Trabajos Originales

  • Normalización de un antígeno soluble para descartar respuestas postvacunal a Brucella Abortus Cepa 19

Resumen

A partir de Brucella abortus Cepa 1119-3 se extrae por calor y doble precipitación alcohólica un antíge­no soluble, el que al ser enfrentado por medio de una prueba de inmunodifusión doble con sueros de bovinos naturalmente infectados de Brucella, pro­duce una línea clara de precipitación. Se comprueba que la concentración de hexosas del antígeno está relacionada con la capacidad precipitante de éste y la concentración mínima de hexosas para producir la reacción adecuada es de 155 μg/ml.

Este antígeno así normalizado tiene una sensibi­lidad de 92,3% y una especificidad de 100%, con la característica de no reaccionar frente a los sueros de bovinos que recibieron vacunación con Cepa 19.

Cuando se comparan los resultados de la prueba de inmunodifusión usando el antígeno normaliza­do, con aquellos de las pruebas de seroaglutinación estándar y Rosa de Bengala, se obtienen valores similares en un 95,9% de los casos. Cuando se analizaron 265 sueros de bovinos vacunados, posi­tivos a estas pruebas de aglutinación, ninguno de ellos reaccionó a la prueba de inmunodifusión.

La prueba de inmunodifusión, utilizando un an­tígeno así normalizado, será de utilidad para descar­tar respuestas postvacunales en las actividades de diagnóstico que se realicen en el control de la bruce­losis bovina.

Palabras claves: Brucella abortus, serología, vacunas.

Abstract

The performance of a heat-alcoholic extracted soluble antigen from Brucella abortus strain 1119-3 was evaluated through double precipitation methods. Such antigen was matched by means of a double immunodiffusion test against bovine sera of animals naturally infected with Brucella, producing a very marked precipitation line. It was confirmed that the concentration of hexoses in the antigen was linked to its precipitatiog capacity and that the minimun hexoses concentration able to produce and addecuate reaction was 115 µg/ml. This standardized antigen has a sensitivity of 92.3%, a specificity of 100% and does not react against sera of bovine immunized with Brucella abortus S 19. When comparing the results of the immunodiffusion test using the standardized antigen with those of standard seroagluttination and the card tests, the values obtained were similar in about 95.9% of the cases. When analyzing 265 sena from immunized animals tested reactive in agluttination tests non of them reacted to the immunodiffusion test. The immunodiffusion test using this type of standardized antigen will be of great usefullness in orden to discard post-vaccinal positive reactions within the diagnostic activities of the brucellosis control program.

Key words: Brucella abortus, serology, vaccines.

 

 

Abstract

A partir de Brucella abortus Cepa 1119-3 se extrae por calor y doble precipitación alcohólica un antíge­no soluble, el que al ser enfrentado por medio de una prueba de inmunodifusión doble con sueros de bovinos naturalmente infectados de Brucella, pro­duce una línea clara de precipitación. Se comprueba que la concentración de hexosas del antígeno está relacionada con la capacidad precipitante de éste y la concentración mínima de hexosas para producir la reacción adecuada es de 155 μg/ml.

Este antígeno así normalizado tiene una sensibi­lidad de 92,3% y una especificidad de 100%, con la característica de no reaccionar frente a los sueros de bovinos que recibieron vacunación con Cepa 19.

Cuando se comparan los resultados de la prueba de inmunodifusión usando el antígeno normaliza­do, con aquellos de las pruebas de seroaglutinación estándar y Rosa de Bengala, se obtienen valores similares en un 95,9% de los casos. Cuando se analizaron 265 sueros de bovinos vacunados, posi­tivos a estas pruebas de aglutinación, ninguno de ellos reaccionó a la prueba de inmunodifusión.

La prueba de inmunodifusión, utilizando un an­tígeno así normalizado, será de utilidad para descar­tar respuestas postvacunales en las actividades de diagnóstico que se realicen en el control de la bruce­losis bovina.

Palabras claves: Brucella abortus, serología, vacunas.

Abstract

The performance of a heat-alcoholic extracted soluble antigen from Brucella abortus strain 1119-3 was evaluated through double precipitation methods. Such antigen was matched by means of a double immunodiffusion test against bovine sera of animals naturally infected with Brucella, producing a very marked precipitation line. It was confirmed that the concentration of hexoses in the antigen was linked to its precipitatiog capacity and that the minimun hexoses concentration able to produce and addecuate reaction was 115 µg/ml. This standardized antigen has a sensitivity of 92.3%, a specificity of 100% and does not react against sera of bovine immunized with Brucella abortus S 19. When comparing the results of the immunodiffusion test using the standardized antigen with those of standard seroagluttination and the card tests, the values obtained were similar in about 95.9% of the cases. When analyzing 265 sena from immunized animals tested reactive in agluttination tests non of them reacted to the immunodiffusion test. The immunodiffusion test using this type of standardized antigen will be of great usefullness in orden to discard post-vaccinal positive reactions within the diagnostic activities of the brucellosis control program.

Key words: Brucella abortus, serology, vaccines.

 

 

Introducción

Los estudios para obtener un antígeno adecuado, que sirva para descartar la respuesta inmunitaria humoral producida por la vacunación con Brucella abortus Cepa 19, logran éxito con Díaz y col. (1979), quienes describen el Poly B y que luego en 1981 simplifican su preparación obteniéndolo por doble precipitación con etanol. Cherwonogrodzky y Nielsen (1988) logran separar en estado casi puro el componente polisacárido de la pared brucelar o cadena 0 y luego Nielsen y col. (1989) lo utilizan en una prueba de enzimoinmunoensayo. La estructura polisacárida característica de este antígeno ha sido estudiada por Perry y col. (1986), llegándose en estudios recientes ha obtener preparados por preci­pitación etanólica que contienen hasta un 65% de polisacáridos (Lord y col., 1989).

En nuestro país, ya fue preparado un antígeno soluble extraído por precipitación etanólica, persi­guiendo simplificar la metodología de extracción, con el fin de hacerlo accesible a un uso rutinario (Pinochet y col., 1989).

Ello ha hecho necesario estudiar la posibilidad de normalizar tanto la preparación del antígeno como la prueba de inmunodifusión en la que se utiliza.

En este estudio se pretende relacionar el conteni­do de hexosas totales del antígeno así preparado, con la capacidad precipitante de éste, por medio de una prueba de inmunodifusión doble, frente a sue­ros bovinos infectados de brucelosis y además, definir la concentración mínima con la que se obtie­ne una reacción de tipo funcional.

Igualmente, se pretende estudiar el comporta­miento de este antígeno así normalizado ante sueros bovinos de diferentes características epidemiológi­cas en relación a brucelosis.

 Financiado por proyectos FONDECYT 0439-88 y A-2940 DTI. Universidad de Chile.

Material y métodos

Preparación del antígeno: se obtuvo a partir de Brucella abortus Cepa 1119-3 basado en extracción salina en caliente y doble precipitación etanólica según el método descrito por Díaz y col. (1981), modificando la concentración de etanol en 4 y 2 volúmenes, en la primera y segunda precipitación, respectivamente. La centrifugación se realizó a 17.000 X g durante 30 minutos y el precipitado obtenido fue reconstituido a 1/3 de su volumen inicial (Pinochet y col., 1989).

Prueba de inmunodifusión doble (ID): se utilizó agarosa al 0,7% en un tampón TRIS-HCI 0,l M, pH 7,2, y un 10% de NaCI (Cherwonogroszky y Niel­sen, 1988). Se empleó una roseta con pocillos de 3 mm de diámetro separados por 2 mm del pocillo central. La interpretación de resultados se hizo ba­sado en lecturas a las 24, 48 y 72 horas y en la detección de una línea clara de precipitación (Pino­chet y col. 1989).

Normalización del antígeno: se realizó una serie de diluciones dobles del antígeno preparado, con el fin de conocer la dilución óptima de trabajo, defini­da ésta como la dilución máxima que en la prueba de inmunodifusión produjo una línea de precipita­ción clara y única, dentro de 24 horas y que se mantenía sin modificaciones por más de 72 horas. Esta línea debía producirse únicamente al enfrentar el antígeno a sueros bovinos infectados naturalmen­te de brucelosis, comprobado esto por aislamiento bacteriológico de B. abortus patógena. Se excluía por metodología conocida la posible presencia de Cepa 19 (Alton y col. 1976).

Del mismo modo, esta línea de precipitación no debía producirse al enfrentar a sueros de bovinos negativos, procedentes de áreas libres de brucelosis de la XII Región del país.

La dilución óptima del antígeno fue analizada mediante la prueba de Anthrona. para determinar su contenido de hexosas (Hanson y Phillips, 1981). Como complemento se determinó la concentración de proteínas mediante el método de Bradford (1976).

Para comprobar si la capacidad de reacción del antígeno estaba relacionada con la concentración de hexosas, se prepararon tres nuevas partidas de antí­geno y, por dilución o concentración, se igualó al contenido de hexosas del antígeno de dilución ópti­ma. Por medio de la prueba de ID los antígenos nuevos fueron comparados en sus características de identidad inmunológica, tiempo de aparición de la línea de precipitación y su comportamiento frente a diluciones seriadas de sueros positivos a brucelosis.

El antígeno de dilución óptima, ya conocido su contenido de hexosas, constituyó el antígeno normalizado. Fue mantenido a -30°C en estado con­centrado, debiendo diluirse antes de su uso.

Evaluación del antígeno: en una prueba de inmu­nodifusión doble se enfrentó el antígeno con 26 sueros de bovinos positivos por aislamiento, 72 negativos por origen provenientes de áreas de la XII Región, donde no se vacuna ni se ha detectado la enfermedad, y 150 bovinos vacunados con Cepa 19 (estas muestras fueron obtenidas 2 a 5 meses des­pués de la vacunación). Se calculó la sensibilidad y especificidad de esta prueba de ID en base a los resultados de las muestras de bovinos positivos por aislamiento, y los negativos por origen.

Comparación de resultados con las pruebas de seroaglutinación estándar (SAE) y de Rosa de Ben­gala (RB): se utilizaron 254 sueros de hembras bovinas positivos a las pruebas ya citadas y realiza­das según Alton y col. (1976), constatando que estas vacas no hubiesen recibido Cepa 19, sino sólo cuando terneras, y que tuviesen más de un parto; 265 sueros de bovinos jóvenes vacunados con Cepa 19, y positivos a una o a ambas pruebas, selecciona­dos de acuerdo a las fechas de vacunación del orga­nismo oficial del Ministerio de Agricultura; 509 sueros de hembras negativas a las pruebas citadas. Los resultados fueron analizados por la prueba de McNemar y por estudios de sensibilidad y especifi­cidad en base a las pruebas de SAE y RB.

Finalmente, se preparó un antígeno según la técnica descrita, regulando su concentración de he­xosas, para verificar la repetibilidad del método.

Resultados

La cantidad de antígeno obtenido por la cosecha de 12 botellas Roux fue de 106 ml, y se calcula que 1 ml, de antígeno alcanza para analizar 150 sueros aproximadamente, siempre que se utilice el esque­ma de roseta propuesto.

El preparado siempre produjo una sola línea de precipitación, claramente detectable a las 24 horas y cuyas características no se modificaban en las 48 horas siguientes. La dilución 1/2 del antígeno pre­parado según esta técnica apareció como la óptima y el contenido de hexosas de esta dilución fue de 115 μ/gml, constituyendo el antígeno normalizado. Esta dilución contenía además 86,4 μ/ml de pro­teínas.

Los resultados de los tres antígenos de prueba, cuyos contenidos de hexosas fueron equiparados con el del antígeno normalizado, fueron en todo iguales a los de este último, comprobándose igual identidad y capacidad de precipitación con diferen­tes diluciones de sueros, al ser enfrentados en la prueba de ID. No hubo precipitación o fue débil­mente legible cuando se utilizó antígenos de menor concentración de hexosas.

Cuando se enfrentó el antígeno normalizado a sueros con antecedentes conocidos en relación a brucelosis, 24 de los 26 sueros de hembras con aislamiento de Brucella fueron reactores en la prue­ba de ID. Ninguno de los sueros negativos ni de los sueros negativos ni de los sueros de animales vacu­nados con Cepa 19 produjo línea de precipitación en la prueba. Según estos resultados, la sensibilidad fue de 92,3% y la especificidad de 100%.

En el cuadro 1 se presenta la relación de los resultados de la prueba de ID frente a los obtenidos en las pruebas de SAE y RB; igualmente, ninguno de los sueros procedentes de los bovinos vacunados (positivos a una o ambas pruebas de las usadas) reaccionó a la de ID. De los 254 sueros positivos a una o ambas pruebas, sólo el 5,5% no reaccionó a la prueba de ID. Frente a SAE no se produjeron cam­bios significativos según la prueba de McNemar, pero sí en el caso de RB (p  0,05).

CUADRO 1 RESULTADOS DE LA PRUEBA DE INMUNODIFUSIÓN (ID) EN SUEROS DE BOVINOS REACTORES Y NO REACTORES EN LAS PRUEBAS DE SEROAGLUTINACIÓN ESTÁNDAR (SAE) Y ROSA DE BENGALA (RB)

Grupos de bovinos

-Nº

SAE

RB

ID

Pos.

Neg.

Pos.

Neg.

Pos.

Neg.

Positivos

254

234

19

234

0

240

14

Vacunados

265

237

28

248

17

0

265

Negativos

509

0

509

0

509

0

509

La sensibilidad y especificidad de la prueba de ID, usando SAE como base, fue de 94,5 y 100%, respectivamente, y en relación a RB, 94 y 100%, respectivamente, excluyendo en ambos cálculos a los animales vacunados.

El antígeno de prueba, preparado según la meto­dología descrita y normalizado a 115 μl/ml de he­xosas, entregó en la prueba de ID una repetibilidad total de los resultados obtenidos por el antígeno en estudio.

Discusión

El antígeno en estudio ha entregado los resultados esperados, demostrando un gran rendimiento, facilidad de preparación y manejo, bajo costo, etc.

Se trata de un antígeno poco purificado, en el cual es posible encontrar cierta cantidad de proteí­nas, las que alcanzaron a 86,4 μg/ml.

Trabajos anteriores han aclarado que los compo­nentes del antígeno que participan en la reacción que genera la línea de precipitación, no correspon­den a proteínas. En esta y en otras experiencias realizadas por los autores (Pinochet y col., 1989), no se ha comprobado la presencia de líneas agrega­das de precipitación, claramente diferenciables por pruebas de identidad, sino sólo en tres oportunida­des, sobre un total de más de 2.000 muestras.

La modificación en los volúmenes de etanol y la mayor fuerza centrífuga aplicada, permitieron obte­ner un precipitado más puro y más rico en hexosas y de menor tenor de proteínas, si se le compara con antígenos similares preparados anteriormente por nosotros (Pinochet y col., 1989).

La concentración de 155 μg/ml de hexosas fue aquella que permitió obtener una línea de precipita­ción adecuada, pues de hecho, concentraciones dé­bilmente menores fueron incapaces de producir una reacción fácilmente identificable.

La estabilidad del antígeno mantenido a -30°C fue demostrada al menos durante 14 meses, sin que se modificara en forma aparente su reactividad. A pesar de ello se recomienda que este antígeno pu­diera ser liofilizado, para asegurar su estabilidad.

Sin duda la característica más relevante de este antígeno es la de reaccionar sólo con los sueros de bovinos infectados naturalmente y no con aquellos vacunados, cualidad que ya ha sido comentada an­teriormente.

El hecho que dos sueros de animales infectados comprobados por aislamiento bacteriano no reac­cionaran en la prueba de ID, representa una menor sensibilidad del antígeno. Como antecedente com­plementario se puede agregar que estos sueros tam­bién fueron no reactores en la prueba de fijación de complemento; uno solo de ellos reaccionó a RB y ambos resultaron con títulos de 1:50 y 1:100, res­pectivamente, a la prueba de SAE.

Otros trabajos recientemente realizados también han encontrado una proporción similar de sueros de animales infectados que no reaccionan en la prueba de (Cherwonogrodzky y Nielsen, 1988).

La especificidad de la prueba, al igual que en trabajos anteriores, ha sido óptima. En relación a su comportamiento con antisueros contra bacterias que presentan alguna reacción cruzada con Bruce­lla, ello ya ha sido demostrado anteriormente por nosotros (Pinochet y col., 1989).

Cuando se compararon los resultados de la prue­ba de ID con aquellos de SAE y RB, se comprobó una clara relación, con la excepción de los sueros de bovinos vacunados. Éstos no reaccionaron en la prueba de ID aunque presentaron claros títulos a la prueba de SAE y fueron positivos a la prueba de RB, lo que corrobora la bondad del método.

Se escogieron las pruebas de SAE y RB en la comparación, porque éstas son de uso rutinario y aunque pudieran merecer algunos reparos, los paí­ses en desarrollo como el nuestro las siguen usando con frecuencia.

Es necesario agregar que las muestras incluidas en la comparación provenían de 26 predios lecheros del centro y sur del país, con diferentes característi­cas epidemiológicas en relación a brucelosis.

La utilidad de la prueba de ID utilizando el antígeno normalizado, permite complementar el diagnóstico de brucelosis bovina tanto en las accio­nes de erradicación como de control. Los resultados que entregan encuestas tradicionales incluyen mu­chos bovinos reactores, cuyas respuestas obedecen sólo a persistencia de anticuerpos postvacunales. Por otro lado, varios países han incluido en sus planes de control en áreas de alta prevalencia de brucelosis, la vacunación de bovinos adultos con dosis reducidas de Cepa 19, lo que en muchas ocasiones también genera respuestas postvacunales de cierta duración (Pinochet y col., 1986).

Si bien la preparación del antígeno y su normali­zación es más o menos especializada, la prueba de ID, contando con el antígeno adecuado. puede rea­lizarse en cualquier laboratorio de diagnóstico ruti­nario, sin necesidad de equipos ni personal especia­lizado.

Agradecimientos

Se agradece la colaboración de la Dra. Consuelo Borie P., en la realización de algunos análisis quí­micos.

Referencias

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BRADFORD, M. M. 1976. A rapid sensitive method for the quanti­tation of microgram quantities of protein utilizing the princi­pie protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.

CHERWONOGRODZKY, J.W., K. H. NIELSEN. 1988. Brucella abortus 1119-3 0 chain polysaccharide to differentiate sera from B. abortus S19 vaccinated and field-strain-infected cattle by agar gel immunodiffusion. J. Clin. Microbiol. 26: 1120-1123.

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HANSON, R.S., T.A. PHILLIPS. 1981. Chemical compositions. In: Gerhardt, P. Manual of methods for general bacteriology. Am. Soc. for Microbio¡, pp. 326-364.

LORD, V.R., M.R. ROLO, J.W. CHERWONOGRODZKY. 1989. Evaluation of humoral immunity to Brucella sp. in cattle by use of an agar-gel immunodiffusion test containing a polysaccharide antigen. Am. J. Vet. Res. 50: 1813-1816.

NIELSEN, K., J. W. CHERKONOGRODZKY, J. R. DUNCAN, D. R. BUNDLE. 1989. Enzyme linked immunoassay for differentia­tion of the antibody response of cattle naturally infected with Brucella abortus or vaccinated with strain 19. Am. J. Vet. Res. 50: 5-9.

PERRY, M.B., D. R. BUNDLE, J.W. CHERWONOGRODZKY. 1986. The structures and serology of A and M antigens of Brucella abortus and Brucella melitensis and the structure of polysac­charide B of Brucella species. XIV Int. Congress of Micro­biology. Manchester. Sept.

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PINOCHET, L., P. ÁBALOS, M.L. SÁNCHEZ, I. PALAVICINO, M.A. VENT. 1989. Preparación y evaluación de un antígeno para descartar respuesta postvacunal a Brucella abortus Cepa 19. Av. Cs. Vet. 4: 43-48.

Recibido el 23 de mayo de 1990, aprobado el 24 de agosto de 1990.