equi muerto y una última con el agente vivo. (Chaffin, M.K. y col., 1991).

La transferencia de Ac preformados no implica que se active el sistema inmune de potrillo inmunodeficiente, sino que recibe inmediata protección. (Irwin, K.M. y col., 1991, Casadevall, A. y col., 1994).

También se probó cómo era su mecanismo de acción y se determinó la administración de suero, homólogo hiperinmune anti-R.equi según plan de inmunización (Sthonehan y col., 1991) a razón de 2040 ml por kg de peso, a todo el lote de potrillos, aumenta el clearence sanguíneo del agente por opsonización, fagocitosis, fijación de complemento y neutralización. (Maddigagan, J.E. y col., 1991).

La IgG purificada homóloga podría ser de inestimable valor teniendo en cuenta que sería un reactivo biológico de poco volumen, confrontado con la anterior administración, que requiere maniobras semiológicas (volteo) y sedación por cada potrillo.

Ambas terapias brindan un tiempo escaso de cobertura 15-30 días. (Holmes, M.A. y col., 1995). Este tiempo corto, puede ser, el tiempo de maduración del sistema inmune del potrillo. (Crump L., 1994), que debe activarse y responder en forma positiva a R.equi. (Jones, W.M.A. y col., 1994).

En nuestro trabajo se administró: IgG equina total ponderada, por su especificidad y afinidad, lograda por el fenómeno de Memoria inmune. (White, S.L. y col., 1991, 1992), demostrada como inactivante de R.equi entero. (Martens, R.J. y col., 1991 y Martens, R.J. y col., 1993).

Pero aquí, la IgG equina es contra un epitope diferencial (anti-17 kDa) de R. equi, que, de acuerdo al tratamiento 1, logró proteger los ratones, al neutralizar el germen en un primer momento, lo que se refleja en los títulos de ELISA-17 kDa y el c-ELISA, en que no hubo enfermos, muertos, recuperación del germen y lesiones demostradas por Inmunohistoquímica.

Es por lo tanto una experiencia novedosa que aumenta la practicidad de la aplicación, al disminuir el volumen de ésta, con facilidad de conservación, porque el concentrado de IgG anti-17 kDa, se podría liofilizar y guardar a 4°C.

Considerando que sólo se ha usado un modelo murino, esperamos ajustar la dosis y el volumen de IgG anti-17 kDa de acuerdo al peso del potrillo.

Agradecimientos

- A CONICET (Argentina), MRC (Canadá) por solventar nuestro intercambio científico. - A la Secretaría de Ciencia y Técnica de la UNCPBA-Tandil por su soporte económico. - Al haras 'La Irenita' S.A. por su incondicional apoyo en nuestras experiencias.

Referencias

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