Comunicaciones

  • Evaluación de los tiempos de resguardo en la leche de vacas en lactancia de dos antibióticos de larga acción: amoxicilina LA y oxitetraciclina LA

Resumen

En el presente trabajo se evalúan los períodos de resguardo en leche de vacas tratadas con dos antibióticos de larga acción (LA) y de reciente introducción a la clínica veterinaria en nuestro país (Oxitetraciclina LA; Amoxicilina LA). Ambos fueron administrados vía intramuscular profunda en vacas sanas en período de lactancia.

Estos períodos fueron evaluados midiendo las concentraciones lácteas en función del tiempo, utilizando la técnica microbiológica de cilindros en placa, y como cepa bacteriana Bacillus subtilis BGA. Se elaboraron curvas de referencia para cada antibiótico con la finalidad de transformar los halos de inhibición (cm) a unidades de concentración (µg).

La sensibilidad de la técnica fue de 0, 15 µg/ml y 0,019 µg/ml para oxitetraciclina y amoxicilina, respectivamente.

Muestras seriadas de leche provenientes de 20 vacas, permiten determinar que los tiempos de resguardo fueron de 156 horas para oxitetraciclina LA, cuando ésta se administra en una dosis de 20 mg/kg vía intramuscular profunda. Para amoxicilina LA administrada de la misma forma, estos períodos fueron más cortos, siendo de 36 y 72 horas dependiendo de la dosis administrada (10 y 20 mg/kg, respectivamente).

Palabras claves: Período de resguardo; oxitetraciclina LA, amoxicilina LA, vacas en lactancia.

 

Palabras Claves

Período de resguardo; oxitetraciclina LA, amoxicilina LA, vacas en lactancia

Abstract

Twenty cows were treated by intramuscular route with two long acting (LA) antibiotics, oxytetracycline (20 mg/Kg) and amoxyciline (10 and 20 rng/Kg) for measuring withholding times. Milk samples from these milking cows were obtained each 12 hours and analized for antibiotic residues through the cylindres plate method. The test micro organism was Bacillus subtilis BGA.

The sensitivity for- this test was 0,15 µg/ml for oxytetracycline and 0,019 µg/ml for amoxyciline. The withholding time were 96 to 156 hours for oxytetracycline and 36 and 72 hours for amoxyciline administred at 10 and 20 rng/Kg respectively.

Keywords

Withholding time; oxytetracycline LA; amoxyciline LA; milking cows

Introducción

El empleo de antibióticos con fines curativos o profilácticos en las vacas lecheras, determinan la presencia de concentraciones residuales de estas drogas en diferentes tejidos y fluidos, por períodos variables que se extienden después de finalizada la terapia.

Estas concentraciones provocan alteraciones en la elaboración de derivados lácteos, al inhibir el desarrollo de la flora ácido láctica necesaria para obtener productos tales como queso y yogurt (Allison 1985; Brady y Katz, 1988). Además, pueden constituir un riesgo para la salud humana, ya que los tratamientos de pasteurización lenta o rápida no logran la destrucción de la mayor parte de los antibióticos (Okolo, 1986), razón que ha sido motivo de preocupación médica y de la opinión pública en general. Al respecto, es interesante mencionar el trabajo de Brady y Katz (1988), quienes analizaron muestras de leche de diferentes marcas comerciales y con diferentes tratamientos de pasteurización, encontrando un 33% de las muestras positivas al test de inhibidores y de éstas, el 71 % contenían tetraciclina.

Los riesgos en la población humana fundamentalmente se han asociado a la resistencia microbiana de algunas cepas patógenas, como Salmonellas, por ejemplo (Organización Mundial de la Salud, 1984), y con reacciones de hipersensibilidad de grado e intensidad variable (Ryan y col., 1986). Algunos antibióticos pueden provocar efectos negativos específicos; tal es el caso del cloramfenicol que como droga es una de las principales causas de anemia aplásica, razón por la cual se ha limitado su uso en países de la Comunidad Europea e incluso prohibido en Estados Unidos de América (Keukens y col., 1992).

La transcendencia de estas situaciones ha estimulado el desarrollo de diferentes métodos de control de residuos con el fin de establecer los períodos de resguardo, correspondiendo éstos al tiempo que transcurre entre la última administración del antibiótico y el momento en que las concentraciones de leche o tejidos se encuentran dentro de los niveles de tolerancia o inocuidad para el consumidor. Esto ha permitido establecer normas sanitarias con carácter legal en diferentes países de Europa, Canadá y Estados Unidos de Norteamérica (Organización Mundial de la Salud (OMS), 1984; Booth y Harding, 1986; Food and Drug Administration (FDA) (1991), que como se comprende, éstas están adecuadas a las características fisicoquímicas de la droga, dosis, vía de administración y excipientes de cada forma farmacéutica, incluyendo la rotulación de este período en los envases por parte de las industrias farmacéuticas (Wayne, 1993).

La forma más simple de disminuir la incidencia de residuos de antibióticos es respetando los períodos de resguardo o supresión que debe tener la leche, carne u otros tejidos provenientes de animales tratados con estos fármacos. Al respecto, es interesante mencionar que en Francia, el Laboratorio Nacional de Medicamentos junto con la Federación Nacional de los Productores de Leche, periódicamente están realizando estudios al respecto para mantener actualizados estos tiempos de acuerdo a los antibióticos y formas farmacéuticas presentes en el mercado (Moretain y Boisseau, 1987).

En relación a la metodología de detección de residuos, los microbiológicos siguen considerándose los más prácticos y económicos (Scott y col., 1991; Culors y col., 1992), aún cuando existen otros más sensibles, especialmente los que utilizan cromatografía o elementos inmunológicos, pero sus costos limitan su difusión, sólo justificándose en instituciones supervisoras a nivel gubernamental, al menos por ahora. Así por ejemplo, el Commonwealth of Pensylvania (USA), utilizan como métodos oficiales para detectar residuos los test microbiológicos (Sischo y Burns, 1993).

Hoy en día en el mercado de productos veterinarios existe una gran variedad de preparaciones de antibióticos de larga acción o liberación retardada. Estos productos, si bien tienen la ventaja de facilitar el manejo de los animales, ya que se han diseñados con el fin de reducir la frecuencia de dosificación manteniendo niveles sanguíneos por un mayor período (habitualmente se administran en dosis única), tienen el inconveniente de que los períodos de resguardo para estos productos son más prolongados. Por ejemplo, para penicilina G procaína, antibiótico de liberación retardada, es de 10 días (Dwight, 1988).

Considerando estos antecedentes nos pareció de interés determinar los períodos de resguardo de dos antibióticos de introducción reciente en nuestro país y con características de larga acción: amoxicilina LA y oxitetraciclina LA. En el primer caso, se trata de un antibiótico betalactámico de amplio espectro, sobre el cual no parece existir en la literatura a nuestro alcance, estudios sobre este aspecto; en el segundo, la oxitetraciclina estudiada es, desde un punto de vista terapéutico, similar a las tradicionales de larga acción pero con un sistema de cosolvente que, de acuerdo al fabricante, permite una eliminación más rápida con un tiempo de resguardo inferior al tradicional. Ambos antibióticos se aplican por vía intramuscular y las determinaciones de residuos se realizan en leche de vacas lecheras estabuladas y en lactancia.

 

  Trabajo financiado por: Proyecto DTI. Universidad de Chile A-3518

Materiales y métodos

Se utilizaron 20 vacas recién paridas sin antecedentes de haber recibido tratamiento con antibióticos a lo menos 30 días antes de la experiencia y pertenecientes a la Estación Experimental La Platina, del Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA).

Los animales se dividieron en 2 grupos de 10 vacas:

 Grupo A: recibió vía im 20 mg/kg de Oxitetraciclina LA.
 Grupo B:

recibió Amoxicilina LA por la misma vía de administración. Este grupo se subdividió en 2, que recibieron diferentes dosis de este fármaco: Grupo B 1 10 mg/kg y B2 20 mg/kg.

Las muestras fueron obtenidas según las normas del National Mastitis Council (1990), recibiendo en cada frasco estéril, iguales volúmenes de leche desde los 4 cuartos mamarios; éstas fueron refrigeradas y transportadas al laboratorio para ser procesadas antes de 24 horas.

La primera muestra se realizó previo al inicio del tratamiento a objeto de verificar la ausencia de inhibidores de origen químico o inhibidores inespecíficos que podrían ser la causa de falsos positivos. El muestreo se continuó realizando con un intervalo de 12 horas después de la administración del fármaco, hasta el momento en que las concentraciones estuviesen dentro de los niveles de tolerancia recomendados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) o la Food and Drug Administration (FDA).

Las concentraciones de antibióticos en función del tiempo, se determinaron mediante la Técnica Microbiológica de Cilindros en Placa estandarizada por la Association of Official Analytical Chemists─AOAC─ (1984), utilizándose como cepa bacteria Bacillus subtilis BGA. Previo al análisis, todas las muestras fueron sometidas a 100 °C por 30 segundos con la finalidad de destruir los inhibidores naturales, fundamentalmente aquellos termorresistentes como son lisozima y ribonucleasa (Rama y col., 1985).

Después de una incubación de 18 hrs a 37°C, se realizaron las lecturas de los halos de inhibición mediante un Vernier de precisión (calipers), (AOAC, capítulo 16.138); estos fueron expresados en cm. Por conversión a través de una curva de referencia previamente elaborada para cada droga en estudio, éstos se transformaron a concentraciones, expresándose en µg/ml.

Curvas de referencia

Las curvas de referencia para cada antibiótico se realizaron utilizando la técnica microbiológica descrita anteriormente.

Para preparar las soluciones de antibióticos se utilizó Amoxicilina Trihidrato con una potencia de 864,5 mcg/mg y Tetraciclina HC 1 con una potencia de 972,8 mcg/mg, que son las presentaciones de estas drogas en las fórmulas farmacéuticas en estudio. Para el cálculo de las concentraciones se utilizó la fórmula descrita por Anhalt y Washington II (Lennett, 1985), y a partir de ella se prepararon concentraciones decrecientes, tomando como concentración inicial de referencia la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), correspondiente a cada droga. Como solvente se utilizó agua destilada y leche libre de antibióticos, esta última fue obtenida de animales clínicamente sanos con niveles trazas de células somáticas.

Cada concentración de antibiótico fue analizada 10 veces, obteniéndose para cada caso su promedio (x) y desviación estándar (DS). Estos resultados permitieron realizar un Análisis de Regresión Exponencial, obteniéndose una función que fue considerada como curva de referencia para la conversión de los halos (cm) a concentración (µg/ml) (Caballero, 1985).

Determinación de los tiempos de resguardo

Para determinar los tiempos de resguardo de cada droga, posterior a la administración de éstas, vía intramuscular, se procedió a tomar las muestras de leche cada 12 horas, de acuerdo a las normas descritas anteriormente. En el laboratorio se determinaron las concentraciones en función del tiempo, definiéndose este período en el momento en que en leche se detectaron concentraciones iguales o similares a las recomendadas por la OMS o la FDA como niveles de tolerancia.

Análisis de los resultados

Para el análisis de las curvas de referencia, cada medición de antibiótico expresado en cm de halo de inhibición, fue repetido diez veces, obteniéndose para cada valor su promedio, desviación estándar y coeficiente de variación. Estos resultados permitieron realizar un análisis de regresión exponencial obteniéndose una función que se consideró como curva de referencia para la conversión de los resultados obtenidos en cm a concentraciones de antibiótico (µg).

Los halos de inhibición de ambas curvas de referencia fueron analizadas a través de un análisis de varianza (ANDEVA) con objeto de detectar diferencias al usar como solvente leche o agua.

Resultados

1. Determinaciones de Oxitetraciclina

Al realizar las curvas de referencia para Oxitetraciclina LA, independiente del solvente utilizado, la concentración mínima detectada correspondió a 0,156 µg/ml de droga pura. Al comparar los halos de inhibición obtenidos con ambos solventes, fue posible detectar diferencias significativas (p < 0,05) en las concentraciones más pequeñas (0,156; 0,312 y 0,625 µg/ml), visualizándose halos significativamente mayores al usar agua destilada estéril (Figura 1).

FIGURA 1 PROMEDIO DE HALOS DE INHIBICIÓN PARA OXITETRACICLINA EN LECHE Y AGUA

Sin embargo, con el fin de disminuir eventuales errores comparativos entre las curvas de referencia y la medición de concentraciones del antibiótico en las muestras, se optó por utilizar como referencia aquella curva que empleó leche como solvente. La correlación entre concentración de oxitetraciclina y tamaño del halo de inhibición en el análisis de ésta, fue igual a 0,98 (Figura 2) y la ecuación correspondiente fue la siguiente:

Concentración de oxitetraciclina: exp (halo -2.049697) (0.449802) donde la concentración de Oxitetraciclina se expresó en µg/ml y la zona de inhibición fue medida en cm.

FIGURA 2 CURVA DE REFERENCIA PARA OXITETRACICLINA LA EN LECHE (r = 0,98)

Estos valores permitieron estimar los períodos de resguardo para Oxitetraciclina LA, administrada en dosis de 20 mg/kg; fluctuando éstos entre 96 y 156 horas al considerar como positivas todas las muestras que presentaron una zona de inhibición superior o igual a 1,1 cm correspondiente a 0, 12 µg/ml (Cuadro 1).

CUADRO 1 CONCENTRACIONES DE OXITETRACICLINA LA (20 MG/KG) A DIFERENTES TIEMPOS DE MUESTREO

Horas

-

12

48

72

84

96

108

120

132

144

156

H C

2 0,9

2,0 0,90

1,8 0,57

1,6 0,37

1,5 0,29

1,3 0,19

1,3 0,19

1,3 0,19

 --  --

 --  --

2

H C

1,8 0,57

1,7 0,46

1,3 0,19

1,3 0,19

1,3 0,19

1,2 0,15

1,2 0,15

1,1 0,12

 --  --

 --  --

3

H C

2,35 1,95

1,45 0,26

1,5 0,29

1,3 0,19

1,2 0,15

1,2 0,15

1,1 0,12

1,1 0,12

 --  --

 --  --

4

H C

2,2 1,4

2,0 0,9

1,4 0,24

1,3 0,19

1,3 0,19

1,2 0,15

1,2 0,15

1,1 0,12

 --  --

 --  --

5

H C

2,3 1,74

1,8 0,57

1,6 0,37

1,3 0,19

1,1 0,12

1,1 0,12

 --  --

 --  --

 --  --

 --  --

6

H C

2 0,9

1,9 0,72

1,3 0,19

1,3 0,19

1,3 0,15

1,2 0,15

1,2 0,15

1,1 0,12

1,1 0,12

1,1 0,12

7

H C

2 0,9

1,4 0,24

1,3 0,19

1,2 0,15

1,1 0,12

 --  --

 --  --

 --  --

 --  --

  --  --

8

H C

2,2 1,4

1,3 0,19

1,2 0,15

1,2 0,15

1,1 0,12

  --  --

 --  --

 --  --

  --  --

 --  --

9

H C

2 0,9

1,4 0,24

1,2 0,15

1,2 0,15

1,1 0,12

 --  --

 --  --

 --  --

 --  --

  --  --

10

H C

2,1 1,12

1,4 0,24

1,2 0,15

1,2 0,15

1,2 0,15

1,1 0,12

 --  --

 --  --

 --  --

  --  --

H = Diámetro halo de inhibición (cm) C = Concentración de la droga (µg/ml)

2. Determinaciones de Amoxicilina

La mínima concentración detectada para amoxicilina como droga pura, correspondió a 0,0 19 µg/ml equivalente a un halo de inhibición igual a 1,1 cm. En la figura 3 se presentan los valores obtenidos en ambos solventes, esto es, en agua y leche existiendo diferencias significativas sólo en dos concentraciones (0,078; 1,25. µg/ml).

FIGURA 3 PROMEDIOS DE HALOS DE INHIBICIÓN PARA AMOXICILINA LA EN LECHE Y AGUA

Para la interpretación de los resultados se seleccionó como referencia aquella curva que utilizó leche como solvente, siendo la correlación entre concentración de amoxicilina y halos de inhibición de 0,98 (Figura 4) y la ecuación de los resultados la siguiente:

Concentración de amoxicilina: exp (halo-2.5343 1) (343715) donde la concentración de la droga se expresó en pg/ml y la zona de inhibición en cm.

FIGURA 4 CURVA DE REFERENCIA PARA AMOXILINA LA EN LECHE (r = 0,98)

Al evaluar los períodos de resguardo se consideraron como positivas aquellas muestras que presentaron un halo de inhibición igual o mayor a 1,1 cm.

Éstos, fueron dosis dependientes, determinándose un período de resguardo de 36 horas cuando se administró 10 mg/kg y de 60-72 horas cuando la dosis fue de 20 mg/kg (ver cuadros 2 y 3).

CUADRO 2 CONCENTRACIONES DE AMOXICILINA LA (10 MG/KG) A DIFERENTES TIEMPOS DE MUESTREO

Vaca

Horas

 

12

24

36

48

60

72

84

96

1

H C

1,2 0,05

1,1 0,034

1,1 0,034

-- --

-- --

-- --

-- --

-- --

2

H C

1,1 0,034

1,1 0,034

1.1 0,034

-- --

-- --

-- --

-- --

-- --

3

H C

1,2 0,05

1,1 0,034

1,1 0,034

-- --

-- --

-- --

-- --

-- --

4

H C

1,2 0,05

1,1 0,034

1,1 0,034

-- --

-- --

-- --

-- --

-- --

5

H C

-- --

-- --

-- --

-- --

-- --

-- --

-- --

-- --

H = Diámetro halo de inhibición (cm) C = Concentración de la droga (µg/ml)

CUADRO 3 CONCENTRACIONES DE AMOXICILINA LA (20 MG/KG) A DIFERENTES TIEMPOS DE MUESTREO  

Vaca

Horas

-

12

24

36

48

60

72

84

96

1

H C

1,6 0,15

1,5 0,11

1,2 0,05

1,1 0,034

 --  --

 --  --

 --  --

 --  --

2

H C

1,7 0,20

1,8 0,27

1,2 0,05

1,2 0,05

1,2 0,005

1,1 0,034

 --  --

 --  --

3

H C

1,9 0,36

1,6 0,15

1,2 0,05

1,1 0,034

1,1 0,034

 --  --

 --  --

 --  --

4

H C

1,6 0,15

1,4 0,08

1,2 0,05

1,1 0,034

 --  --

 --  --

 --  --

 --  --

5

H C

1,4 0,08

1,2 0,05

1,1 0,034

 --  --

  --  --

 --  --

 --  --

 --  --

H = Diámetro halo de inhibición (cm) C = Concentración de la droga (ug/ml)

Discusión

El análisis de las curvas de referencia permite comprobar que la técnica microbiológica empleada es adecuada para el análisis de oxitetraciclina y amoxicilina, dado que presentó una muy buena sensibilidad, pues las concentraciones mínimas detectadas se encuentran dentro de los niveles de tolerancia (oxitetraciclina 0,15 µg/ml; amoxicilina de 0,01 µg/ml), recomendados por la Organización Mundial de la Salud (Booth y Harding, 1986) y la Food and Drug Administration (1991).

Nuestros resultados corroboran trabajos de investigadores internacionales, quienes indican que lastécnicas microbiológicas siguen siendo las que presentan mejores resultados para evaluar los tiempos de resguardo en la leche de animales tratados con antimicrobianos, fundamentalmente por su buena sensibilidad frente a la mayoría de los antibióticos, bajo costo y fácil manejo (Rajkowski y col., 1986; Scott y col., 1992, Sischo y Burns, 1993).

El análisis de las concentraciones lácteas en función del tiempo para conocer el período de resguardo de oxitetraciclina LA, permite apreciar que, a pesar de que las concentraciones terapéuticamente activas permanecen en leche sólo 12 horas, las concentraciones residuales son detectadas hasta 156 horas postadministración, equivalente aproximadamente a 7 días.

A este respecto es posible recomendar un período más prolongado, considerando el acoplamiento con calcio de oxitetraciclina. Sin embargo, la magnitud de este fenómeno no es posible determinarla con el método empleado, pero sí podríamos asumir que las diferencias significativas entre los solventes utilizados en las curvas de referencia se deberían a este fenómeno, dado que aparece un halo de inhibición bastante mayor cuando se utilizó agua.

No existen antecedentes en la literatura a nuestro alcance sobre la medición de este fenómeno; sin embargo, es interesante mencionar un trabajo de Brady y Katz (1988), quienes determinaron concentraciones residuales de tetraciclina en leche, sin considerar el acoplamiento con calcio, concluyendo que no habían diferencias entre una técnica microbiológica y el test de Charm (test rápido que utiliza antibióticos marcados).

La variabilidad individual observada en relación a los tiempos de resguardo, los cuales fluctuaron entre un mínimo de 96 horas y un máximo de 156 horas, puede ser atribuida principalmente a las diferencias fisiológicas entre los individuos, tal cual ha sido mencionado por Prescott y Baggot (1988), razón por la cual actualmente se le asigna una gran importancia a los estudios farmacocinéticos de las drogas como metodología para evaluar y enfrentar con mayor aproximación estos períodos (Mercer, 1988).

Respecto a Amoxicilina LA, se observaron diferencias en los períodos de resguardo en relación a las dosis administradas. En efecto, duplicando la dosis desde 10 a 20 mg/kg, se determinó un incremento de 36 a 72 horas en estos lapsos de tiempo. Este hecho ha sido mencionado por otros autores, indicando que existe dosis-dependencia en la duración de los períodos de resguardo, de modo que al aumentar las dosis por encima de las recomendaciones de los fabricantes, se deben aumentar estos períodos (Seymour y col., 1988; Oliver y col., 1990).

Es importante hacer notar que los períodos de resguardo obtenidos en este trabajo, tanto para Amoxicilina LA como para Oxitetraciclina LA, fueron coincidentes a los indicados por el laboratorio farmacéutico en las presentaciones comerciales de ambos productos, lo cual confirma lo señalado por diversos autores, en el sentido de que siguiendo las normas indicadas por las empresas farmacéuticas en cuanto a vías de administración y dosis, no debieran presentarse problemas de residuos de antibióticos en leche (Prange y col., 1984; Oliver y col., 1990).

Tal vez llame la atención no haber utilizado una dosis más de Oxitetraciclina LA, pero es necesario recordar que dosis superiores ejercen efectos irritantes marcados, sin mayor ventaja terapéutica.

Finalmente, parece de interés plantear la importancia de futuros estudios que involucren una evaluación integral de la problemática de residuos de antibióticos y por lo tanto incluyan estudios epidemiológicos (Kaneene y Ahl, 1987), así como también señalar que el método de detección señalado en este trabajo es adecuado para establecer los períodos de resguardo de oxitetraciclina y amoxicilina.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen la colaboración de la Dra. Erika Getsche de la Universidad Austral de Chile, por la donación de la cepa bacteriana Bacillus subtilis BGA y la valiosa información otorgada; a la Estación Experimental La Platina por facilitar los animales utilizados en el presente estudio y al Laboratorio Chile por la donación de las drogas.

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Recibido el 26 de octubre de 1994, aprobado el 20 de abril de 1995.