Artículos Generales

  • Vacuna antirrábica preparada con una cepa viral aislada de murciélago vampiro (Desmodusrotundus)

Resumen

A plaque–purified experimental rabies vaccine was developed from an isolate (strain V–319) made from a naturally infected vampire bat (Desmodus rotundus). Two different vaccines were prepared: one was live virus and the second was an inactivated rabies virus preparation. The live virus vaccine and betapropiolactotie–inactivated vaccine, gave complete protection to challenge inoculation after 1 year. The strain (V–319) could be distinguished from other vaccinal strains by the nature of the plaque morphology. It is conclude that a safe living rabies vaccine of high potency and efficacy in cattle has been developed, and successfully, tested in Mexico under stringent field conditions.



Key words: rabies, vaccine, virus, cattle.

Abstract

A plaque–purified experimental rabies vaccine was developed from an isolate (strain V–319) made from a naturally infected vampire bat (Desmodus rotundus). Two different vaccines were prepared: one was live virus and the second was an inactivated rabies virus preparation. The live virus vaccine and betapropiolactotie–inactivated vaccine, gave complete protection to challenge inoculation after 1 year. The strain (V–319) could be distinguished from other vaccinal strains by the nature of the plaque morphology. It is conclude that a safe living rabies vaccine of high potency and efficacy in cattle has been developed, and successfully, tested in Mexico under stringent field conditions.



Key words: rabies, vaccine, virus, cattle.

Contenido

La rabia paresiante bovina constituye un importante problema de salud animal en las zonas ganaderas de América latina localizadas en el trópico húmedo y en las regiones subtropicales. En estas regiones, el ganado es frecuentemente atacado por los murciélagos hematófagos y por tanto el riesgo de contraer la rabia paresiante o derriengue constituye una amenaza constante a la salud animal, con la consecuente disminución del aporte proteico de los animales a la alimentación humana.

Las vacunas antirrábicas han estado disponibles desde tiempos de Pasteur, y muchos países han logrado importantes avances en el control de esta enfermedad con vacunas mucho menos eficaces que las disponibles hoy día. La necesidad de una vacuna de origen vampiro para prevenir al derriengue derivó de la necesidad creada por la corta inmunidad conferida por las vacunas de cerebro de animales natural o experimentalmente infectados con rabia y posteriormente inactivadas. Por otra parte, las vacunas avianizadas, que tan buenos resultados habían dado en un principio, fueron reduciendo su eficacia y cuando se hizo necesario revacunar a los animales con mayor frecuencia, empezó a aparecer el fenómeno de los choques anafilácticos, que redujeron considerablemente la utilidad de estas vacunas. La vacuna de cultivos celulares cepa ERA, que fue probada en México y otros países, y encontrada de gran utilidad para el control de esta enfermedad, es un producto costoso; durante mucho tiempo también fue de importación obligada y su efectividad se veía con frecuencia reducida por las largas esperas en aeropuertos y muelles, condiciones menos que óptimas y siendo una vacuna viva, a veces lo que se recuperaba de las aduanas era un caldo carente de título viral.

Cuando se iniciaron los trabajos con cepas de vampiro, las únicas vacunas disponibles eran las avianizadas, las de cerebro de carnero y bovino y ocasionalmente era posible adquirir de contrabando y a muy bajo precio la cepa ERA, que entonces estaba disponible en muchos otros países. Sin embargo, se percibió claramente la necesidad de una vacuna adecuada a las necesidades de América latina. Sería mucho aventurar el decir que los grupos del virus rábico detectados posteriormente con los anticuerpos monoclonales ya eran conocidos, pues hubiera sido una justificación más para emprender este tipo de tareas, pero la realidad es que en esa época lo único que interesaba era tener una vacuna más acorde a las necesidades latinoamericanas. La comunicación presente describe los trabajos de adaptación y atenuación de dos cepas de origen vampiro a cultivos celulares y posteriormente las pruebas de campo de una de ellas, a partir de la cual se prepara hoy día una vacuna que ha dado muy buenos resultados en México y Latinoamérica.

Para los propósitos de este estudio se desarrolló una línea celular de vampiro, dado que esto permitiría cultivar con mayor eficacia los aislamientos de virus rábico de origen de vampiro. Se iniciaron los trabajos con un embrión de vampiro obtenido de una hembra capturada en una región en donde, por lo menos en la época de la captura, la rabia paresiante bovina era desconocida (Hueytamalco, Puebla). Se colectaron explantes musculares de un embrión de 30 mm seleccionando la región del hombro por ser la más muscular en esta especie. Los explantes de tejido fueron colocados sobre mesitas de malla de acero inoxidable en cajas de Petri de plástico de 30 mm de diámetro, manteniendo los explantes apenas húmedos. El medio de cultivo empleado fue el mínimo esencial (MEM) con sales de Eagle con 20% de suero y se incubaron a 37°C con flujo continuo de aire conteniendo 5% de CO2 . El medio de cultivo estaba suplementado con aminoacidos no esenciales y antibióticos en concentración estándar (50 UI de penicilina, 50 μg de estreptomicina y 5 μg de nistatina por ml). El medio de cultivo se cambió con intervalos de una semana y se continuó la incubación. Al término de un mes, el fondo de la caja de Petri, contenía un monoestrato completo de células de morfología de fibroblastos. Este primer monoestrato se desprendió de la caja de Petri con un tratamiento de tripsina–verseno al 0,25% y se cultivaron las células en cajas de Petri de 60 mm. El medio de cultivo era MEM suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado, antibióticos pero ya sin aminoácidos no esenciales. Después de 20 pases adicionales, se formaba un monoestrato en aproximadamente 3 a 4 días. Las células se podían subcultivar a intervalos de 4 a 5 días. La línea celular se estudió hasta su pase 109.

También se utilizó la línea celular BHK–21, para cultivos de aislamientos de virus rábico. Se cultiva en medio especial de Leibowitz (GIBCO, Grand Island, NY) enriquecido con 10% de caldo triptosa fosfatado además de la concentración usual de suero fetal de bovino y antibióticos.

La clona 13 de la línea celular BHK–21 se obtuvo por donativo del Centro Internacional de Referencia de Rabia de la OMS en el Instituto Wiston, Filadelfia, PA, y se utilizó para pruebas de placa. Para mejorar la uniformidad de las células se colectaron células individuales y de cada una de ellas se derivó una subclona. La línea celular subclonada (BHK21/13S, Clona 3) se utilizó tanto para la prueba de placas como para los lotes experimentales de la vacuna que finalmente se seleccionó. Esta subclona se cultivó en el mismo medio que la línea celular original.

Con el fin de obtener aislamientos virales, se empezó a trabajar con cinco muestras de virus rábico para adaptarlas á cultivos celulares y estudiarlas con mayor detalle. Las cepas seleccionadas fueron V97, V319, V389, V665 y Mazatán. Las cuatro primeras se recibieron como cerebro infectado de murciélago vampiro, que fueron capturados en diferentes estados costeros de México y el quinto caso consistió de masa encefálica de bovino muerto de derriengue en el municipio de Mazatán Nayarit. Todas las muestras se seleccionaron con base en la prueba de inmunofluorescencia e inoculación intracerebral en ratones. Sólo se escogieron las cepas que resultaron positivas a ambas pruebas así como a la virusneutralización con suero monoespecífico de referencia.

Las cepas de vampiro se trataron de manera similar, aun cuando en tiempos distintos. El sobrenadante de una suspensión al 20% de cerebro de vampiro infectado se utilizó para infectar monoestratos de células FEV. La suspensión se centrifugó a 8.000 g durante 10 minutos y se agregó una concentración de 50 μg /ml de DEAE dextrán PM 1 x 106 (Pharmacia, Uppsala, Suecia); cada caja de Petri de 60 mm de diámetro contenía cinco cubreobjetos estériles de 10 x 20 mm. El primer cubreobjeto se retiró a las 72 horas después de la inoculación y los restantes se colectaron cada 24 horas posteriores al primero. Los cubreobjetos con células se tiñeron por medio de la técnica de anticuerpos fluorescentes (AF) con conjugado antirrábico.

Al término de 7 días, y basándonos en los resultados de la inmunofluorescencia, el líquido sobrenadante de los cultivos inoculados con la cepa V319 fueron colectados y reunidos en un solo lote antes de distribuir en alícuotas que se congelaron en nitrógeno líquido. Debido al pobre crecimiento de las otras tres cepas, su estudio fue discontinuado. Se efectuaron cuatro pases adicionales de la cepa V319 a intervalos semanales utilizando líquido sobrenadante sin células (0,05 ml de una dilución 1:5) en células FEV. De cada pase se guardaron alícuotas de 1 ml en nitrógeno líquido. Después de cuatro pases en células FEV, se empezó a adaptar el virus a las células BHK–21, de la misma manera que se indicó antes. Paralelamente, se sembraron cajas de Petri conteniendo cubreobjetos a fin de seguir el crecimiento viral, y se empezó a hacer la prueba de placa para determinar el pase en el que el virus se había adaptado suficientemente a los cultivos celulares como para que esta prueba fuera positiva. A partir del quinto pase se empezaron a observar placas en las diluciones más bajas (10–1 y 10–2). Se seleccionó una caja conteniendo una sola placa grande (designada placa 476) y se colectó el virus para cultivos subsecuentes. Después de tres pases adicionales, se logró la máxima adaptación posible, y así el treceavo pase dio un título de 109 UFP/ml. Se consideró éste el punto de máxima adaptación a los cultivos celulares por que pases subsecuentes no incrementaron el título.

Con la cepa Mazatán se siguió un método diferente. El sobrenadante de una suspensión al 10% de cerebro infectado se inoculó en un feto fresco de vampiro en la región del hombro. Una hora después de la inoculación se colectaron muestras de tejido y se trabajaron de manera similar a lo descrito para el desarrollo de la línea celular de vampiro. Cuando se había formado un monoestrato de fibroblastos, se retiró uno de los cubreobjetos del cultivo y se tiñó con anticuerpos fluorescentes. Las células infectadas así obtenidas se subcultivaron a intervalos semanales hasta el pase 10 y después se colectó el sobrenadante para adaptarlo a células BHK–21, se le dieron seis pases adicionales y luego se purificó por clonación como se describió para la cepa V319. El máximo título alcanzado con esta cepa fue de 107,3 UFP/ml.

Para la cuantificación de títulos virales y anticuerpos se utilizaron la prueba de placas y la prueba de reducción de placas previamente descritas. Para el caso de evaluación de virus todavía no purificados por la clonación en la prueba de placa, se utilizó la prueba de microfocos fluorescentes desarrollada en nuestro laboratorio, así como la reducción de microfocos fluorescentes para cuantificar anticuerpos.

Las pruebas de patogenicidad se efectuaron en bovinos y perros, tanto para detectar neurotropicidad como para determinar el grado de excreción que tenía lugar en animales experimentalmente inoculados con las cepas en estudio. En un experimento, cuatro novillas seronegativas a rabia fueron inoculadas intramuscularmente, dos con la cepa V319 y dos con la cepa Mazatán. En una prueba adicional, seis novillas entre 6 y 10 meses de edad, fueron inoculadas con dosis variables de la cepa V319. Las terneras seleccionadas para esta segunda prueba fueron seleccionadas con base en su pobre condición física y estaban infestadas con parásitos, para simular condiciones de campo. Un séptimo animal fue inoculado por vía intracerebral con 0,5 ml con 6 x 108 de virus.

En otro experimento se inocularon cuatro perros Beagle entre 4 y 6 meses de edad procedentes de la colonia de Beagle de Palo Alto. Dos perros recibieron dos millones de unidades formadoras de placa y los otros dos recibieron cinco millones de unidades formadores de placa. Todos los perros fueron inoculados en la pierna izquierda.

Se colectaron muestras de saliva diariamente durante 6 semanas y comenzando la colección de muestras una semana después de la inoculación. Cada muestra se colectó con un hisopo estéril y una vez recogida la muestra, se introdujo en un tubo de ensaye conteniendo medio de cultivo celular con antibióticos y 50 mg/ml de DEAE dextrán. Las muestras se mantuvieron congeladas a –70°C hasta el momento de probarse en cultivos de células BHK–21. La presencia o ausencia de virus en las muestras se determinó tiñendo con anticuerpos fluorescentes los cubreobjetos con células, a las 48 y 72 horas de inoculación. En cada serie de pruebas se incluyó una muestra positiva conocida y una negativa conocida como testigos.

Una prueba adicional de ausencia de patogenicidad en perros se llevó a cabo con un lote grande de semilla maestra. Utilizando un lote de 10 perros Beagle adultos, seronegativos a rabia y nunca vacunados, se inoculó 10 ml de la semilla maestra (es decir, 1010 UFP) a cada perro en la región del cuello, dividiendo los 10 ml de la dosis total en 10 sitios a ambos lados del cuello en los espacios intervertebrales en donde salen los troncos nerviosos cervicales. Se sacrificó un perro al día 1 postinoculación y otros perros se sacrificaron a los días 3, 10, 15 y 30 postinoculación. En cada caso se colectaron muestras de tejido muscular en los sitios de la inoculación, médula espinal cervical, cerebelo, cerebro y médula oblonga para hacer pruebas de inoculación en ratones y anticuerpos fluorescentes. Los cinco perros restantes se mantuvieron en observación durante 6 meses. Al término del período de observación, los perros se sacrificaron y examinaron de la manera descrita. También se determinó la patogenicidad de la cepa en conejos y caballos, en los cuales se aplicó 5 x 107 UFP de virus viable por vía intramuscular.

Para la producción de los lotes de vacuna en cantidades suficientes para pruebas de campo, la línea celular BHK–21/135 (clona 3) fue utilizada a lo largo de estos estudios. La línea celular se sembró en botellas de roller de 2 litros con 80,000,000 de células suspendidas en 400 ml de medio de crecimiento por cada botella. Los cultivos celulares se incubaron a 30°C durante 3 a 4 días antes de inocularse con el virus. Durante la incubación, las células se movieron a razón de 1 rpm. Cuando se habían formado los monoestratos completos, se procedió a infectar a las células. Después de la infección se bajó la temperatura de la incubadora a 32°C para mejor crecimiento viral.

Lote de semilla maestra. Se partió de la semilla seleccionada como vacunal (cepa V319/placa 476) en su llavo. pase en cultivos celulares, con un título de 108,1 UFP/ml y que se había mantenido congelada a –70°C. Después de descongelar la semilla, se diluyó 1:100 y se utilizaron 25 ml por botella con un monoestrato confluente de células. El diluyente, llamado medio de infección, consistió de medio BHK–21 con 2% de suero fetal inactivado y 100 microgramos/ml de DEAE dextrán. Después de una hora de incubación con rotación, los monoestratos fueron enjuagados con solución salina fosfatada y tamponada a pH 7,4 y cada botella fue llenada con 400 ml de medio de mantenimiento recientemente preparado. La incubación postinoculación se llevó a cabo de la manera antes descrita, durante 5 días, y al final del período de crecimiento de virus, el medio de cada botella fue colectado en botellas de plástico de 500 ml y centrifugado a 1.000 g durante 15 minutos. El líquido sobrenadante de cada botella se dividió en botellas con 80 ml cada una, así como unas cuantas ampolletas de 1 ml, para propósitos de titulación. El lote completo de semilla maestra se congeló a –70°C hasta terminar las titulaciones. Cuando el lote hubo dado buen título y aprobado las pruebas de control de calidad, se descongeló, mezcló y se dividió en cantidades de 1 ml que se mantienen hasta la fecha en nitrógeno líquido. Antes de aprobar el lote de semilla maestra, se condujeron pruebas de título en ratones adultos, en ratones de 21 días, así como las pruebas de esterilidad bacteriana, y estar libre de microplasmas y hongos. Siguiendo las técnicas antes descritas, se preparó un lote de semilla de trabajo, utilizando una sola ampolleta de semilla maestra. Dado que las especificaciones de producción requieren la preparación anual de los lotes de trabajo, con una sola ampolleta se puede producir un lote de trabajo. También se efectuaron las pruebas de control de calidad antes descritas.

La cepa de desafío para ganado se preparó a partir de glándulas salivales de un murciélago vampiro rabioso. Las glándulas salivales de un solo animal, confirmado como positivo por inmunofluorescencia, se homogeneizaron y clarificaron por centrifugación a baja velocidad y el virus se subcultivó por pases sucesivos en ratones de 21 días de edad por inoculación intracerebral. Después de 10 pases en ratón, el virus mataba entre 6 y 7 días postinoculación. Para preparar el lote de cepa de desafío, se inoculó un lote de ratones de 21 días, del doble del tamaño de lo que se había estimado necesario para la prueba. Se inoculó a los ratones con una dilución 1:100 de virus pase 10, con lo cual se esperaba que la mayoría de los ratones muriera entre los días 7 y 8 de la inoculación. Cuando se notaba que un ratón mostraba arqueamiento del lomo o algún otro síntoma de rabia, se le colocaba en una jaula individual, a fin de que viviera lo más posible. Cuando los animales se encontraban agónicos y con síntomas claros de rabia, se revisaban varias veces al día a fin de sacrificarlos justo antes de la muerte natural por rabia. Esta revisión se hacía varias veces al día a fin de colectar el cerebro de los animales cuando tenían al título más alto posible de virus. Los cerebros colectados en cada ocasión, se guardaron en cajas de Petri pequeñas, selladas en forma hermética y congeladas a –70°C. Para preparar el lote de cepa de desafío sólo se consideraron los animales que llenaron las condiciones arriba especificadas; los que murieron antes o después se desecharon del lote de cepa de desafío. Con los cerebros colectados durante el período óptimo, se preparó un homogenizado, se distribuyó en alícuotas de 10 ml y se guardó a –70°C hasta contar con los resultados de la titulación. El lote en el que el título alcanzó 107 DL50/ml o superior, se conservó para titularse en bovinos.

El lote de cepa de desafío se tituló en bovinos no vacunados seronegativos a rabia. Se utilizaron tres bovinos por dilución, inoculando a cada animal con 2,5 ml de la suspensión infecciosa de cerebro de ratón por animal. Se utilizaron las siguientes dosis por animal: 5 x 106, 1 x 106 y 2 x 105 (Diluciones 1:5, 1:25 y 1:125 del 'stock' de cepa de desafío). La dosis empleada para el desafío fue la que se determinó que mataba entre el 80 y el 100% de los animales testigo no vacunados.

La vacuna se preparó con las técnicas descritas para la semilla maestra. Para las pruebas iniciales, cada botella de virus fue cosechada y titulada por separado, utilizándose solamente aquellas vacunas que tenían un título de 108,6 UFP/ml para preparar un primer lote experimental de vacuna. La mezcla de los cosechados de alto título se mezcló con el estabilizador en proporción de 1:1 y se liofilizó. La vacuna se conservó a 4°C hasta el momento de su uso, reconstituyéndose con un diluyente de PBS al cual se había agregado un 0,2% de albúmina sérica bovina y 100 μ g de DEAE dextrán/ml. En todos los casos el título mínimo de los productos liofilizados era de por lo menos 106,7 UFP/ml.

Como animales de prueba para las vacunaciones experimentales se utilizaron diferentes razas de ganado, procedentes de áreas libres de rabia transmitida por murciélagos hematófagos de México. Antes de incluir algún animal en las pruebas de vacunación experimental, se determinó que estuviera libre de anticuerpos rábicos.

Basados en resultados preliminares, se probó la vacuna en animales con desafío a un año. Se seleccionaron 24 animales de raza Hereford entre 1 y 2 años de edad procedentes de un grupo mayor de animales seronegativos a rabia y localizados en Chihuahua. Un grupo de seis animales fue vacunado con la vacuna concentrada, por vía intramuscular. Otro con la vacuna diluida 1:10 y un grupo de 12 animales fue dejado como testigo no vacunado. Todos los animales fueron sangrados en la tercera semana después de la vacunación y posteriormente en los meses 2, 6 y 12. Al término de un año fueron desafiados con una dosis de 2,000,000 DLR50 de cepa de desafío en cerebro de ratón y sangrados la primera y cuarta semana postdesafío. Los animales que sobrevivieron al desafío fueron conservados 6 meses después del desafío.

En pruebas de campo se vacunaron animales de ranchos experimentales del INIP y de propietarios particulares tanto en áreas infectadas como libres de rabia transmitida por vampiros y en las que no se había efectuado ninguna vacunación antirrábica.

En algunas áreas, se vacunó con 5 ml y en otras con 2 ml; sin embargo, la dosis se mantuvo constante en 5 x 107 UFP. Los animales se sangraron al momento de la vacunación y a 1, 3, 6 y 12 meses postvacunales.

Se consideró importante determinar si los becerros de madres vacunadas tenían anticuerpos rábicos que interfirieran con la vacunación exitosa de estos animales. A seis becerros de vacas vacunadas se les aplicó una dosis de vacuna y se les colectó muestra de suero en intervalos de 3 meses. En un segundo experimento los becerros de entre 4 y 6 meses de edad, procedentes de madres vacunadas fueron serológicamente muestreadas antes de la vacunación y 1 y 3 meses después.

Los primeros resultados obtenidos con el intento de adaptación a cultivos celulares de las cuatro cepas de cerebro de vampiro se presentan en el cuadro l. En el vampiro V319, tanto el cerebro como las glándulas salivales eran positivas a virus rábico y el título encontrado en cerebro fue de 106,1 DL/50g de cerebro, en tanto que en glándulas salivales fue de 107 DL50/g, las suspensiones preparadas a partir de pulmones, riñón, hígado y corazón de este vampiro también fueron positivas a la prueba de inoculación en ratones. Con la excepción de tejido cerebral, los tejidos de los otros vampiros (V97, V389 y V655) fueron negativos. La hembra gestante V389 abortó antes de morir de rabia, pero el feto resultó negativo tanto a la prueba de inoculación de ratones como a la prueba de anticuerpos fluorescentes.

CUADRO 1 CRECIMIENTO INICIAL DE CUATRO AISLAMIENTOS RABICOS EN FIBROBLASTOS EMBRIONARIOS DE VAMPIRO

Aislamiento Horas después de la infección
72 96 120 144 168
V97 0* 0 1 4 4
V319 0 10 25 100 120
V489 0 0 1 3 4
V665 0 1 5 8 8
* Número de microfocos fluorescentes por cubreobjeto.

Los datos del cuadro 1 sugieren que los cuatro aislamientos podrían haberse adaptado a cultivos celulares; sin embargo, se decidió continuar con los trabajos de la cepa V319 debido a que su crecimiento en cultivos celulares era más abundante (cuadro 2).

CUADRO 2 TÍTULOS VIRALES Y PASES DE LA CEPA V319 EN CULTIVOS CELULARES

Tipo de célula Número de pase Título viral Prueba de AF
Embrión Vampiro 1 NH(1) 120(2)
Embrión Vampiro 4 102.6(3) 400
BHK-21 5 NH 400
BHK-21 9 105.2 (3) Confluente
BHK-13S 10 NH(4) NH
BHK-21 11 108.1(5) Confluente
BHK-21 12 108,4(5) Confluente
BHK-21 13 109,0(5) Confluente
(1) N H no hecha. (2) Número de microfocos por cubreobjeto. (3) Unidades formadoras de microfocos/ml. (4) Purificación en placa. (5) Unidades formadoras de placa/ml.

Contenido (Continuación)

Para propósitos de comparación, los resultados de adaptación de la cepa Mazatán (de bovino) se presentan en el cuadro 3. Puede notarse que esta cepa sí logró adaptarse a los cultivos celulares, pero los títulos más altos alcanzados con este virus llegaron a 107,3 como máximo, comparado con 109,0 UFP/ml de la cepa V319, Lo que se interpretó como una posible cepa superior para cultivarse in vitro. Los resultados de inoculación del virus ya adaptado a cultivos celulares por varias vías se presenta en el cuadro 4. Aun cuando esta cepa era virulenta por vía intracerebral para ratones de Las dos edades en estudio, se consideró que La diferencia encontrada en La vía intramuscular en ratones de 21 días, comparado con La misma vía en ratones de 2 a 3 días de edad, así como los resultados de la vía intraperitoneal arrojaban datos de relativa baja patogenicidad.

CUADRO 3 PASES Y TÍTULOS VIRALES DE LA CEPA MAZATAN

Tipo Celular Pase de virus Número de células Título Viral
Células de Vampiro infectadas 20  NH(1) 
Células de Vampiro infectadas 10 90 102.3 (2)
BHK-21 11 40 ND
BHK-21 15 80 104.4(2)
BHK-21-13S 16(3) NH NH
BHK-21 17 80-90 107.1(4)
BHK-21 19 80-90 107.3(4)
BHK-21 20 80-90 107.2(4)
(1) N H no hecha. (2) Unidades formadoras de microfocos/ml. (3) Purificación en placa. (4) Unidades formadoras de placa.

CUADRO 4 PATOGENICIDAD DE LA CEPA V319 (PLACA 476) DE VAMPIRO PARA RATONES

Edad de los ratones (días) Ruta de Inoculación Cantidad inoculada (ml)(1) LD50 /ml (-Iog10 dilución
2-3 IC(2) 0,02 8,5
IM(3) 0,03 6,8
IP(4) 0,10 4,8
3 IC 0,03 7,2
IM 0,10 2,0
IP 0,1-0,5 1,0
(1) El inoculo contenía 109 UFP/ml. (2) IC = intracerebral. (3) IM = intramuscular. (4) IP = Intraperitoneal.

Los resultados de los estudios de patogenicidad y antigenicidad en terneras se presentan en el cuadro 5. La ternera inoculada por vía intracerebral, murió 3 semanas después de La inoculación. EL grupo inoculado por La vía intramuscular, no mostró signos de rabia y todos mostraron altos títulos neutralizantes en el suero. Ninguno de Los demás animales inoculados por La vía intramuscular mostró síntomas de rabia pero sí altos niveles de anticuerpos en su suero (Los datos no se presentan en forma tabular). Con Los datos arriba anotados, La cepa V319 se consideró Lo suficientemente atenuada como para intentar estudios más profundos sobre su potencial como vacuna. En estudios previos, 8 animales inoculados con una dosis de cepa de desafío de vampiro murieron entre 15 y 20 días con 2,000,000 DLR50, sugiriendo por lo menos una reducción de 20 veces en La patogenicidad de la cepa V319. En el cuadro 5 también se nota que Las altas dosis de virus por vía intramuscular provocaron una rápida e intensa respuesta de anticuerpos en las terneras vacunadas. Las vaquillas inoculadas con la cepa Mazatán también se conservaron sanas durante el período de observación y no eliminaron el virus.

CUADRO 5 RESPUESTA SEROLÓGICA DE BECERRAS DESPUÉS DE LA INOCULACIÓN DE LA CEPA V319 (PLACA 476)

Becerra Número(1)

Vía y dosis de inoculación

Período después de la inoculación
1 Semana 2 Semanas 3 Semanas 1 Mes 2 Meses 3 Meses 4 Meses
119 Intracerebral 0.5 ml de 109 UFP/ml 10(2) 40 80 +(3) - 2360 640
987 Intramuscular 2 ml de 109 UFP/ml 1280 2560 5120 5120 2560 10240 10240
989 Intramuscular 2 ml de 109 UFP/ml 3840 3200 5120 10240 7680 2360 1280
992 Intramuscular 5 ml de 106 UFP/ml 10 640 1280 5120 5120 - -
995 Intramuscular 5 ml de 106 UFP/ml 2120 2560 2560 7680 3840 5120 2560
993 Intramuscular 10 ml de 106 UFP/ml 10 80 ±(4) - - - -
996 Intramuscular 10 ml de 106 UFP/ml 240 2560 5120 7680 3840 5120 5120
(1) Sólo se seleccionaron becerras con un título menor de 1:10 en la prueba de reducción de placas. (2) Los números indican el recíproco de los títulos séricos detectados por la prueba de reducción de placa. (3) Murió 3 semanas postinoculación; el cerebro fue positivo a rabia por anticuerpos fluorescentes. (4) Murió de timpanismo, negativo a anticuerpos fluorescentes.

Los animales en que se condujeron estudios en la saliva a fin de determinar La presencia de virus rábico en las muestras colectadas, arrojaron resultados uniformemente negativos, en tanto que los testigos positivos incluidos en cada caso fueron positivos. El virus rábico se encontró localmente en los músculos del cuello de los perros inoculados con semilla maestra solamente el primer día postinoculación, por medio de la prueba de inoculación de ratones lactantes y por medio de la inmunofluorescencia. No fue posible detectar multiplicación de virus en sistemas nerviosos central de ningún animal, y los cinco perros que se mantuvieron en observación durante 6 meses de la inoculación, permanecieron saludables durante este período y todos los tejidos resultaron negativos a rabia.

Cada uno de los lotes tanto de semilla maestra como de semilla de trabajo se encontraron libres de agentes adventicios así como de contaminantes, y fueron identificadas como de virus rábico por las pruebas de virus neutralización.

La cepa de desafío tenía un título de 2 x 106DL50 para ratones y con esta dosis morían entre el 80–90% de los testigos no vacunados entre las 4 y las 6 semanas postdesafío. No murió ningún animal después de las 6 semanas en el grupo que recibió la dosis más baja (2 x 105).

En cuanto a la duración de la inmundiad con desafío a un año sólo se desafiaron 7 animales de cada grupo debido a muertes no debidas a rabia y pérdida de aretes. Los resultados de esta prueba se presentan en el cuadro 6. No se observó diferencia en los niveles de anticuerpos de los animales que recibieron dosis alta o dosis baja de virus, como puede apreciarse en el cuadro 7, en donde además se compara las pruebas de reducción de placas con la prueba de seroneutralización en ratones. Esta última prueba dio resultados consistentemente más bajos que la primera. Se notan diferencias de 10 a 100 veces entre una y otra. Estos resultados están de acuerdo con los hallazgos de otros investigadores, en el sentido de que la prueba de reducción de placas es mucho más sensible que la seroneutralización en ratones, especialmente para detectar anticuerpos tempranos.

CUADRO 6 RESULTADOS DEL DESAFÍO DESPUÉS DE UN AÑO DE VACUNACIÓN

Dilución de Vacuna Desafiados Muertos Vivos
1:100 2 0 2
1:1000 5 0 5
Testigos No Vacunados 7 5 2

En las pruebas de campo se vacunó un total de 12.551 animales distribuidos en once áreas de México. No se reportaron reacciones adversas después de la vacunación. Los resultados serológicos pre y postvacunación indicaron una seroconversión en los animales vacunados, de los cuales aproximadamente el 10% fueron sangrados. Las muestras de sangre sólo se tomaron de los animales que resultaron seronegativos en el sangrado prevacunal, tomando esto como indicación de que no habían sido previamente vacunados. En el cuadro 8 se presentan resultados típicos de estas pruebas, mostrándose un muestreo al azar en Yucatán, que es una zona con derriengue.

La ventaja de agregarle DEAE dextrán a la vacuna puede apreciarse comparando los resultados del cuadro 7 con los del cuadro 8, en donde se confirman reportes previos en el sentido de que la respuesta con DEAE Dextrán es más uniforme e intensa que sin este producto en la vacuna.

CUADRO 7 TASAS DE ANTICUERPOS EN GANADO DESPUÉS DE LA VACUNACIÓN Y DESPUÉS DEL DESAFÍO

Semanas después de la vacunación Semanas después del desafío Dosis de vacuna viva Número de animal Antes de la vacunación
3 6 12 26 52 1 4
VNT(1) PRT(2) VNT PRT VNT PRT VNT PRT VNT PRT VNT PRT VNT PRT
13 1280 50 640 30 320 20 320 60 690 660 10240 1250 15360 107.7 PFU 915 2(3) 10
13 1280 2100 20480 560 10240 1100 20480 800 20480 2500 40960 1250 20480 - 930 2 10
-
13 1280 90 1280 20 160 20 320 80 1280 320 5120 625 5120 106.7 PFU 922 2 10
13 2560 66 640 22 160 - - 20 320 1250 10240 625 5120 - 943 2 10
37 1280 7000 20480 1200 20480 660 20480 250 20480 2500 10960 1250 10240 - 946 2 10
20 1280 56 640 78 640 56 1280 40 640 200 30720 625 10240 - 949 2 10
11 1280 48 640 22 640 60 640 100 1280 1250 10240 625 5120 - 955 2 10
(1) VNT = Prueba de seroneutralización en ratones. (2) PRT = Prueba de reducción en placa. (3) = Los números indican el recíproco de la dilución de suero.

CUADRO 8 MUESTREO SEROLÓGICO DE GANADO VACUNADO CON UNA DOSIS DE VACUNA V319 EN YUCATÁN(1)

Número de Animal Título al Vacunar 1 Mes 3 Meses
40 MP 10 1280(2) 960
43 MP 10 1600 960
46 MP 10 1280 2560
49 MP 10 1280 2560
52 MP 10 1920 1280
55 MP 10 1600 2560
62 MP 10 2560 1600
65 MP 10 2560 1280
68 MP 10 1280 1280
(1) Yucatán en zona de derriengue. (2) Los números indican el recíproco de la dilución de suero en la prueba de reducción de placas.
Con respecto a la respuesta de animales hijos de vacas vacunadas los resultados se presentan en los cuadros 9 y 10. Puede apreciarse que sí hubo transferencia de anticuerpos de la vaca al becerro y que casi cualquier cantidad de anticuerpos detectable en los becerros bloqueó la vacunación exitosa. No se incluyó suficiente número de animales como para permitir determinar la relación existente entre anticuerpos maternos y los del becerro, pero la mayoría de los becerros respondió a la vacunación a los 6 meses de edad, en tanto que los becerros de 4 meses, a menudo contenían niveles de anticuerpos que interferían con la vacunación exitosa.

CUADRO 9 PERSISTENCIA DE ANTICUERPOS MATERNOS EN TERNERAS DE VARIAS EDADES

Número del Becerro Edad Título Suero
Becerro1 Vaca1
520 6 días 640(1) 640
518 1 mes 40 80
- 3 meses 20 --
883 3 meses 60 640
- 5 meses 20 --
891 3 meses 120 5120
- 5 meses 40 --
887 4 meses 40 480
- 7 meses 10 --
885 5 meses 20 640
 - 6 meses 10 --

Las muestras de suero de la vaca y el becerro se colectaron simultáneamente a la fecha del primer sangrado. (1) Los números indican el recíproco de la dilución de suero en la prueba de reducción de placas.

CUADRO 10 INTERFERENCIA DE ANTICUERPOS MATERNOS EN LA VACUNACIÓN EXITOSA DE BECERROS DE 4 A 6 MESES

Número Becerro Becerros con anticuerpos maternos Número Becerros Becerro sin anticuerpos maternos
Título al vacunar 1 mes después de vacunado 3 meses después de la vacunación Título al vacunar 1 mes después de vacunado 3 meses después de la vacunación
990 40 40 60 875 10 400 240
991 10 80 20 878 10 320 480
993 20 40 20 882 10 320 240
975 40 20 20 884 10 1280 1920
956 40 40 10 940 10 120 120
958 80 30 20 943 10 320 320
969 80 60 40 948 10 640 480
192 40 120 60 161 10 640 320
137 40 40 30 872 10 320 320
158 40 20 - 954 10 640 320

 

  Este trabajo recibió el premio CANIFARMA Alfredo Tellez Girón Rode. México, 1988.

Discusión

Dos de los cinco aislamientos de virus rábico de derriengue fueron adaptados a cultivos celulares hasta dar altos títulos en este sistema de crecimiento. Una cepa, la V319, placa 476, alcanzó un título máximo de 109 UFP/ml después de un total de 13 pases en cultivos celulares. La cepa Mazatán, una vez purificada por placas, alcanzó un título máximo de 107,3 UFP/ml. En pases adicionales después de la purificación por placa efectuados en las dos cepas, no se logró aumentar los títulos virales antes mencionados. Bajo estas circunstancias, los títulos arriba anotados se consideran los máximos a que pueden llegar las cepas en estudios. Las diferencias de título observadas en las dos cepas de virus, se consideran peculiaridades de las placas seleccionadas para subcultivo. Es necesario hacer notar que en ninguna de las cepas de virus rábico, con que hemos trabajado en el laboratorio para la prueba de placas, se ha observado variación en el tamaño de placa ni dentro ni entre cepas. La diferencia más importante en cuanto al tipo de placa producida por el virus V319 consiste en que son de bordes poco definidos, en tanto que otras cepas utilizadas, incluyendo la cepa Mazatán son placas de bordes bien definidos. Consideramos que la técnica de purificación por medio de la prueba de placas para obtener títulos altos en cepas adaptadas a cultivos celulares, se aplicó aquí por primera vez, y el tipo de placa formado por esta cepa se considera un marcador que la identifica. El dato de que las cepas de virus rábico de origen vampiro son menos neurotrópicas que las procedentes de otros animales, parece encontrar confirmación en los resultados aquí presentados, pero, consideramos que se necesita más trabajo y un mayor número de cepas para poder concluir algo sobre este aspecto del virus rábico.

Los resultados de la prueba de patogenicidad en ratones indicó un alto grado de atenuación. La patogenicidad del virus por vía intramuscular era baja, tanto para ratones de 21 días como para ratones lactantes. La diferencia de título del virus por vía intracerebral entre ratones de 21 días y ratones lactantes también indica que había ocurrido una atenuación. Los conejos inoculados por vía intramuscular y los ratones inoculados por vía intraperitoneal sobrevivieron a la inoculación con altas dosis de virus, favoreciendo también la idea de que la adaptación a cultivos celulares había ido acompañada de una pérdida de la neurotropicidad del virus V319 adaptado a cultivos celulares. Este punto de vista es reforzado por los estudios en perros, en donde sólo se encontró virus en el tejido muscular en el sitio de la inoculación al día siguiente de la inoculación. Basado en estos resultados es que se decidió estudiar la patogenicidad del virus V319 en becerros. Los resultdos, resumidos en el cuadro 5, indican que si bien ésta cepa todavía era patógena por la vía intracerebral (como lo es la cepa ERA), ya no producía signos de rabia por vía intramuscular, aún cuando se utilizaran dosis 100 veces superiores a las de la cepa de desafío.

Todas las muestras de saliva colectadas después de la inoculación experimental fueron uniformemente negativas con las técnicas de ensayo utilizadas. La literatura menciona que el cultivo celular seguido por inmunofluorescencia es una prueba más sensible que la inoculación en ratones y si bien se ha encontrado grandes cantidades de virus en la orina de murciélagos, esto no ocurre en vampiros. Los testigos no vacunados sirvieron además para confirmar que el virus vacunal no se elimina por ninguna vía que puedan captar otros animales, por el hecho de permanecer seronegativos a pesar de haber sido alojados en los mismos corrales y junto con los animales vacunados experimentalmente. Haciendo la comparación con los trabajos de Constantine con excreción de virus rábico en murciélagos, sus estudios indicaban que las hembras eliminan el virus durante la época de partos. Dado que no incluimos animales gestantes en nuestro experimento, no podemos hacer inferencias sobre la posible excreción del virus rábico vacunal en vacas recién paridas.

Consideramos que es altamente improbable que el virus vacunal sea detectable en fluidos corporales tales como lágrimas, orina o leche, sin ser al mismo tiempo detectable en la saliva. Todos los animales inoculados con dosis variables de virus vivo permanecieron saludables a lo largo del período de observación, así como después del desafío.

El hecho de que no todas las cepas adaptadas a cultivos celulares den lugar a buenas vacunas, nos condujo a efectuar nuevas pruebas en animales. Por ejemplo, el Centro Panamericano de Zoonosis (Buenos Aires) condujo pruebas sobre el potencial como vacuna de una cepa de virus rábico derivada de la cepa ERA y cultivada en células BHK–21 y encontró que no era adecuada para la protección de bovinos contra una cepa de desafío. Además, la cepa Mazatán no despertó una buena respuesta inmune, aún cuando el virus desarrolló altos títulos en cultivos celulares. Sin embargo, se demostró que la cepa V319 placa 476 sí estimuló altos niveles de anticuerpos y que la vacuna protegió al ganado por lo menos durante un año. Si bien sólo se probó la respuesta inmune a un año después de la vacunación, los títulos de anticuerpos parecen indicar que la protección puede ser de mayor duración.

La cepa V319 se consideró segura aun cuando el número de pases era de 13 en cultivos celulares. Los estudios preliminares mostraron que era inocua para bovinos. Durante un tiempo se consideró seriamente la posibilidad de desarrollar una vacuna inactivada a partir de la cepa adaptada a cultivos celulares, como una vía corta para contar con una vacuna, pero dado que la vacuna viva daba buenos resultados, se continuaron los trabajos. Dado que la respuesta de anticuerpos de la vacuna viva era vigorosa, se consideró que un producto de este tipo sería más adecuado para las condiciones de México.

La dosis recomendada, es decir 10 6,7 es considerablemente superior a la de la vacuna ERA (10 4,4 UFP/dosis). En las pruebas de Nlar que se condujeron con la vacuna, ésta resultó entre 60 y 600 veces más potente que lo recomendado por la Organización Mundial de la Salud.

La prueba de desafío, también indicó un alto grado de inmunidad, si bien se hizo un desafío homólogo, que en la mayoría de los casos no es posible. Pero recordando que este era el propósito primordial del trabajo, esto constituye su mayor virtud.

Por medio de la prueba de reducción de placas, se encontró que los niveles de anticuerpos son detectables una semana después de la vacunación y para el día 14 se encontraban altos niveles de anticuerpos. La adición del DEAE dextrán al diluyente de la vacuna resultó en un aumento de la uniformidad y nivel de la respuesta inmune y se empezó a aplicar a las vacunaciones de campo tan pronto como los resultados experimentales estuvieron disponibles.

Se considera como una ventaja el hecho de que la cepa vacunal V319 se pueda distinguir de otras cepas vacunales no por su tamaño sino por su morfología de placas.

Concluimos que hemos tenido éxito en desarrollar una vacuna contra el derriengue con una cepa de origen de vampiro que reúne todos los requisitos internacionales de seguridad y eficacia y además, sigue siendo la única vacuna veterinaria contra la rabia que se puede diluir antes de su uso, lo que ilustra el potencial de producción tan grande que tiene un biológico de este tipo. El potencial de este producto como vacuna para uso humano, está por evaluarse.

Referencias

ABELSETH, M.K. An attenuated rabies vaccine for domestic animals produced in tissue culture. Canad. Vet. J. 5: 279286, 1964.

ABELSETH, M.K. Further studies on che use of ERA vaccine in domestic animals. Canad. Vet. J. 8: 221–227, 1967.

ABELSETH, M.K. Bovine vaccines –past and present. In: The Natural History of Rabies. Vol. 11: 99–114. G. Baer, ed., Academic Press. N.Y., 1975.

ARELLANO, C.S., P. SUREAU, D. BATALLA, J. MORALES. Evaluación de la eficacia de la vacuna cepa Flury contra la rabia paralítica bovina. Tec. Pec. Mex. 19: 9–14, 1971.

ARELLANO C.S., P. SUREAU, D. BATALLA, J. MORALES. Evaluación de la eficacia de la vacuna cepa Flury contra la rabia paralítica bovina. Tec. Pec. Mex. 19: 9–14, 1971.

ARNOLD, R.M., P. STOURAITIS, J. SALVATIERRA. Immunity against paralytic rabies in catfe following vaccination with ERA vaccine under ranch conditions in Bolivia: III. The influence of maternal antibody on the success of vaccination of calves at different ages. Trop. Anim. Health Prod. 5: 167–172,1973.

ATANASIU, P. Quantitative assay and potency tet of antirabies serum. In: Laboratory Techniques in Rabies, WHO Monograph Series N° 23, 2nd ed.: 167–172, Geneva, 1966.

BAER, G. Bovine paralytic rabies and rabies in che vampire bat. In: The Natural History of Rabies. Vol. II: 155–175. G. Baer, ed., Academic Press, N. Y. ,1975.

BATALLA, D.C., C.S. ARELLANO, P. SUREAU. Evaluación serológica de las vacunas antirrábicas para bovinos que existen actualmente en México. Tec. Pec. Mex. 18: 22–26, 1971.

BIJLENGA, G., A.E.J.M. VAN DEN BOGAARD. In vivo enhancement of rabies infection by diethylaminoethyl–dextran. Arch. Ges. Virusforsch. 42: 96–101, 1973.

BIJLENGA, G., E.M. HERNÁNDEZ–BAUMGARTEN. Adaptation, attenuation and plaque purification of a rabies virus isolate (V 319) from a vampire bat (Desmodus rotundus). Comell Vet. 70:290–302,1980.

BIJLENGA, G., E.M. HERNÁNDEZ–BAUMGARTEN. A plaquepurified rabies virus (Strains V319) derived from a vampire bat (Desmodus rotundus) in Mexico: Vaccine Potential. Cornell Vet., 74: 2, 1984.

CLARK, H.F., H. KOPROWSKI. Isolation of temperature sensitive conditional lechal mutants of 'fixed' rabies virus. J. Virol. 37: 295–300, 1971.

CONSTANTINE, D.G. Rabies transmission by non–bite route. Pub. Health Rep. 77: 287–289, 1962.

DEAN, D.J. The fluorescent antibody test. In: Laboratory Techniques in Rabies. WHO Monograph Series N° 23, 2nd ed.: 59–68, Geneva, 1966.

DEAN, D.J. The Nylar test for measuring potency of antirabies vaccine. In: Laboratorv Techniques in Rabies. WHO Monograph Series N° 23, 2nd. ed.: 157, Geneva, 1977.

FUENZALIDA, E., O.P. LARGHI. Características de una cepa de virus rábico aislada del cerebro de Desmodus rotundus. Bol. Ofic. Sanit. Panameric. 73: 93–99, 1972.

HERNÁNDEZ–BAUMGARTEN, E.M., J. MORALES, C. ARELLANO, J. CAMPOS, B. LoPES, H.

PÉREZ. Evaluación de una vacuna comercial antirrábica inactivada para bovinos, producida en cultivo de tejidos (Alurabiffa). Tec. Pec. Mex. 30: 57–63. 1976.

HERNÁNDEZ–BAUMGARTEN, E.M., G. BULENGA. La prueba de microfocos fluorescentes: Una nueva técnica in vitro para titulación y pruebas de seroneutralización del virus rábico. Tec. Pec. Mex. 24: 41–46, 1973.

HERNÁNDEZ–BAUMGARTEN, E.M. La rabia paresiante bovina. In: Definición del problema y metodología de control. Ciencia Veterinaria. Vol. l.M. Chan, ed.: 104–131, 1976.

JENSEN, F.C., R.B.L. GWATKING, J.D. BIGGERS. A simple organ culture method which allows simultaneous isolation of specific types of cells. Exptl. Cell. Res. 34: 440–447, 1969.

JOHNSON, H.N. Vampire bat rabies in México. Am. J. Hyg. 47: 189–204,1948.

KAPLAN, M.M., T.J. WIKTOR, R.F. MAES, J.B. CAMPBELL, H. KOPROWSKI. Effect of polyions on the infectivity of rabies virus in tissue culture: Construction of a single–cycle growth curve. J. Virol. 1: 145–151, 1967.

KISSLING, E. Growth of rabies virus in non–nervous tissue culture. Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 98: 223–225, 1958.

KISSLING, R.E., D.R. REESE. Antirabies vaccine of tissue culture origin. J. Immunol. 91: 362–368, 1963.

KOPROWSKI, H., H.R. Cox. Studies on chick embryo–adapted rabies virus. I. Culture characteristics and pathogenicity. J. Immunol. 60: 533–538, 1948.

KUWERT, E., T.J. WIKTOR, F. SOKOL, H. KOPROWSKI. Hemagglutination by rabies virus. J. Virol. 2: 381–392, 1968.

MANCISIDOR, A. A.. El uso de una vacuna autógena en el control de un brote de derriengue en México. Tec. Pec. Mex. 5: 27–29, 1965.

MANCISIDOR, A. A., C. S. ARELLANO. Aislamiento de virus rábico en cultivos celulares a partir de saliva. Tec. Pec. Mex. 18: 89–92, 1971.

PAWAN, J. L. The transmission of paralytic rabies in Trinidad by the vampire bat (Desmodus rotundus inurinus). Ann. trop. Med. Parasit. 30: 101–131, 1936.

SEDWICK, W.F., T.J. WIKTOR. Reproducible plaquing system for rabies, lymphocytic choriomeningitis and other ribonecleic acid viruses in BHK–21/13S agarose suspensions. J. Virol. 1: 1224–1226, 1967.

SULKIN, S.E., R. ALLEN. Experimental rabies infection in bats. In: The Natural History of Rabies. Vol. II: 99–114. G. Baer, ed. Academic Press, N.Y., 1975.

STOKER, M., I. MAC PHARSON. Syrian hamster fibroblast cell line BKH–21 and its derivatives. Nature 203: 1355–1357, 1964.

SUREAU, P., C. ARELLANO, D. BATALLA. Evaluación de la eficacia de la vacuna antirrábica cepa 'ERA' in bovinos. II. Duración de inmunidad. Tec. Pec. Mex. 18: 16–21, 1971.

SZYFRES, B. Personal communication, Panamerican Zoonoses Centre, Buenos Aires, Argentina, 1970.

World Health Organization. Expert Committee in Rabies. Sixth report. WHO, Geneva, pp. 14–24, 1973.

World Health Organization. Report of German Green Cross/ WHO Workshop on Monoclonal Antibody in Rabies Diagnosis and Research, 1986.