Trabajos Originales

  • Características antigénicas de cuatro aislados virales obtenids de pollos broilers con hepatitis con cuerpos de inclusión

Resumen

Se estudiaron las relaciones antigénicas entre 4 aislados virales de hepatitis con cuerpos de inclusión (HCI) y de ellos con 2 serotipos de adenovirus aviares (AVA) de referencia. Los aislados virales identificados como 39-Malloco, 43-Melipilla, 48Mostazal y 86-Pintana habían sido previamente obtenidos de hígado de pollos broiler de 35 y 40 días de edad provenientes de planteles afectados por brotes de HCI.

La infectividad de los aislados 39, 43, 48 y 86, medida en huevos embrionados (HE) libres de patógenos específicos (SPF), demostró títulos de 105,3, 105,4, 105,2 y 108,6 DLE50/MI respectivamente. Al medir la infectividad en cultivos de células de riñón de embrión de pollo (CCREP) los títulos fueron de 105,8, 104,9, 105,3 y 104,8 DIC50/ml.

Se efectuaron pruebas de seroneutralización (SN) cruzada en CCREP entre los aislados 39, 43, 48 y 86, y las cepas AVA de referencia serotipo 1 y 3. Los títulos de SN obtenidos fueron analizados de acuerdo a la fórmula de Archetti y Horsfall para establecer la relación antigénica entre los aislados. Éstos demostraron no tener ninguna relación antigénica con los serotipos 1 y 3. Los aislados 39-Malloco y 43-Melipilla no están relacionados antigénicamente entre sí (0%). Una relación parcial se determinó entre los aislados 86-Pintana y 43-Melipilla (49%) y entre los aislados 86-Pintana y 48-Mostazal (50%). Por último se determinó un alto grado de relación antigénica entre los aislados 48 y 43 con un 70%, entre los aislados 39 y 86 con un 88% y entre los aislados 39 y 48 con un 100%.

Palabras claves: Virus, pollos broiler, hepatitis con cuerpos de inclusión.

Abstract

Antigenic characteristics among four inclusion. body hepatitis (IBH) viral isolates were determined. Isolates identified as 39 Malloco, 43-Melipilla, 48-Mostazal and 86-Pintana were previously obtained from dead broiler chickens submitted from different poultry operations.

Infectivity on SPF chicken-embryonating egg (CEE) for isolates 39, 43, 48 and 86 showed titers of 105.3, 105.4, 105.2 and 108.6 ELD 50/ml respectively. The same isolates inoculated in chicken-embryo kidney cells (CEKC) showed titers of 105.8, 104.9 105.3 and 104.8 TCID50/ml. Cross virus- neutraliza tion (VN) tests were carried out to determine antigenic relatedness among these IBH-isolates and among these 4 isolates arad avian adenovirus (AAV) serotipes 1 and 3 strains. Isolates 39, 43, 48 and 86 showed izo antigenic relatedness with AAV serotipe 1 nor 3 when VN values were analized using the Archetti and Horsfall formula.

Key words: Virus, broiler chickens, inclusion body hepatitis.

 

Abstract

Se estudiaron las relaciones antigénicas entre 4 aislados virales de hepatitis con cuerpos de inclusión (HCI) y de ellos con 2 serotipos de adenovirus aviares (AVA) de referencia. Los aislados virales identificados como 39-Malloco, 43-Melipilla, 48Mostazal y 86-Pintana habían sido previamente obtenidos de hígado de pollos broiler de 35 y 40 días de edad provenientes de planteles afectados por brotes de HCI.

La infectividad de los aislados 39, 43, 48 y 86, medida en huevos embrionados (HE) libres de patógenos específicos (SPF), demostró títulos de 105,3, 105,4, 105,2 y 108,6 DLE50/MI respectivamente. Al medir la infectividad en cultivos de células de riñón de embrión de pollo (CCREP) los títulos fueron de 105,8, 104,9, 105,3 y 104,8 DIC50/ml.

Se efectuaron pruebas de seroneutralización (SN) cruzada en CCREP entre los aislados 39, 43, 48 y 86, y las cepas AVA de referencia serotipo 1 y 3. Los títulos de SN obtenidos fueron analizados de acuerdo a la fórmula de Archetti y Horsfall para establecer la relación antigénica entre los aislados. Éstos demostraron no tener ninguna relación antigénica con los serotipos 1 y 3. Los aislados 39-Malloco y 43-Melipilla no están relacionados antigénicamente entre sí (0%). Una relación parcial se determinó entre los aislados 86-Pintana y 43-Melipilla (49%) y entre los aislados 86-Pintana y 48-Mostazal (50%). Por último se determinó un alto grado de relación antigénica entre los aislados 48 y 43 con un 70%, entre los aislados 39 y 86 con un 88% y entre los aislados 39 y 48 con un 100%.

Palabras claves: Virus, pollos broiler, hepatitis con cuerpos de inclusión.

Abstract

Antigenic characteristics among four inclusion. body hepatitis (IBH) viral isolates were determined. Isolates identified as 39 Malloco, 43-Melipilla, 48-Mostazal and 86-Pintana were previously obtained from dead broiler chickens submitted from different poultry operations.

Infectivity on SPF chicken-embryonating egg (CEE) for isolates 39, 43, 48 and 86 showed titers of 105.3, 105.4, 105.2 and 108.6 ELD 50/ml respectively. The same isolates inoculated in chicken-embryo kidney cells (CEKC) showed titers of 105.8, 104.9 105.3 and 104.8 TCID50/ml. Cross virus- neutraliza tion (VN) tests were carried out to determine antigenic relatedness among these IBH-isolates and among these 4 isolates arad avian adenovirus (AAV) serotipes 1 and 3 strains. Isolates 39, 43, 48 and 86 showed izo antigenic relatedness with AAV serotipe 1 nor 3 when VN values were analized using the Archetti and Horsfall formula.

Key words: Virus, broiler chickens, inclusion body hepatitis.

 

Introducción

Hembolds y Frazier (1963) describieron por primera vez la hepatitis con cuerpos de inclusión (HCI) como una patología que afectaba a pollos broilers con una súbita aparición de mortalidad y una severa inflamación, necrosis y degeneración del hígado acompañada por la presencia de cuerpos de inclusión intranucleares (CII) en los hepatocitos.

La HCI es una enfermedad infectocontagiosa que afecta principalmente a pollos broilers entre 3 y 9 semanas de edad (McFerran y Stuard, 1990), pudiendo, sin embargo, afectar a aves de 7 días de edad (Barr y Scott, 1988) (Grimes, 1992). Se ha visto que esta patología afecta también a pollitas Leghorn de reemplazo (Bickford, 1972) y reproductoras broilers (Hidalgo, 1990).

En todos los casos la patología está caracterizada por un aumento brusco en la mortalidad hasta el cuarto o quinto día, que usualmente se detiene al sexto o séptimo día, pudiendo ocasionalmente prolongarse por una o dos semanas. La mortalidad varía entre 2-10%, pudiendo llegar ocasionalmente hasta un 30% (Barr y Scott, 1988) y un 40% (Grimes, 1992).

Cepas pertenecientes a los diferentes serotipos de los adenovirus aviares (AVA) del grupo 1, presentes entre la población avícola mundial, han sido asociados a HCI.

En Chile algunas explotaciones de pollos broiler demuestran prevalencia de HCI, que se presenta en forma recurrente, en ocasiones provocando alta mortalidad (Hidalgo, 1990).

En Chile la HCI comenzó a reconocerse desde 1968 por exámenes de necropsia. Posteriormente fue confirmada por el hallazgo de CII en los hepatocritos de hígados de pollos broilers afectados (Rosende y col., 1975). Hidalgo y col., (1984) realizaron el primer aislamiento y caracterización de un adenovirus del grupo 1 obtenido de hígado de pollos broiler de 30 días afectados de HCI. En 1986, Cubillos y col., comunican el aislamiento y caracterización morfológica y serológica de AVA obtenidos de dos brotes de HCI en pollos broiler.

La gran variación antigénica de las cepas de AVA asociadas a brotes de HCI en el mundo y los frecuentes diagnósticos clínicos y patológicos de esta enfermedad en el país, señalan la importancia de realizar estudios de aislamiento y de caracterización antigénica de aislados virales de brotes de HCI que permiten orientar estrategias de control o prevención de esta enfermedad.

Este trabajo se refiere al estudio de las características antigénicas de 4 aislados virales obtenidos de brotes de HCI en diferentes planteles de pollos broilers (Hidalgo y col., 1993).

  Financiado por proyecto Fondecyt 91-1181.

Materiales y métodos

Aislados virales de campo

Los aislados virales fueron obtenidos a partir de hígados de pollos broiler de 35 y 40 días de edad provenientes de planteles afectados por brotes de HCI. El aislamiento e identificación de estos adenovirus aviares denominados 39-Malloco, 43-Melipilla, 48-Mostazal y 86-Pintana fueron comunicados previamente (Hidalgo y col., 1993).

Adenovirus aviares y sueros inmunes de referencia

Las cepas del grupo 1 de AVA, que se indican a continuación fueron adquiridas a SPAFAS INC., Norwich, Conn. USA: cepa CELO-Phelps (AVA serotipo 1), cepa AVA serotipo 1 y cepa AVA serotipo 3 (Calnek y Cowen, 1975). 

Los sueros hiperinmunes (SHI) contra los serotipos 1 y 3 de AVA fueron del mismo origen.

Sueros hiperinmunes contra aislados de campo

Para la preparación de los SHI contra cada uno de los aislados de campo de HCI 39, 43, 48 y 86, se emplearon grupos de 4 pollos libres de patógenos específicos (SPF) de 30 días de edad mantenidos en aisladores tipo Horsfall, que fueron inoculados simultáneamente por vía intramuscular y ocular con 0,3 ml de una suspensión de cada aislado viral previamente titulado en huevos embrionados (HE)SPF. Un segundo estímulo fue aplicado en la misma forma a los 15 días. Dos semanas después las aves fueron sangradas por punción cardíaca. El suero obtenido fue inactivado a 56°C por 30 min y mantenido en congelación a -30°C hasta su uso (Calnek y Cowen, 1975).

Preparación de cultivos celulares

Para la preparación de cultivos celulares de riñón de embrión de pollo (CCREP), se emplearon HE-SPF de 18 días de incubación (HY-VAC Laboratory Eggs Co., Gowrie, Iowa, USA). Los riñones fueron extraídos, picados, lavados con PBS y tratados con tripsina al 0,2% hasta lograr una completa disgregación del tejido. Este material fue filtrado empleando una gasa estéril y centrifugado a 65 x g por 10 min. El 'pellet' obtenido fue lavado con PBS y luego sometido a otra centrifugación. Este segundo 'pellet' fue resuspendido en medio de crecimiento (M199 con 10% SFB) y teñido con Azul Tripán 0,4% para un conteo de células (Rosenberger y col., 1974).

Los cultivos preparados en botellas plásticas de 25 cm2 (Nunc) sembrados con 7 ml de una suspensión celular conteniendo 5-7 x 105 cél/ml y en microplacas para cultivo celular de 96 orificios (Nunc) con 100 µl por orificio de una suspensión celular con 7-9 x 105 cél/ml. Estos cultivos se mantuvieron en incubación a 37°C con 5% de CO2.

Titulación en HE-SPF

Diez HE-SPF de 7 días de incubación fueron inoculados con 0,2 ml de cada aislado en estudio, vía saco vitelino (VS) (Stein, 1975). Otros 5 HE-SPF de igual edad, inoculados con diluyente estéril, constituyeron los controles.

Los HE se incubaron a 37°C durante 10 días y se controlaron diariamente para detectar mortalidad. La mortalidad de embriones ocurrida después de las 24 horas PI se consideró específica (Winterfield y col., 1973). A estos embriones se les cosechó el vitelo, que fue tratado con cloroformo y centrifugado a 550 x g por 15 min. El sobrenadante conteniendo los aislados fue recolectado e inoculado en un segundo pasaje. El vitelo cosechado, fue alicuotado y congelado a -30°C hasta su uso.

Empleando la misma metodología, las cepas de AVA de referencia también fueron sometidos a 2 pasajes en HE-SPF.

Para titular la infectividad de los aislados de campo y cepas de referencia, se efectuaron diluciones logarítmicas en base 10 (desde -1 a -8) del vitelo infectado con cada uno de ellos. Se inoculó 0,1 ml de cada dilución en 5 HE-SPF de 7 días de incubación vía SV (Winterfield y col., 1973). Estos HE fueron mantenidos y controlados según metodología antes mencionada.

La dilución viral que provocó la muerte del 50% de los embriones, representó la dosis letal embrión 50% (DLE50), calculado según el método de Reed y Müench (1938).

Titulación viral en CCREP

Para medir la infectividad de los aislados de campo y las cepas de referencia, 50 μl de diluciones logarítmicas en base 5 de cada virus, previamente sembrado en pasajes primarios en CREP en botellas, sé depositaron en cuadruplicado en microplacas para titulación que previamente contenían 50 μl por orificio de una suspensión de células renales. En el caso de los controles de virus y de células, las diluciones virales fueron reemplazadas por virus sin diluir y por medio de crecimiento respectivamente (Grimes y col., 1976).

El título viral correspondió a la dilución de virus capaz de producir efecto citopático (ECP) en el 50% de los cultivos, representado por la dosis infectante cultivo 50% por ml (DIC 50/ml) calculado según el método de Reed y Müench (1938).

Las microplacas fueron mantenidas en incubación según metodología señalada anteriormente. La monocapa celular fue observada diariamente para la detección de ECP.

Prueba de seroneutralización cruzada

Los aislados de campo y las cepas de referencia fueron confrontados con sus SHI homólogos y heterólogos en pruebas de SN cruzada en CCREP en microplaca de acuerdo a Grimes y King (1977).

Ocho diluciones logarítmicas en base 2 de cada suero fueron preparadas en tubos con M-199 más 2% SFB. Veinticinco ul de cada una de estas diluciones fueron depositados en los orificios de una microplaca. Posteriormente, 25 μl de cada suspensión viral, conteniendo 300 DIC50/25 μl fue agregado por orificio. Después de una hora de incubación a 37°C, se le adicionó 50 μl de suspensión celular a cada mezcla suero-virus. El ensayo consideró además controles de virus, de suero y de células.

Los CCREP fueron observados diariamente por 72 horas y finalmente teñidos con una solución de cristal violeta para detectar ECP.

Cada SN se realizó en triplicado correspondiendo el resultado de cada suero a la media geométrica de las 3 pruebas. Se consideraron válidos los resultados cuando los controles de virus mostraron un rango de 30-300 DIC50. El título neutralizante correspondió al valor recíproco de la mayor dilución del suero capaz de neutralizar en un 80 % o más el ECP inducido por cada virus en la monocapa celular.

Criterio de tipificación

Para establecer el grado de relación antigénica entre los aislados de campo y las cepas de referencia, a partir de los valores obtenidos en la prueba SN, se empleó la fórmula de Archetti y Horsfall (1950) (Grimes y King, 1977; Grimes y col., 1977; McFerran y Connor, 1977.

Resultados

SHI contra aislados de campo

Cada uno de los SHI producidos contra los aislados 39-Malloco, 43-Melipilla, 48-Mostaza] y 86-Pintana reaccionaron en la prueba de inmunodifusión en gel-agar mostrando líneas de precipitación en relación de identidad contra el antígeno CELO y su respectivo antígeno homólogo.

Titulación en HE-SPF

El título viral de los aislados de campo y cepas de referencia al segundo pasaje en HE-SPF muestra títulos de 105,3, 105,4, 105,2 y 108.6 DLE50/ml para los aislados 39-Malloco, 43-Melipilla, 48-Mostazal y 86-Pintana respectivamente. Para la cepa CELO y serotipos 1 y 3 los títulos obtenidos fueron de 106.7, 105,4 y 105,2 DLE50/ml respectivamente.

Titulación en CCREP

El título infectante obtenido en CCREP en microplaca para los aislados 39-Malloco, 43-Melipilla, 48-Mostazal y 86-Pintana fue de 105,8, 104.9, 105,3 y 104,8 DIC50/ml respectivamente. Títulos de 105,8, 105,9 y 105,9 DIC50/ml se obtuvieron para las cepas de referencia CELO y serotipos 1 y 3, respectivamente.

Prueba de SN

Los títulos neutralizantes homólogos y heterólogos de los sueros contra los aislados de campo y cepas de referencia mostraron valores que variaron entre 0 y 2.560 (Cuadro 1).

Los títulos neutralizantes homólogos entre las cepas de referencia de los serotipos 1 y 3 fueron altos (2.560 y 1.280), respectivamente (Cuadro 1).

CUADRO 1 TÍTULOS NEUTRALIZANTESa, DE SUEROS HIPERINMUNES ANTIAISLADOS DE HCI Y ANTIADENOVIRUS DE REFERENCIA FRENTE A LOS AISLADOS DE CAMPO DE HCI Y SEROTIPOS DE REFERENCIA DE  AVA 

SUEROS VIRUS
Aislados de Campo   Cepas de Referencia b
39 43 48 86 CELO S1 S3
S1 80c 20 20 160 2.520 2.520 20
S3 40 0 0 0 0 0 1.280
39 1.280 254 1.280 1.280 320 320 320
43 0 80 320 320 0 0 0
48 2.560 320 2.560 2.560 2.560 2.560 127
86 1,016 80 640 1.280 50,4 20 20
a Títulos obtenidos mediante la prueba de seroneutralización cruzada en CREP (microplaca, equivalente a la mayor dilución de suero capaz de inhibir el ECP del virus. b S1, S3: serotipos 1 y 3 de A VA.  c Valor de la media geométrica entre 3 pruebas. 

El cuadro 1 muestra que el título neutralizante entre la cepa CELO y el SHI-serotipo 3 y el SHI-aislado 43 tuvo un valor de 0; esta misma cepa versus el SHI-aislado 86 y SHI-aislado 39 demostró un valor de 50,4 y 320 respectivamente y un valor de 2.560 frente al SHI-aislado 48. Este último título resultó idéntico al obtenido entre el SHI-48 y la cepa AVA serotipo 1. El título neutralizante heterólogo entre la cepa CELO y el SHI-cepa AVA serotipo 1 fue de 2.560.

Los títulos homólogos obtenidos con los SHI de los aislados de campo 39, 48 y 86 fueron altos, con valores de 1.280 a 2.560. Hace excepción el SHI-43 con un título homólogo de 80 (Cuadro 1).

Los títulos neutralizantes heterólogos de los SHI de campo contra las cepas de referencia (Cuadro 1) fueron en general bajos, con valores de 0 a 320. Sólo el SHI-48 dio un título de 2.560 frente a la cepa AVA serotipo 1.

De acuerdo al cuadro 1, los valores de SN heteróloga entre los aislados de campo muestran títulos variables, con valores altos de 1.016 a 2.560 hasta valores en el rango de 0 a 320 como el caso del SHI-43. Los títulos neutralizantes entre el SHI 39aislados 43 y el SHI 86-aislado, 43 fueron de 254 y 80 respectivamente.

Tipificación viral

El grado de relación antigénica entre las cepas en estudio está expresado en términos de r, calculados de acuerdo a la fórmula de Archetti y Horsfall (1950) y expresados en forma porcentual (Cuadro 2). Se aprecia que la relación antigénica entre los aislados 39, 43, 48 y 86 es muy variable, con valores entre 0% y 100%.

CUADRO 2 VALORES DE ra LA CALCULADOS A PARTIR DE LOS TÍTULOS NEUTRALIZANTES DE LOS SUEROS HIPERINMUNES DE LOS AISLADOS DE CAMPO DE HEPATITIS CON CUERPO DE INCLUSIÓN Y CEPAS DE REFERENCIA DE ADENOVIRUS AVIAR

VIRUS SUEROS
  Cepas de referencia    Aislados de campo
S1  S3 39 43 48 86
S1 100c 0d 8,3 0 8,3 3
S3 - 100 8,3 0 0-- 0
39 - - 100-- 0 100-- 88
43 - - - 100 70-- 49
48 - - - - 100-- 50
86 - - - - - 100
a Expresadocomo media geométrica entre r1 y r2, calculado según la fórmula de Archetti y Horsfall (1950) b S1, S3: serotipos 1 y 3 de AVA. c Valor teórico de r que asume la máxima relación antigénica entre una cepa viral y su suero homólogo, expresado como 100% Archetti y Horsfall , 1950).  d Valor que representa el grado de relación antigénica entre dos cepas virales y términos de r expresadoen forma porcentual.

El aislado de 43 de HCI mostró un valor de r de 0% respecto al aislado 39, de 49% con el aislado 86 y de 70% con el aislado 48.

El valor de r entre los aislados 48 y 86 fue de un 50%. Mientras que los aislados 86 y 39 demostraron una relación antigénica del 88%. Los aislados 39 y 48 mostraron un 100% de relación antigénica.

Los valores de r entre los aislados de campo y las cepas de referencia 1 y 3 de AVA, fluctuaron entre 0 y 8,3%.

No hubo relación antigénica entre las cepas AVA serotipos 1 y 3 (r = 0%).

Discusión

Winterfield y col., (1973) obtuvieron títulos virales de 107.5 DLE50/MI para la cepa CELO y la cepa Indiana-C de HCI. Montgomery (1974) obtuvo un título de 106.0 DLE50/ml para la cepa Tipton de HCI, que se incrementó a 106,6 DLE50/ml al efectuar un mayor número de pasajes. Rosenberger y col., (1974) obtuvieron títulos entre 103.0 a 106,9 DLE50/MI para las cepas DPI-1, DPI-2, DPI-3 y Tipton de HCI.

En el presente trabajo se obtuvieron títulos de 105,2 a 106,6 DLE50/MI con los 4 aislados de campo, similares a los señalados por otros autores. También se obtuvieron valores comparables con las cepas AVA de referencia que fluctuaron entre 105,1 y 106,7 DLE50/ml.

Luego de dos pasajes de adaptación en botellas con CCREP, los aislados 39- Malloco, 43-Melipilla, 48-Mostazal y 86-Pintana, mostraron títulos que variaron entre 104.8 a 10 5,8, DIC50/ml. Resultados similares se obtuvieron para las cepas CELO y AVA serotipos 1 y 3 con títulos entre 105,8 y 105,9 DIC50/ml.

Rosenberger y col., (1974) utilizando CCREP, obtuvieron títulos de 104,2 a 107,0 DIC50/ml con 4 cepas virales de HCI. Cubillos y col., (1986) señalan títulos de 10 4,5 y 104.7 DIC50/ml para dos aislados de HCI. Jack y Reed (1990) trabajando con la cepa Indiana-C de HCI obtuvieron un título de 105.63 DIC50/ml. Los valores anteriores son comparables con los obtenidos en este estudio.

Los títulos obtenidos en la SN cruzada de los aislados 39, 43, 48 y 86, frente a las cepas serotipo 1 y 3, son en general bajos (Cuadro 1). Consecuentemente, la relación antigénica de estos aislados de campo con las cepas 1 y 3 de AVA en términos de r, es también baja (Cuadro 2).

De acuerdo al criterio empleado por Wadey y Faragher (1981), en que valores de r iguales o inferiores a 20 indican escasa o nula relación antigénica entre 2 virus, no existirá relación antigénica alguna entre los aislados de campo y las cepas de referencia utilizadas en este estudio.

Los títulos neutralizantes entre la cepa CELO y los SHI de las cepas de referencia serotipo 1 y 3, y la misma cepa y los SHI de los aislados de campo (Cuadro 1) variación entre 0 y 2.560, y fueron similares a los títulos obtenidos entre la cepa AVA serotipo 1 y los mismos SHI. Estos resultados eran esperables ya que la cepa CELO pertenece al serotipo 1 de los AVA, grupo 1.

Considerando los valores de la SN cruzada y la interpretación de Wadey y Faragher (1981) se pudo observar una variable relación antigénica entre los aislados de campo estudiados (Cuadro 2). Así los títulos neutralizantes para los aislados 39-Malloco y 48-Mostazal fueron en ambos sentidos los más altos (2.560 y 1.280). De acuerdo a estos resultados el valor de r igual a 100% indica una estrecha relación antigénica entre ambos. Los aislados 39-Malloco y 86-Pintana también demuestran títulos neutralizantes elevados y similares en ambos sentidos (1.016 y 1.280) lo que determina una alta relación antigénica (r = 88%). A los aislados 48-Mostazal y 86-Pintana (r = 50%); aislados 43-Melipilla y 48-Mostazal (r = 70%), también se les estimó una relación antigénica alta (r igual o mayor a 50%). En cambio la relación antigénica entre los aislados 39 y 43 (r = 0%), 43 y 86 (r = 49%) se interpretó como nula e intermedia respectivamente.

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Recibido el 3 de octubre de 1993, aprobado el 8 de agosto de 1994