Comunicaciones

  • Detección de Herpes virus bovino tipo 1 en semen congelado y fetos abortados en la provincia de Santa Fe, Argentina

Resumen

Se investigó la presencia del HVB-1 en 40 muestras de semen congelado procedentes de Centros de Inseminación Artificial, que comercializan en la cuenca lechera central, y en 23 fetos abortados en establecimientos de la región central de la Provin­cia. Los intentos de aislamientos se realizaron en cultivos celulares primarios de riñón de feto bovino y en la línea celular MDBK. Se consideraron nega­tivas aquellas muestras que no evidenciaron efecto citopático luego de tres pasajes, mientras que las que tuvieran indicios de actividad viral fueron sub­cultivadas. La identificación viral se efectuó me­diante las pruebas de seroneutralización e inmu­nofluorescencia directa.

Se detectaron 7 (17,5%) muestras de semen y 6 (26%) fetos con HVB-1.

Palabras claves: Herpes virus bovino tipo 1, semen, aborto, rinotraqueítis infecciosa bovina.

Abstract

In the present report attention is drawn to investigate the presence of HVB-1 in 40 samples of frozen semen coming from Artificial Insemination Centres, which commercialize in the central milk deep valley and in 23 aborted foetuses in establishments of the central region of the province. The rival isolation attempts were made in primary tissue cultures of fetal bovine kidney and in established fine Madin-Derby bovine kidney. Samples were conside­red as negatives after there blind passages; samples which exhibit viral activity were subcultivated and the virus identification was made by seroneutralization and direct immunofluorescence tests. HVB-1 was isolated from 7 (17.5%) semen samples and 6 (26%) foetuses.

Key words: Bovine herpesvirus type 1, semen, abortion, infeccious bovine rhinotracheitis.

 

Abstract

Se investigó la presencia del HVB-1 en 40 muestras de semen congelado procedentes de Centros de Inseminación Artificial, que comercializan en la cuenca lechera central, y en 23 fetos abortados en establecimientos de la región central de la Provin­cia. Los intentos de aislamientos se realizaron en cultivos celulares primarios de riñón de feto bovino y en la línea celular MDBK. Se consideraron nega­tivas aquellas muestras que no evidenciaron efecto citopático luego de tres pasajes, mientras que las que tuvieran indicios de actividad viral fueron sub­cultivadas. La identificación viral se efectuó me­diante las pruebas de seroneutralización e inmu­nofluorescencia directa.

Se detectaron 7 (17,5%) muestras de semen y 6 (26%) fetos con HVB-1.

Palabras claves: Herpes virus bovino tipo 1, semen, aborto, rinotraqueítis infecciosa bovina.

Abstract

In the present report attention is drawn to investigate the presence of HVB-1 in 40 samples of frozen semen coming from Artificial Insemination Centres, which commercialize in the central milk deep valley and in 23 aborted foetuses in establishments of the central region of the province. The rival isolation attempts were made in primary tissue cultures of fetal bovine kidney and in established fine Madin-Derby bovine kidney. Samples were conside­red as negatives after there blind passages; samples which exhibit viral activity were subcultivated and the virus identification was made by seroneutralization and direct immunofluorescence tests. HVB-1 was isolated from 7 (17.5%) semen samples and 6 (26%) foetuses.

Key words: Bovine herpesvirus type 1, semen, abortion, infeccious bovine rhinotracheitis.

 

Introducción

La rinotraqueítis infecciosa bovina (RIB) es una afección ampliamente distribuida, cuyo agente etiológico es el virus perteneciente a la Familia Herpesviridae, denominado Herpesvirus Bovino 1 (HVB-1).

Los bovinos, como hospedadores primarios, pa­decen una gran variedad de cuadros clínicos: respiratorios (Pauli y col., 1983; Schudel y col., 1980), reproductivos (Kendrick, 1973), abortos (Stubbings y col., 1981; Kendrick, 1973; Pastoret y col., 1982; McKercher y Wada, 1964; Nettleton, 1981; Reed y col., 1971), vulvovaginitis (Pastoret y col., 1982), balanopostitis, encefalíticos, nerviosos, oculares y digestivos (Gibbs y Rweyemamu, 1977), además de la posibilidad de mantener el virus en estado de latencia en los ganglios nerviosos trigéminos y lumbosacros, con posibilidad de reac­tivación, recurrencia y eliminación viral por parte del animal infectado (Pastoret y col., 1982), lo que resulta epidemiológicamente relevante.

En centros de inseminación artificial (IA) han sido descriptos brotes de la enfermedad por Huck en 1961; Saxegaard y col., en 1966, realizaron aisla­mientos de este agente desde toros clínicamente sanos; Sprabdrow, en 1968, lo recuperó de pastillas de semen congeladas provenientes de toros sin sin­tomatología de un centro de la (Gibbs y Rweyema­mu, 1977; Chapman y col., 1979).

Datos obtenidos por Elazhary y col. (1980), Afs­har (1965) y otros, implican a este agente como responsable de infertibilidad, endometritis, lesio­nes de ovarios y oviductos, y bajos índices de con­cepción, en animales inoculados con semen conta­minado por vía intracervical o intrauterinamente. Mishra et al. en 1982 detectaron HVB-1 en semen en el 19% de los toros estudiados por la técnica de IFD.

Varios autores confirman la acción de este virus en los abortos bovinos realizando trabajos en forma, experimental y natural, detectando su acción y pa­togenia en los fetos abortados.

En nuestro país, Epstein y col., en 1972, fueron los primeros en realizar aislamiento de RIB de fetos abortados. Lager y col., en 1980, aislaron y caracte­rizaron el HVB-1 de un toro sin sintomatología e inmunodeprimido en forma experimental. En 1986, Villa y col., efectuando inmunodepresión, recuperó virus de toros, logrando identificar portadores de un centro de inseminación artificial. En la provincia de Santa Fe, en 1983, Pauli et al., aislaron cepas de HVB-1 de hisopados vaginales de animales con sintomatología clínica.

Material y métodos

1. Cultivos celulares

a) Cultivos primarios (CP): Se utilizaron CP y sus pasajes de células de riñón, testículo y pulmón fetal bovino, ejecutados según técnicas corrientes y mantenidos en botellas y tubos Leighton, en medio esencial mínimo (MEM), con el agregado de 10% de suero de ternera y 1% de gentamicina (4.000 μg/ml), como medio de crecimiento. Los cultivos fueron utilizados cuando tuvieron entre el 80 y 100% de confluencia en sus monocapas, previo control de cada lote por inmunofluorescencia direc­ta (IFD), para detectar virus endógeno.

b) Línea permanente : Se utilizó la línea estable­cida MDBK (Madin-Derby Bovine kidney) entre sus pasajes 126 al 250, cedida en octubre de 1987 por INTA Castelar, la que fue mantenida en forma semejante a los CP y controlada por IFD. El suero de ternera utilizado para crecimiento y manteni­miento de los cultivos celulares fue controlado por seroneutralización (SNT) para detectar anticuerpos anti-RIB, resultando negativos todos los lotes.

2. Materiales problemas

a) Muestras de semen : Se recibieron 40 muestras de semen provenientes de CIA, siendo 11 de ellas únicas y las restantes dos, saltos del mismo toro en 2 años consecutivos. Las mismas ingresaron en for­ma de pajuelas y pastillas. En ambos casos, fueron descongeladas V/V en MEM con el agregado de antibiótico y antimicótico, centrifugadas por 15 min a 2.000 g y controladas en caldo tioglicolato. y agar Sabouraud. En los casos en que los contro­les fueron positivos, las muestras se filtraron por membranas de 0,2 μ de poro, utilizándose para las inoculaciones los sobrenadantes. Cuando se verifi­có un posible efecto tóxico del semen, 2 horas posteriores a la inoculación, las muestras se diluye­ron en MEM 1:10 y fueron inoculadas nuevamente.

Las monocapas se observaron diariamente luego de inoculadas, durante 7 días, luego se efectuaron 2 y 3 pasajes sucesivos, descartándose por conside­rarse negativas aquellas que no presentaron altera­ciones de ningún tipo luego de tres pasajes seriados por CP y línea alternativamente.

Los materiales que presentaron efecto citopático (ECP), es decir: vacuolización, redondeamiento, fusión celular, sincicios, células gigantes multinu­cleadas, fueron subcultivadas hasta 6 pasajes y con­servadas alícuotas en nitrógeno líquido para su pos­terior identificación.

b) Fetos : Ingresaron 23 fetos abortados entre el 4° y 7° mes de gestación. Se tomaron muestras de hígado, bazo, pulmón y riñón, efectuándose tritura­dos con arena estéril y MEM con el agregado de antibióticos-antimicóticos, realizándose los contro­les microbiológicos de los sobrenadantes. Aquellos que evidenciaron contaminación, se filtraron por membranas de 0,2 μ de poro.

Las inoculaciones se efectuaron en CP y línea MDBK, efectuándose 3 pasajes de cada material. Se consideraron negativos, al tercer pase sin ECP. Los que evidenciaron ECP se pasaron hasta 6 veces en CP y línea alternativamente, reservándose alí­cuotas en nitrógeno líquido para su posterior confir­mación.

3. Identificación de aislamientos

Ocho materiales fueron enviados al Departamento de Virología del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria de Castelar (provincia de Buenos Ai­res) y los restantes fueron identificados en nuestro Laboratorio, mediante las técnicas que se detallan a continuación:

Inmunofluorescencia directa : Se utilizó el méto­do original de Coons y col. (Reed y col., 1971) desprendiéndose las células infectadas y centrifu­gándose en su medio de cultivo por 15 min a 1.000 g para obtener los 'pellets' celulares. Los mismos fueron lavados 3 veces con PBS y resuspendidos en MEM, ajustándose la concentración celular a 2 x 106 células/ml preparándose de aquí los 'spots' en portaobjetos (2 réplicas por cada material), secán­dose a 37°C. La fijación se realizó con acetona fría a - 20°C. Una vez secos se les adicionó una gota de suero anti-HVB-1 conjugado en dilución 1:5, incu­bándose en cámara húmeda, lavándose luego con PBS y agua destilada. Se montaron con glicerina 'bufferada' 50% y se leyeron en microscopio Olympus, realizándose los correspondientes con­troles (positivos y negativos).

Seroneutralización (SNT): La titulación de los materiales se efectuó en policubetas con microculti­vos de línea MDBK, diluyéndolos en logaritmos decimales naturales, usando 6 réplicas por dilución, para determinar las 100 dosis infectivas cultivo de tejido 50% (DICT 50%/0,1 ml), interpolándose el punto final por el método de Reed y Müench, consi­derándose positivos aquellos pocillos con el 50% de capa afectada.

La prueba de SNT fue montada en policubetas. Se prepararon diluciones de los líquidos previamente titulados, conteniendo 100 DICT 50%10,1 ml y fueron enfrentadas a suero anti-HVB-1 en su dilu­ción de uso, en 4 réplicas. Las mezclas se incubaron por 60 minutos a 37°C y se les agregó luego una suspensión de células MDBK conteniendo 800.000 células/ml. Se mantuvieron a 37°C por 4 a 7 días. Se consideraron positivas las capas que a la lectura mostraron más del 50% de destrucción celular y, por lo tanto, fueron negativas en neutralización, determinándose la neutralización como la pérdida de la capacidad infectante de los materiales en estu­dio por acción del antisuero específico.

Resultados

En 7 (17,5%) muestras de semen se aisló virus, identificándose como HVB-l; de los materiales res­tantes 13 (32,5%) evidenciaron ECP, resultando negativos en su identificación como HVB-l. Cabe destacar que un mismo toro se mantuvo positivo en muestras de los años 1987 y 1988.

En 6 fetos (26,08%) se aisló e identificó HVB-1; en 6 (26,08%) se observó ECP, pero no se identifi­có como dicho agente (cuadro 1).

CUADRO 1 IDENTIFICACIÓN DE HVB-1 EN MUESTRAS DE SEMEN Y FETOS. SANTA FE, ARGENTINA

Material

N° de muestras

ECP Ident. HVB-1+

ECP Sin ident.

Negativos

Semen

40

7 (17,5%)

13 (32,5%)

20 (50%)

Fetos

23

6 (26,08%)

6 (26,08%)

11 (47,82%)

Total:

63

13 (20,63%)

19 (30,15%)

31 (49,20%)

Discusión

Nos parece importante enfatizar el porcentaje su­mamente alto, desde el punto de vista epidemioló­gico, de aislamientos e identificaciones virales tan­to en semen como en fetos abortados, lo que no deja lugar a dudas de la difusión del agente en cuestión. Las muestras fueron obtenidas sin que existiera sospecha previa de la actividad del mismo, por lo que los resultados aportan datos que trazan un pano­rama que justifica nuevos y más profundos estu­dios.

Merece mencionarse especialmente el hecho de haber detectado el HVB-1 en semen colectado en 2 años consecutivos de un mismo toro, como así también la positividad de otro toro en dos muestras de saltos de fechas diferentes, pertenecientes a un centro de IA. Esto agrava la potencialidad del re­productor como difusor de la enfermedad, si tene­mos en cuenta que se encuentran cubiertas por IA aproximadamente 50.000 hembras en los principa­les departamentos de la cuenca lechera santafesina.

Los resultados revelan además la presencia de otros agentes virales, cuya identificación será obje­to de posteriores estudios.

La tecnificación y el incremento productivo, en el consiguiente control de otros agentes (brucelas, campylobacter, leptospiras, etc.) resaltarán el rol del HVB-1 y otros virus como potenciales agentes productores de abortos.

Conclusiones

Se detectó la presencia de HVB-1 en semen conge­lado, lo que demuestra una vez más que el agente de la RIB se encuentra viable y con potencialidad para producir la enfermedad a partir de semen distribui­do para inseminación artificial. Se comprobó la actividad de HVB-1 en fetos abortados, por lo que podemos sostener que el agente en nuestra región produce abortos.

Surge del estudio la necesidad de cuantificar la importancia de este agente, dato insoslayable si se propone como objetivo el diseño e implementación  de medidas de profilaxis. Consideramos imprescin­dible exigir el cumplimiento de las disposiciones del Ministerio de Agricultura de la Nación, en lo referente al control de enfermedades de transmisión sexual. En los centros de Inseminación Artificial recomendaríamos la realización de pruebas serológicas, complementadas en los animales positivos, con detección de virus en semen de toros inmunodeprimidos artificialmente.

Referencias

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ELAZHARY, M.A.S., P. LAMOTHE, R. SILIM, ROY, S. 1980. Bovine Herpesvirus 1 in the sperm of a bull from a herd with fertility problems. Can. Vet. J. 21: 336-339.

EPSTEIN, B., C. GIL TURNER, M.E. ETCHEVERRIGARAY. 1972. Aislamiento de un feto abortado de virus de la rinotraqueítis infecciosa bovina y listeria monocitogenes. Rev. Med. Vet. (Bs. As.) 53: 99-102.

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REED, D.E., E.J. BICNELL, C.A. LARSON, W.V. KNUDTSON, C.A. KIRKBRIDGE. 1971. Infectious bovine rhinotracheitis virus induced abortion, rapid diagnosis by fluorescent anti­body technique. Am. J. Vet. Res. 32: 1423-1426.

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Recibido el 20 de agosto de 1990, aprobado el 30 de octubre de 1990.