Trabajos Originales

  • Detección de rotavirus en caprinos de San José de Maipo, Región Metropolitana. Chile

Resumen

Se estudió la presencia de rotavirus en 160 muestras fecales de caprinos menores de 4 meses de edad, con o sin diarrea, provenientes de 10 majadas de San José de Maipo, Región Metropolitana, utilizan­do la prueba de ELISA, microscopía electrónica, electroforesis del ARN viral e inoculación en culti­vos celulares MA-104.

Mediante ELISA se detectaron 25 muestras posi­tivas (15,6%); 15 sospechosas (9,4%) y 120 negati­vas (75%). De las muestras positivas 9 correspon­dían a cabritos menores de 1 mes (9/43); 16 a cabritos de 1 a 4 meses (16/117); 7 a cabritos con diarrea (7/45) y 18 a cabritos sin diarrea (18/115). No se encontró asociación entre edad, diarrea, y presencia de antígeno rotaviral (p > 0,05). En culti­vos celulares MA-104, inoculados con nueve mues­tras positivas en ELISA, se observó efecto citopáti­co semejante al causado por rotavirus, constatándo­se la presencia de antígenos rotavirales mediante ELISA y aglutinación en látex, y de electroferoti­pos rotavirales mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. En microscopía electrónica se ob­servaron partículas virales semejantes a rotavirus en una muestra positiva en ELISA. No se evidenciaron electroferotipos de rotavirus en 32 muestras anali­zadas por electroforesis del ARN viral. Se discuten los resultados obtenidos a base de la escasa infor­mación existente de rotavirus en cabritos.

Abstract

A search for rotavirus was performed in fecal samples of 160 goat kids less than 4 years old, with diarrhea or not, from ten goat herds of San José de Maipo Región Metropolitana, Chile. The techniques used were ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) electron microscopy, electrophoresis of viral RNA and inoculation in MA-104 cells.

By the ELISA test (Rotazyme II. Abbott (R)) 25 positive samples (15.6%), 15 suspicious (3,4%) arad 120 negatives (75%) were found. Nine of the positive samples were from kids less than one month old, and 16 from kids less than 4 months old; seven positive samples came from diarrheic kids (7/45), and 18 from non diarrheic kids (18/115). There were no significant differences between age, diarrhea, and presence of rotavirus antigens (p > 0.05). Electronic microscopy observation of one positive samples, showed viral particles resembled rotavirus. Nine strains produced characteristic cytophathic effect in MA-104 cells. Viral electropherotypes were not detected in 32 samples. It is discussed the results obtained according to the limited caprine rotavirus information.

Abstract

Se estudió la presencia de rotavirus en 160 muestras fecales de caprinos menores de 4 meses de edad, con o sin diarrea, provenientes de 10 majadas de San José de Maipo, Región Metropolitana, utilizan­do la prueba de ELISA, microscopía electrónica, electroforesis del ARN viral e inoculación en culti­vos celulares MA-104.

Mediante ELISA se detectaron 25 muestras posi­tivas (15,6%); 15 sospechosas (9,4%) y 120 negati­vas (75%). De las muestras positivas 9 correspon­dían a cabritos menores de 1 mes (9/43); 16 a cabritos de 1 a 4 meses (16/117); 7 a cabritos con diarrea (7/45) y 18 a cabritos sin diarrea (18/115). No se encontró asociación entre edad, diarrea, y presencia de antígeno rotaviral (p > 0,05). En culti­vos celulares MA-104, inoculados con nueve mues­tras positivas en ELISA, se observó efecto citopáti­co semejante al causado por rotavirus, constatándo­se la presencia de antígenos rotavirales mediante ELISA y aglutinación en látex, y de electroferoti­pos rotavirales mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. En microscopía electrónica se ob­servaron partículas virales semejantes a rotavirus en una muestra positiva en ELISA. No se evidenciaron electroferotipos de rotavirus en 32 muestras anali­zadas por electroforesis del ARN viral. Se discuten los resultados obtenidos a base de la escasa infor­mación existente de rotavirus en cabritos.

Abstract

A search for rotavirus was performed in fecal samples of 160 goat kids less than 4 years old, with diarrhea or not, from ten goat herds of San José de Maipo Región Metropolitana, Chile. The techniques used were ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) electron microscopy, electrophoresis of viral RNA and inoculation in MA-104 cells.

By the ELISA test (Rotazyme II. Abbott (R)) 25 positive samples (15.6%), 15 suspicious (3,4%) arad 120 negatives (75%) were found. Nine of the positive samples were from kids less than one month old, and 16 from kids less than 4 months old; seven positive samples came from diarrheic kids (7/45), and 18 from non diarrheic kids (18/115). There were no significant differences between age, diarrhea, and presence of rotavirus antigens (p > 0.05). Electronic microscopy observation of one positive samples, showed viral particles resembled rotavirus. Nine strains produced characteristic cytophathic effect in MA-104 cells. Viral electropherotypes were not detected in 32 samples. It is discussed the results obtained according to the limited caprine rotavirus information.

Contenido

Las infecciones entéricas constituyen una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en los animales domésticos, especialmente durante las primeras semanas de vida (Babiuk y col., 1985).

En la especie caprina los antecedentes sobre agentes etiológicos de diarrea neonatal son escasos. Lincicome, en 1982, asocia el parasitismo por hel­mintos y coccidias con este síndrome. Según Nagy y col. (1984) la principal causa de diarrea en cabri­tos es Cryptosporidium. Otros agentes descritos en relación a diarrea neonatal son: rotavirus (Scott y col., 1978; Nagy y col., 1983, 1984; Yvore y col., 1984); herpesvirus (Berríos y col., 1975); coronavi­rus (Nagy y col. 1983, 1984); adenovirus (Nagy y col., 1984); Escherichia coli (Nagy y col., 1983, 1984) y Cryptosporidium (Yvore y col., 1984).

Con respecto a rotavirus fue en Inglaterra, en 1978, donde se encontró, por primera vez rotavirus asociados a un brote de diarrea que afectó a 4 de 6 cabritos de 4 meses de edad. En dos muestras se observaron rotavirus mediante microscopía electró­nica, hallazgo que fue confirmado por inmunofluo­rescencia indirecta en células inoculadas (línea ce­lular LLC MK y cultivo primario de riñón de ter­nero).

Posteriormente, en Hungría, Nagy y col. (1983) detectaron rotavirus, por microscopía electrónica, en cabritos menores de 4 meses con diarrea (5/25) y sin diarrea (3/3). Otros agentes encontrados fueron: Cryptosporidium, coronavirus, E. coli y coccidia. En 1984, Nagy y col. detectaron rotavirus mediante ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) y microscopía electrónica, en 6 de 29 cabritos meno­res de 4 meses, con diarrea, y en 3 de 6 cabritos sin diarrea. Simultáneamente se determinó la presencia de adenovirus, coronavirus, E. coli K 99+ y Cryp­tosporidium. La infección con rotavirus y adenovi­rus fue confirmada mediante la detección de anti­cuerpos específicos.

En Francia, en 1984, Yvore y col. constataron la presencia de rotavirus, mediante ELISA, en cabri­tos pertenecientes a 22 majadas, sin establecer una relación aparente con la existencia de diarrea.

Evidencias serológicas de la infección por rota­virus en caprinos han sido informadas, aunque en forma muy general, por Woode y col. (1976) y Mc Nulty (1978). En un estudio serológico realizado por Takahashi y col. (1978) en Aomori, Japón, en 12 especies animales, utilizando como antígeno para la prueba de fijación del complemento, la cepa Lincoln de rotavirus bovino (NCDV), se determi­naron títulos de anticuerpos, entre 2 y 8, en 18 cabras adultas de un total de 30. Nagy y col. (1984) detectaron anticuerpos neutralizantes en 55 sueros pertenecientes a 81 cabritos (16 en 37 cabritos me­nores de 4 meses; 18 en 22 cabritos de 7 a 8 meses, y 21 de 22 adultos).

En Chile, en un estudio realizado en pequeños rumiantes del Zoológico Nacional de Santiago no se encontraron antígenos de rotavirus en heces de 9 cabras enanas adultas (Capra hircus) de un grupo de 27 animales, analizadas mediante ELISA*  (Be­rríos y col., 1988). Recientemente, Gorman y col. (1986) comunican el hallazgo de Cryptosporidium en 12 bovinos, 17 porcinos y 2 caprinos. Los cabri­tos, de corta edad o recién nacidos presentaban diarrea en el momento de tomar las muestras.

El objetivo de este trabajo es detectar la presen­cia de rotavirus en cabritos menores de 4 meses, con y sin diarrea, de la comuna de San José de Maipo, Región Metropolitana, utilizando las técnicas de ELISA, electroforesis del ARN viral, microscopía electrónica e inoculación en cultivos celulares MA­-104.

__________

* Rotazyme II Abbott
   Trabajo financiado por Proyecto A 1648-87. DTI. Universidad de Chile.

Material y métodos

En cabritos menores de 4 meses de edad se pesquisó la existencia de antígenos rotavirales mediante la técnica inmunoenzimática ELISA y electroforesis del ARN viral.

El muestreo se realizó, en noviembre y diciem­bre de 1986, en cuatro sectores de la comuna de San José de Maipo (laguna Negra, embalse El Yeso, Melosas; El Volcán; río Colorado, Lagunillas y El Toyo), obteniéndose 160 muestras fecales que pro­venían de 43 cabritos menores de 1 mes y 117 de 1 mes a menos de 4 meses. Las muestras se recolecta­ron directamente del recto y de la zona perianal, correspondiendo 115 a cabritos sin diarrea, y 45 a cabritos con diarrea, los que además presentaban depresión, disminución de la ingesta de leche o pasto, deshidratación, tendencia a la inmovilidad, temperatura normal o disminuida e inflamación de la zona perianal.

Cada muestra fue diluida al 20% en una solución tampón fosfato pH 7,4 y centrifugada a 1.200 x Gpor 15 minutos y a 8.000 x G por 20 minutos; los sobrenadantes obtenidos se mantuvieron a -20°C. La prueba de ELISA se realizó con el 'kit' comercial, Rotazyme II Abbott, que contiene perlas de poliestireno cubiertas con anticuerpos de cobayo antirrotavirus y un sistema enzima-sustrato forma­do por anticuerpos de conejo antirrotavirus conju­gados con peroxidasa de rábano picante y 0­fenilenediamina 2 HC l. La lectura se hizo visual­mente comparando los resultados obtenidos con una carta de colores, interpretando como positivas las muestras con 2 a 4 cruces, sospechosas con una cruz y negativas con ± y 0 (Abbott Laboratories. Diagnostic Division, 1984).

La electroforesis del ARN viral se realizó con el 'kit' Rotagel del Instituto de Salud Pública de Chi­le, de acuerdo a la técnica descrita por Espejo y col. (1978).Cinco muestras positivas (4+) en ELISA, se observaron en un microscopio electrónico Philips EM 300, mediante tinción negativa con fosfotungs­tato de potasio 2% y pH 6,0 (Flewett, 1978).

Nueve muestras positivas (3 y 4+) en ELISA, se inocularon en células MA-104, previo tratamiento con tripsina (8 µg/ml) (Chasey y Banks, 1986).

El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba de independencia de X2.

Resultados

Mediante la prueba de ELISA se detectaron 25 muestras positivas (15,6%), 11 con 4+, 7 con 3+ y 7 con 2+; 15 sospechosas (9,4%) y 120 negativas (75%).

Las muestras positivas provenían de cabritos de El Volcán (2); Melosas (3); embalse El Yeso (8) y río Colorado - El Toyo (12); 9 de ellas correspon­dían a cabritos menores de 1 mes (9/43) y las 16 restantes a cabritos de 1 a 4 meses (16/117); 7 a cabritos con diarrea (7/45) y 18 a cabritos sin dia­rrea (18/115). No se encontró asociación entre edad, diarrea y presencia de antígeno rotaviral (p > 0,05).

En una muestra positiva de ELISA con 4+ se observaron, en microscopía electrónica, partículas virales con un diámetro aproximado de 65 nm y una morfología semejante a la descrita para los rotavirus (figura 1).

Figura 1. Partículas rotavirales en heces de cabritos (1 12.500 x).

En cultivos celulares MA-104 inoculados con nueve muestras positivas en ELISA con 3 y 4+, se observó efecto citopático semejante al causado por rotavirus y caracterizado por la presencia de células vacuolares y redondas, con desprendimiento celu­lar, aproximadamente a los 5 días de su inocu­lación. Este efecto se apreció luego de tres pasajes seriados, determinándose en los sobrenadantes la presencia de antígenos rotavirales mediante las pruebas de ELISA (Rotazyme II, Abbott) y agluti­nación en látex (Slidex Rota-kit bio Merieux); y de electroferotipos de rotavirus mediante electrofore­sis (Rotagel).

En 32 muestras analizadas por electroforesis (Rotagel) no se evidenciaron electroferotipos co­rrespondientes a rotavirus.

Discusión y agradecimientos

La detección de rotavirus en heces de cabritos me­nores de 4 meses de edad con y sin diarrea, confir­ma la presencia de estos virus en la especie caprina reportada anteriormente en Inglaterra (Scott y col., 1978), Hungría (Nagy y col., 1983, 1984) y Francia (Yvore y col., 1984).

El 15,6% de positividad obtenido con la prueba de ELISA es inferior al 26,6% detectado en capri­nos por Nagy y col. (1984) con la misma técnica; sin embargo, este valor se encuentra en el rango de los obtenidos en Chile: en terneros 15,6% y 23,8% (Berríos y col., 1987), 15,7% (Reinhardt y col., 1986), 24,6% (Núñez, 1986); potrillos 20% (Be­rríos y col., 1987); corderos 9,4% (Berríos y col., 1988); cerditos 14,3% (Rivas, 1982), 14,7% (Rein­hardt y col., 1986), 23% (Pinochet, 1986).

La observación de partículas virales semejantes a rotavirus en un tamaño de aproximadamente 65nm, y en su morfología en que los capsómeros de la cápside interna se disponen como proyecciones se­mejantes a rayos de una rueda de carreta, ratifica la presencia de rotavirus en cabritos positivos en ELISA.

Con respecto a la negatividad del estudio por elecroforesis del ARN viral, esta situación podría ser explicada por la existencia de una menor canti­dad de partículas rotavirales que las necesarias para que se visualicen los electroferotipos, estimada entre 107 y 1010 partículas de virus por gramo defecas (Espejo y col., 1978), o por la presencia de una gran cantidad de partículas virales libres de ARN (Babiuk y col., 1985).

El rol etiológico de los rotavirus en la enteritis neonatal en diversas especies animales, ha sido establecido en conexión con otros virus, bacterias o parásitos enteropatógenos. En el caso de los capri­nos, solamente existe un trabajo experimental en que se inocularon 30 cabritos con material fecal filtrado y no filtrado que contenía Cryptospori­dium, produciéndose un cuadro de diarrea con una duración entre 0,6 y 3,3 días promedio. En 19 cabritos se detectó Cryptosporidium y en 5 cabritos adenovirus y rotavirus, mediante ELISA y micros­copía electrónica (Nagy y col., 1984).

En cuanto a la no asociación entre las variables edad y diarrea, con respecto a la presencia de rotavi­rus en las heces de los cabritos estudiados, cabe señalar que en los diversos estudios realizados en el país, solamente se ha encontrado en corderos aso­ciación entre diarrea y rotavirus (Berríos y col., 1988). Para entender mejor la etiología de las dia­rreas neonatales es necesario considerar otras varia­bles que han sido asociadas con este problema, tales como dieta, privación de calostro, medidas de ma­nejo, estado sanitario, temperatura ambiental, hu­medad y estrés (Manzullo, 1985).

Finalmente, es importante indicar que la adapta­ción de nueve cepas de rotavirus caprino en cultivos celulares MA-104, situación no descrita en la litera­tura consultada, permitiría caracterizarlas y estu­diar su patogenicidad en caprinos y otras especies.

Agradecimientos

Se agradece la colaboración a Dra. Olga Palacios F. y Víctor Monasterio C.

Referencias

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Recibido en octubre de 1988, aprobado en diciembre de 1988.