Comunicaciones

  • Infección de vacas gestantes con una cepa neurotrópica de herpesvirus bovino-1

Resumen

El Herpesvirus Bovino-1 (HVB-1) es uno de los principales agentes abortigénicos virales del ganado bovino. La aplicación de vacunas preparadas con virus atenuado puede inducir aborto. En América del Sur sólo se emplean vacunas preparadas con virus inactivado, por lo que los abortos atribuidos a HVB-1 se deben a infecciones naturales. Se han descripto tradicionalmente 3 tipos de HVB-1: respiratorio (HVB-1.1.), genital (HVB-1.2, clasificado en 2a y 2b), y neurotrópico (HVB-1.3 , clasificado en 3a y 3b), que se distinguen mediante el uso de anticuerpos monoclonales, análisis de los perfiles de proteínas y ácidos nucleicos virales, aunque la relación signos clínicos-tipo viral no es unívoca. No se ha establecido aún si los 3 suptipos de HVB-1 o sólo algunos de ellos poseen capacidad abortigénica. En este trabajo presentamos los resultados de la inoculación de vacas gestantes en distintos estadios de preñez con la cepa encefalitogénica argentina A-663 (subtipo 1.3b). La infección no indujo aborto, aunque los 5 animales inoculados presentaron signos clínicos (no neurológicos), seroconvirtieron, y secretaron virus correspondiente al subtipo viral inoculado.

Palabras claves: Herpevirus Bovino-1, Virus Neurotrópico, Aborto.

Abstract

Bovine Herpesvirus-1 (BHV-1) is the most important viral cause of bovine abortion. Modified live vaccines against this virus are abortigenic, since all BHV-1 vaccines used in South America are inactivated, then abortions attributable to BHV-1 are induced by field strains. BHV-1 isolates belong to one of three subtypes: respiratory (BHV-1.1), genital (BHV-1.2, classified in 2a and 2b), and neurotropic (BHV-1.3, classified in 3a and 3b), which can be distinguished by monoclonal antibodies reactivity, proteins patterns and nucleic asid restriction maps. It is not known whether all three subtypes are abortigenic,or only one or two of them. This paper presents the results of the inoculation of 5 pregnant cows between 17-34 weeks of gestación with the Argentine strain A-663 (subtype 1.3b). One cow was seropositive for BHV-1. The animals showed symptoms of mild disease (non neurological), seroconverted and shed subtype 1.3b virus in their nasal or ocular secretions. No abortions were observed.

Key words: Bovine Herpesvirus-1-, Abortion, Neurotropic virus.

Abstract

El Herpesvirus Bovino-1 (HVB-1) es uno de los principales agentes abortigénicos virales del ganado bovino. La aplicación de vacunas preparadas con virus atenuado puede inducir aborto. En América del Sur sólo se emplean vacunas preparadas con virus inactivado, por lo que los abortos atribuidos a HVB-1 se deben a infecciones naturales. Se han descripto tradicionalmente 3 tipos de HVB-1: respiratorio (HVB-1.1.), genital (HVB-1.2, clasificado en 2a y 2b), y neurotrópico (HVB-1.3 , clasificado en 3a y 3b), que se distinguen mediante el uso de anticuerpos monoclonales, análisis de los perfiles de proteínas y ácidos nucleicos virales, aunque la relación signos clínicos-tipo viral no es unívoca. No se ha establecido aún si los 3 suptipos de HVB-1 o sólo algunos de ellos poseen capacidad abortigénica. En este trabajo presentamos los resultados de la inoculación de vacas gestantes en distintos estadios de preñez con la cepa encefalitogénica argentina A-663 (subtipo 1.3b). La infección no indujo aborto, aunque los 5 animales inoculados presentaron signos clínicos (no neurológicos), seroconvirtieron, y secretaron virus correspondiente al subtipo viral inoculado.

Palabras claves: Herpevirus Bovino-1, Virus Neurotrópico, Aborto.

Abstract

Bovine Herpesvirus-1 (BHV-1) is the most important viral cause of bovine abortion. Modified live vaccines against this virus are abortigenic, since all BHV-1 vaccines used in South America are inactivated, then abortions attributable to BHV-1 are induced by field strains. BHV-1 isolates belong to one of three subtypes: respiratory (BHV-1.1), genital (BHV-1.2, classified in 2a and 2b), and neurotropic (BHV-1.3, classified in 3a and 3b), which can be distinguished by monoclonal antibodies reactivity, proteins patterns and nucleic asid restriction maps. It is not known whether all three subtypes are abortigenic,or only one or two of them. This paper presents the results of the inoculation of 5 pregnant cows between 17-34 weeks of gestación with the Argentine strain A-663 (subtype 1.3b). One cow was seropositive for BHV-1. The animals showed symptoms of mild disease (non neurological), seroconverted and shed subtype 1.3b virus in their nasal or ocular secretions. No abortions were observed.

Key words: Bovine Herpesvirus-1-, Abortion, Neurotropic virus.

Introducción

El Herpesvirus Bovino-1 (HVB-1) es el agente causal de la rinotraqueítis infecciosa bovina y de la vulvovaginitis pustular infecciosa (Infectious Bovine Rhinotracheitis, IBR, Infectious Pustular Vulvovaginitis, IPV), y uno de los principales agentes abortigénicos virales del ganado bovino (Kirkbride, 1992; Murray, 1990; Wyler y col., 1989).

El aborto es una de las manifestaciones clínicas producidas por este virus, que puede presentar además signos respiratorios oculares, genitales y neurológicos (Wyler y col., 1989). La muerte fetal seguida de aborto es muy frecuente si la infección se produce durante el primer tercio de la gestación, y es factible aún durante el séptimo u octavo mes de gestación, cuando el feto es plenamente capaz de elaborar una respuesta de anticuerpos (Gibbs & Rweyemamu, 1977; Ludwing, 1983). La aplicación de vacunas preparadas con virus atenuado puede inducir aborto tanto en los animales vacunados como en vacas gestantes no vacunadas que convivan con aquéllos (McFeely y col., 1968; Kelling y col., 1973). En Sudamérica sólo se usan vacunas preparadas con virus inactivado, por lo que los abortos atribuidos a HVB-1 se deben a infecciones naturales. En Argentina se han detectado abortos por HVB-1 desde 1964 (Epstein y col., 1972). En algunos establecimientos la vacunación contra HVB-1 disminuyó drásticamente el porcentaje histórico de pérdidas por abortos (F.M. Fernández, datos no publicados).

Sobre la base de las manifestaciones clínicas de la infección, se han descripto tradicionalmente 3 tipos de HVB-1: respiratorio, genital, y neurotrópico (Wyler y col., 1989). Los métodos serológicos clásicos no permiten establecer diferencias entre los distintos aislamientos o cepas de HVB-1, por lo que no es posible mediante esas técnicas, relacionar signos clínicos con cepas virales. En los últimos años el uso de anticuerpos monoclonales (Actos), el análisis de los perfiles electroforéticos de las proteínas virales, y el tratamiento de los ácidos nucleicos virales con enzimas de restricción permitió diferenciar tres subtipos de HVB-1: HVB-1.1, HVB-1.2 (subdividido en 2a y 2b), y HVB-1.3 (subdividido en 3a y 3b) que se relacionan con las manifestaciones clínicas (Brake y Studdert, 1985; Engels y col., 1981; Metzler y col., 1986).

Aunque la relación signos clínicos-tipo viral no es unívoca, se estableció que el HVB-1.1 está asociado a signos respiratorios, el HVB-1.2 a cuadros genitales, y el HBV-1.3 a cuadros neurológicos (Metzler y col., 1986). La mayoría de las cepas que se aíslan en el campo corresponde a los tipos 1 y 2; el tipo 3 corresponde específicamente a casos neurológicos en terneros (Bagust y Clark, 1972; Carrilloy col., 1983; Suárez Heinlein y col., 1993). Recientemente el HVB-1.3 ha sido reclasificado como un nuevo tipo en el grupo de herpesvirus bovinos, el HVB-5 (Roizman y col., 1992).

Con respecto a la capacidad abortigénica, no se ha establecido aún si la poseen los 3 subtipos de HVB-1, o sólo algunos de ellos. Se ha demostrado que HVB-1.1 es abortigénico, y que la eliminación del gen correspondiente a la enzima timidina kinasa puede abolir esa capacidad (Miller y col., 1991 a, 1988). Se ha establecido que el subtipo 2b no es abortigénico (Miller y col., 1991b), pero no fue posible arribar a ninguna conclusión con respecto a HVB-1.2a, que produjo abortos en una experiencia pero no en otra similar (Miller y col., 1991b; 1988). No se realizaron experiencias con el subtipo 3.

En este trabajo presentamos los resultados de la inoculación de vacas gestantes en distintos estadios de preñez con la cepa encefalitogénica A-663 (subtipo 1.3b) (Schudel y col., 1986; Metzler y col., 1986). La infección no indujo aborto, aunque los 5 animales inoculados presentaron signos clínicos (no neurológicos), seroconvirtieron, y secretaron virus correspondiente al subtipo viral inoculado.

Materiales y métodos

Virus y células: Se utilizó la cepa A-663 de HVB-1, aislado de un caso de encefalitis en terneros, prototipo de HVB-1.3b (Carrillo y col., 1983; Schudel y col., 1986; Metzler y col., 1986). La suspensión viral empleada tenía 12 pasajes por cultivos primarios de testículo fetal bovino (TFB). Su título era 107,2 DICT50/ml, y fue caracterizada como perteneciente al tipo HVB-1.3 por reacción con AcMs y perfiles de proteínas (Suárez Heilein y col., 1993). Para aislamiento viral se utilizaron cultivos secundarios de TFB mantenidos con MEM-Eagle y 5% de suero fetal bovino.

Animales: Se emplearon 5 vacas preñadas entre las 17 y 34 semanas de gestación (Cuadro 1). Con excepción de un animal (N° 438, 17 semanas de gestación) todos eran seronegativos para anticuerpos contra HVB-1.

CUADRO 1 EDAD GESTACIONAL Y VÍAS DE INOCULACIÓN DE VACAS PREÑADAS CON 5 x 107,2 DICT50 DE HVB-1 CEPA A-663

Animal N° Tiempo de    gestación***   Vía de   inoculación*
438** 17 ev; im; io
428 19 ev
447 28 in; io
440 34 ev
452 32 ev
***semanas *ev: endovenosa; im: intramuscular; io: intraocular **El animal 438 tenía anticuerpos contra HVB-1 detectable por inmunofluorescencia.
Detección de anticuerpos: Se empleó la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI), usando células de TFB infectadas con HVB-1.1 (cepa LA), fijadas con acetona y conservada a -20°C. Para establecer la presencia de anticuerpos antes de la inoculación se realizó un ensayo de seroneutralización con la técnica de suero constante-virus variable.

Aislamiento viral: Se realizó la inoculación del material de hisopados en cultivos de TFB sembrados en microplacas de 96 pozos (8 pozos por hisopado). Los cultivos se mantuvieron durante 7 días, observándose diariamente para detectar efecto citopático (ECP). En los casos en que no se observó ECP a los 7 días postinfección (pi) del cultivo se cosechó el medio sobrenadante y se realizaron hasta 2 pasajes ciegos. En todos los casos en que se detectó ECP el sobrenadante correspondiente se inoculó en monocapas de TFB para caracterizar el aislamiento como HVB-1 por IFI.

Anticuerpos monoclonales: Para la caracterización de los aislamientos se utilizó sobrenadante de cultivo de los hibridomas productores de los AcMs 1111, que reacciona con todos los tipos de HVB-1, el AcM 60, que reacciona con los tipos 1 y 2, y el 2514, que reacciona sólo con el tipo 3 (Suárez Heinlein y col., 1993).

Diseño experimental: Los animales en estudio fueron inoculados con 5 ml de suspensión viral (107,2 DICT50/ml) por distintas vías: endovenosa (ev); intramuscular (im); intraocular (io); e intranasal (in). (Cuadro 1). Una vez inoculados se mantuvieron en un recinto cerrado 14 días. Diariamente se registraron los signos clínicos y la temperatura rectal, y se tomaron muestras de sangre para detectar seroconversión, e hisopados nasales y oculares para realizar aislamiento viral. El material de hisopados se suspendió en 1 ml de solución salina de Hanks, se clasificó por centrifugación y se conservó a -70°C hasta su uso.

Resultados y discusión

Los 5 animales inoculados presentaron signos clínicos consistentes en secreción nasal y/o ocular, con algunos casos de conjuntivitis, a partir del primer o segundo día pi (Cuadro 2). En ningún caso se registró aumento de la temperatura rectal. El animal 438, que tenía anticuerpos anti-HVB-1 en el momento de la inoculación, presentó un cuadro clínico leve.

Aunque no pudo establecerse una relación definitiva entre tiempo de preñez, vía de inoculación y aparición e intensidad de los signos clínicos, se observó que en los 3 animales que se encontraban en el último tercio de gestación los mismos fueron más intensos y se mantuvieron durante más tiempo (animales N° 447, 440 y 452, cuadro 2).

Con respecto a la influencia de la vía de inoculación , los signos de mayor intensidad fueron producidos por inoculación por vía in e io simultáneamente (animal N° 447, de 28 semanas de preñez; cuadros 1 y 2).

La vía ev se empleó en 3 animales de 19, 32 y 34 semanas de gestación, y el efecto de la infección parecería estar relacionado con el momento de la gestación: en el animal N° 428, de 19 semanas de gestación, se observó conjuntivitis leve y hubo seroconversión, pero no se detectó eliminación de virus (Cuadro 2). En los animales de mayor tiempo de preñez (N° 452 y N° 440, de 32 y 34 semanas respectivamente), los signos clínicos y el número de aislamientos realizados fueron similares a los del animal N° 447, inoculado simultáneamente por vía in e io (Cuadro 2), lo que sugeriría que los animales con mayor tiempo de gestación serían más susceptibles a la infección.

CUADRO 2

 SIGNOS CLINICOS , DETECCIÓN DE VIRUS Y SEROCONVERZACIÓN DE VACAS PREÑADAS INOCULADAS CON HVB-1 CEPA A-663, EN FUNCIÓN DEL TIEMPO OSTINFECCIÓN  INOCULADAS CON HVB-1 CEPA A-663, EN FUNCIÓN DEL TIEMPO POSTINFENCIÓN

Día pi

Animal Nº

438

 428

 447

 440

   452

Sig- nos#

Aislami- ento@

Sero- logía

Sig- nos

Aisla- miento

Sero- logía

Sig- nos

Aisla- miento

Sero- logía

Sig- nos

Aisla- miento

Sero- logía

Sig- nos

Aisla- miento

Sero- logía

0

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n*

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3

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4

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5

o

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o

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o

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6

o

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o

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n

NR

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o

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7

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+

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8

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n,o

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n

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9

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+

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+

n,o

 

+

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n

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10

NR

-

+

NR

 

+

NR

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+

-

 

+

NR

 

+

11

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o

 

+

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+

12

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-

 

+

70

   

+

   

+

   

+

   

+

   

+

120

   

+

   

+

   

+

   

+

   

+

#: n: secreción nasal; o: secreción ocular. @:-: no se detectó virus después de un pasaje por cultivos de TFB; +o: aislamiento de hisopadoocular después de un pasaje por TFB. § : NR: No registrado.

Miller y col. (1991 b) sugirieron que la infección experimental con HVB-1 ws más virulenta por vía ev que in, pero en nuestro caso no ocurrió así, salvo en los animales 440 y 452, ya mencionado. Debe tenerse en cuenta, sin embargo, que esta observación se realizó sobre un número reducido de animales, por lo que no puede derivarse una conclusión definitiva.

En ningún caso se observaron signos neurológicos, a pesar de que la suspensión viral utilizada provenía de un aislamiento de un caso de encefalitis, y correspondía al subtipo 1,3 según la reactividad con AcMs. En las infecciones con HVB-1 la relación tipo viral-signos clínicos no es unívoca, y se han aislado tanto cepas de HVB-1.1 de casos neurológicos, como de HVB-1.3 de casos respiratorios (Suárez Heinlein y col., 1993). Además, la enfermedad neurológica producida por las cepas encefalitogénicas de HVB-1 es típica de terneros y no de animales adultos (Carrillo y col., 1983; 1986). Resultados de nuestro Instituto indican que la reproducción experimental de los cuadros nerviosos sólo es posible en animales jóvenes (datos no publicados).

Todos los animales fueron seropositivos por IFI a partir del día 5-8 pi, hasta los 120 días pi, en que se realizó la última determinación (Cuadro 2).

De los hisopados nasales u oculares obtenidos entre los días 1-2 y 4-5 pi de las vacas que desarrollaron anticuerpos detectuales por IFI (con excepción de la 428), se aislaron agentes citopáticos en un solo pasaje por cultivos de TFB (Cuadro 2). Los aislamientos fueron caracterizados como HVB.1 por reacción de IFI. La mayor cantidad de aislamientos se obtuvo del animal 447, que fue el que presentó signos clínicos más intensos y de mayor duración (Cuadro 2).

La caracterización de aislamientos con AcMs demostró que pertenecían al subtipo viral inoculado, HVB-1.3 (Cuadro 3). Los aislamientos obtenidos de secreciones del animal 438, seropositivo para HVB-1 (es decir que había sufrido una infección previa con el virus), fueron una mezcla de los tipos HVB-1.1./2 y de HVB-1.3. Whetstone y col. (1989b) demostraron experimentalmente, mediante análisis molecular, que animales infectados con un subtipo de HVB-1 y sobreinfectados con un subtipo diferente secretan una mezcla de los dos subtipos virales. El animal 438 correspondía a esta situación, por lo que los aislamientos obtenidos reaccionaron tanto con el AcM 60 (reactivo con los 3 subtipos de HVB-1), como con el 1111 (reactivo con los subtipos 1 y 2) y el 2514 (reactivo con HVB-1.3). La no detección de virus en las secreciones de la vaca 428, pese a la observación de signos clínicos y al desarrollo de anticuerpos, puede atribuirse a eliminación de una cantidad de virus muy baja (los signos clínicos fueron muy leves), no detectable por la técnica de aislamiento empleada.

CUADRO 3 REÁCTIVIDAD DE AISLAMIENTOS DE HVB-1 CON LOS ANTICUEPOS MONOCLONALES 60, 1111 Y 2514 (IFI)

Animal N°

Aislamiento** (origen/dpi)

Anticuerpo Monoclonal*

1111

60

2514

438

n/3

+

+

+

447

n/3

+

-

+

440

o/3

+

-

+

452

n/2

+

-

+

* 11: reactivo con HVB -1.1, 1.2 y 1.3; 60: recativo con HVB-1.1 y 1.2;  2514: reactivo con HVB-1.3. **n: nasal; o: ocular; dpi: días postinoculación.

No se produjeron abortos. Los nacimientos fueron a término, no observándose ninguna anomalía en los terneros. Aunque la suspensión viral empleada tenía 12 pasajes por cultivos celulares, que pueden haber modificado la o las porciones del genoma relacionadas con la capacidad abortigénica, sin modificar la reactividad con el AcM 2514. no se considera probable una alteración de este tipo, ya que se ha demostrado que tanto el genoma de HVB-1.1 como el de HVB-1.2 son estables in vitro (Whetstone y col., 1989 a, b; Misra y col., 1983).

En Argentina se ha aislado el subtipo HVB-1.3b de fetos abortados (Giavedoni y col., 1988; Suárez Heinlein y col., 1993), pero no se han realizado experiencias para establecer si este subtipo viral es abortigénico. Con respecto a este punto, deben considerarse los resultados contradictorios obtenidos con la cepa Fl de HVB-1.2a, aislada de un feto abortado, que produjo abortos en una experiencia y no en otra similar (Miller y col., 1988; 1991 a), y que enfatizan la necesidad de repetir las experiencias de este tipo antes de llegar a una conclusión definitiva. La inoculación de 7 vacas en diferentes estadios de preñez con la cepa chilena FAF-82 produjo signos de enfermedad respiratoria, pero no indujo abortos (Moraga y col., 1991). En este último caso la cepa inoculada no había sido caracterizada con respecto al subtipo de pertenencia, mientras que tanto las cepas utilizadas por Miller y col. (1991 a, b; 1988)., como la A-663 empleada en el presente estudio (Suárez Heinlein y col., 1993), fueron caracterizadas a nivel molecular.

Esta limitada experiencia indicaría que la suspensión viral empleada no es abortigénica, pero deberían realizarse experiencias con mayor número de animales y con otras cepas del subtipo 3 de HVB-1, así como un seguimiento exhaustivo de campo en casos naturales, para establecer si el HVB-1.3 es abortigénico.

AGRADECIMIENTOS

A los Dres. Néstor Fondevila y Fernando Fernández, por su colaboración en la observación clínica. Al Sr. Vera por su colaboración en el manejo de los animales.

Referencias

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Recibido el 29 de Agosto de 1994, aprobado el 31 de octubre de 1994.