Trabajos Originales

  • Piscirickettsiosis: lesiones en salmón del atlántico (Salmo salar) infectados naturalmente con Piscirickettsia salmonis
  • Piscirickettsiosis: lesiones en salmón del atlántico (Salmo salar) infectados naturalmente con Piscirickettsia salmonis

Resumen

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Palabras Claves

enfermedades en salmones, rickettsia, histopatología, depresión inmune

Abstract

Three groups of Atlantic salmon (Salmo salar) naturally infected with Piscirickettsia salmonis were analyzed by necropsy and histopathology. Fish were collected from saltwater farmings in the Southern Chile. In group 1 fish did not show clinical signs of the disease. In group 2, fish showed mild signs of piscirickettsiosis and the group 3 were severely affected and most of them were moribund. Lesions were more severe and extensive in the group 3, but necrosis and endothelial lesion were present in a variety of tissues in all the groups. The main lesions were necrosis of hematopoietic tissue in spleen and kidney. Inflammatory response was scarce specially in group 3. Necrosis of neurons and endothelial cells of brain was also observed and P. salmonis was present in the cytoplasm of some neurons. The lesions in the lymphoid tissue of spleen and kidney and the depletion of immunocompetent cells could predispose the fish to secundary infection by other opportunistic or pathogenic agents.

Keywords

Salmon disease, rickettsia, histopathology, immune depression

Introducción

Las enfermedades producidas por rickettsia son ampliamente reconocidas en animales vertebrados superiores y en el hombre, desde donde se han podido aislar y caracterizar una serie de estos microorganismos. En relación a los animales acuáticos, hasta hace algunos años sólo se había logrado observar agentes similares a rickettsias en cortes de tejido e improntas de órganos en algunos moluscos y peces, sanos o enfermos; sin embargo, no se había logrado replicarlos y/o caracterizarlos in vitro (Wolf, 1981; Fryer y col., 1990).

A partir de 1989 en el sur de Chile se ha presentado una nueva enfermedad, con altas mortalidades, en salmones cultivados en balsas-jaulas en fase marina, denominada «Síndrome del salmón coho», «Síndrome de Huito» o actualmente piscirickettsiosis (Bravo y Campos, 1989; Larenas y col., 1994), y que afecta a diversas especies de salmonídeos. El agente etiológico corresponde a la primera rickettsia aislada y caracterizada desde animales acuáticos (Fryer y col. 1990; Cvitanich y col., 1991), y es denominado actualmente como Piscirickettsia salmonis (P. salmonis) (Fryer y col., 1992).

Este patógeno es un parásito intracelular obligado, citopático para diferentes líneas celulares de salmones y algunas de peces de aguas cálidas. Es Gram negativo, pleomórfico, habitualmente cocoide, en pares o en forma de anillo y de un tamaño entre 0,5 - 1,5 µm de diámetro (Fryer y col., 1990).

Un microorganismo similar a P. salmonis ha sido recientemente descrito en Canadá, en cortes de tejido de salmón chinook (Oncorhynchus tshawytscha) (Brocklebank y col., 1992; Kent, 1992); sin embargo, la mortalidad nunca ha sido elevada a pesar de que se sospecha que el microorganismo ha estado presente en esta especie desde el año 1970 (Kent, 1992). En estudios recientes existen antecedentes de observaciones de microorganismos similares a rickettsias en salmones, en Noruega (Olsen y col., 1993), e Irlanda (Rodger y Drinan, 1993), que reaccionan positivamente con anticuerpos policonales anti P. salmonis.

En el presente trabajo se describen las lesiones macroscópicas y microscópicas producidas en la infección natural por P. salmonis, en salmón del Atlántico (Salino salar) divididos en tres grupos, de acuerdo con la presencia y severidad de los signos y síntomas clínicos de la enfermedad.

 

  Financiado por Proyectos DTI Universidad de Chile A 3246-9222 y FONDECYT 1931134

Materiales y métodos

Se analizaron 40 salmones del Atlántico, de aproximadamente 800 g de peso, cultivados en balsas-jaulas en el mar y provenientes de cuatro pisciculturas de la Décima Región del país. Los peces fueron clasificados de acuerdo con la severidad de su sintomatología en cuatro grupos, como se detalla a continuación:

Grupo 1 (n = 10). Peces positivos a la presencia de P.salmonis pero que no presentaron signos clínicos de la enfermedad. Grupo 2 (n = 10). peces positivos a la presencia del agente, con signos clínicos leves de la enfermedad. Grupo 3 (n = 10). Peces positivos a la presencia del agente y que se encontraban moribundos. Grupo control (n = 10). Peces negativos a la presencia del agente rickettsial y aparentemente sanos.

Los cuatro grupos fueron tomados en diferentes días, durante los meses de invierno. Para el muestreo se seleccionaron pisciculturas que no habían presentado mortalidades asociadas a otros agentes etiológicos en los últimos 6 meses, de acuerdo a los registros de diagnóstico de sus propios laboratorios.

El diagnóstico de positividad a piscirickettsiosis fue proporcionado inicialmente por cada empresa y posteriormente corroborado en nuestros laboratorios mediante la observación de la rickettsia en frotis sanguíneo e improntas de hígado y riñón teñidos con solución de Giemsa.

Cada pez fue obtenido vivo, sacrificado con una sobredosis de anestésico aplicado al agua y necropsiado. Para el estudio histopatológico se tomaron muestras de branquias, corazón, intestino medio, ciegos pilóricos, hígado, bazo, riñón anterior y posterior y encéfalo. Cada órgano fue fijado en formalina tamporada al 10% (pH:7,0), incluido en parafina y cortado a 5 µm de espesor.

Las muestras obtenidas, en duplicado, fueron teñidas con hematoxilina y eosina (HE) y azul de toluidina (AT) pH: 3,0 (0,02%). La tinción HE fue utilizada para determinar las lesiones en los diferentes tejidos y AT para detectar el microorganismo en muestras paralelas, ya que esta última tinción facilita la observación de esta bacteria (Larenas y col., 1994). Las muestras fueron teñidas con AT por 1 hora y en caso del riñón, se sometieron previamente a una inmersión en agua oxigenada (H202) de 50 vol por 20 horas, para oxidar la melanina, evitándose así la posibilidad de identificar estos gránulos como positivos a rickettsia.

Resultados y discusión

Todos los peces muestreados mostraron una escasa cantidad de Renibacterium salmoninarum, agente causal del «Bacterial Kidney Disease» (BKD) detectado mediante frotis directo de riñón teñido con Gram.

En relación a los signos clínicos, éstos concordaron con los previamente descritos en salmón coho (Bravo y Campos, 1989). Los más característicos fueron el oscurecimiento de la piel, anorexia y los de tipo nervioso, caracterizados por un nadar errático, incoordinado y lento, el cual fue observado principalmente en el grupo de peces moribundos.

En los tres grupos de peces (1, 2 y 3) las lesiones macroscópicas e histopatológicas fueron similares a las descritas para el salmón coho (Cubillos y col., 1990, Cvitanich y col., 1991; Branson y Nieto, 1991). La severidad de las alteraciones de los tejidos estuvo relacionado con la intensidad de la signología clínica, de tal manera que las lesiones más marcadas se observaron en el grupo de peces moribundos y en menor grado, en peces con y sin signos, respectivamente. Las alteraciones encontradas en el grupo 1, demostrarían que los cambios morfológicos se presentan antes de que se observen los primeros signos de la enfermedad.

Lesiones de la piel, tales como erosiones cutáneas y extensas áreas descarnadas, sólo se observaron en peces moribundos. En ninguno de los grupos se observaron induraciones epidérmicas como las descritas por Scháfer y col. (1990), y Branson y Nieto (1991), en salmones coho naturalmente infectados. Ascitis como la descrita para el salmón coho (Branson y Nieto, 1991), sólo fue encontrada en el grupo de peces moribundos, por lo que se le podría considerar como una alteración terminal.

En la necropsia se observó hepato, espleno y renomegalia, acompañados de equímosis y petequias de la musculatura abdominal. Todas las lesiones fueron más evidentes en el grupo 3. También fue frecuente la presencia de focos blanquecinos, de aproximadamente 1 mm de diámetro, que se encontraban en la superficie y en profundidad del hígado y bazo, que fueron más evidentes en el grupo 2 y 3. Además, en el grupo de peces moribundos fue manifiesto un aumento de volumen de líquido cefalorraquídeo acompañado en muchos casos con una congestión de las meninges. Esto último es congruente con los síntomas nerviosos observados y los hallazgos histopatológicos que se detallan posteriormente en este trabajo.

En relación a las lesiones histopatológicas, las más relevantes fueron los fenómenos de necrosis, proliferación de tejido conectivo y alteraciones vasculares.

Fenómenos inflamatorios también fueron observados, aunque se caracterizaron por ser leves y con predominio linfocitario, manifestándose principalmente en el grupo 1. Al respecto, aunque los fenómenos necróticos se observaron con frecuencia y fueron más severos en los peces moribundos, la inflamación siempre fue leve a escasa y no se relacionó con la intensidad de la destrucción del tejido.

El hígado presentó en los tres grupos necrosis endotelial de los vasos sanguíneos con una mayor frecuencia de presentación en los peces sin síntomas (Tabla 1), lo cual puede indicar que esta lesión corresponde a los inicios de la diseminación de P. salmonis.

TABLA 1 FRECUENCIA DE ALTERACIONES HISTOPATOLÓGICAS EN SALMONES DEL ATLÁNTICO (SALMO SALAR) EN TRES ESTADOS CLÍNICOS DE INFECCIÓN POR P SALMONIS

Organo  Tipo de alteración   Frecuencia %

Grupo 1a

Grupo 2b

Grupo 3c

Hígado Necrosis perivascular

0

50

50

Proliferación de tejido conectivo

20

25

62

Hemorragia

20

25

50

Infiltración linfocitaria perivascular

20

25

50

Trombosis

30

25

25

Necrosis endotelial

50

41

25

Necrosis hepatocitos

60

91

62

Riñón Necrosis tubular

30

25

87

Trombosis

30

33

37

Necrosis endotelial

50

33

25

Necrosis glomerular

60

75

100

Necrosis tejido hematopoyético

70

91

100

Bazo Necrosis perivascular

70

41

75

Necrosis tejido hematopoyético

80

41

75

Branquias Necrosis células interlaminillares

20

33

62

Necrosis laminillar

30

41

62

Fusión laminillar

60

25

50

Hiperplasia

80

75

87

Corazón Necrosis endotelial

30

25

37

Necrosis miocardio

20

25

37

Encéfalo Vacuolización neuronal

50

66

75

Necrosis neuronal

20

66

87

Necrosis endotelial

50

33

37

Edema

60

66

62

Necrosis perivascular

70

66

50

Gliosis

70

75

62

Infiltración linfocitaria meníngea

90

66

87

a: Grupo 1: Peces positivos sin signos clínicos. b: Grupo 2: Peces positivos con signos clínicos leves. c: Grupo 3: Peces positivos moribundos.

La lesión endotelial, aunque menos frecuente, fue más severa en los grupos 2 y 3. Al respecto, recientemente se ha descrito que la rickettsia se observa en el citoplasma de endoteliocitos, donde probablemente se multiplica (Larenas y col., 1994). En los tres grupos se pudo evidenciar, además, necrosis de coagulación de hepatocitos, siendo de similar frecuencia en los grupos 1 y 3 (60% y 62%, respectivamente) y mayor en el grupo 2, llegando en este último a un 91 % de las observaciones. Además se observó la formación de trombos en los tres grupos estudiados, lo que parece estar relacionado a la lesión endotelial antes descrita. También se encontró fibrosis, lo que explica las lesiones macroscópicas, hemorragias e infiltración leve por linfocitos alrededor de las pequeñas ramas arteriales o venosas.

En el riñón, la necrosis del tejido inmuno hemato poyético fue la más relevante, aumentando en frecuencia de presentación desde el grupo 1 al 3 (Tabla 1). La necrosis endotelial, en forma similar al hígado, sólo se observó en forma consistente en el grupo 1, con una frecuencia del 50% y un grado moderado. La necrosis glomerular tuvo una alta frecuencia en los tres grupos, siendo en todos ellos de grado moderada. Al respecto, las células más afectadas correspondieron a endoteliocitos y podocitos. Otra lesión observada en el riñón medio y posterior, fue una necrosis de los túbulos, lo que aumentó en frecuencia de presentación en el grupo de peces moribundos.

En el bazo los tres grupos presentaron necrosis, siendo más frecuente en los grupos 1 y 3, mostrando mayor severidad en este último.

En las branquias, las laminillas secundarias presentaron necrosis en los tres grupos, la cual fue aumentando su frecuencia y severidad en el grupo 3. Otras lesiones observadas correspondieron a hiperplasia y fusión laminillar, que se apreciaron especialmente en los grupos 1 y 2. Esta última lesión, se considera una lesión crónica en respuesta a agentes injuriantes que afectan a las branquias (Ferguson, 1989). Lesiones similares han sido descritas para el salmón coho naturalmente infectado (Branson y Nieto, 1991; Cvitanich y col., 1991). Al respecto, en el presente trabajo se encontraron microorganismos dentro del citoplasma de células branquiales, lo que concuerda con estudios en salmones infectados experimentalmente (Larenas y col., 1994). Lo anterior podría indicar que el fenómeno de hiperplasia es una reacción del pez frente a una destrucción de células epiteliales branquiales debido a la multiplicación de P. salmonis en éstas.

En relación al encéfalo, en los tres grupos se observó necrosis vascular, principalmente en meninges, disminuyendo su frecuencia hacia el grupo de peces moribundos, pero aumentando la severidad de la misma. En casi todos los casos la lesión estuvo asociada a una meningitis leve, de tipo linfocitaria, a pesar de que no en todos los grupos estudiados existían signos de alteración del sistema nervioso. Además, en los tres grupos se encontró necrosis neuronal que aumentaba su frecuencia de presentación y severidad desde el grupo 1 al 3, siendo este último el grupo más afectado. En algunos casos el microorganismo se presentó dentro de neuronas sin la presentación de procesos inflamatorios concomitantes en ese tejido. Al respecto, en salmón del Atlántico y coho inoculados experimentalmente se ha descrito la presencia de P. salmonis dentro de neuronas del diencéfalo (Larenas y col., 1994), lo cual indicaría que bajo ciertas circunstancias aún no aclaradas, el microorganismo es capaz de traspasar la barrera hematoencefálica. Lo anterior podría estar indicando un compromiso creciente del sistema nervioso, que explicaría los síntomas observados normalmente en la enfermedad natural en animales moribundos. Sin embargo, en el presente trabajo se demuestra además la presencia de alteraciones del sistema nervioso central en peces que clínicamente no presentaban signos de enfermedad.

En el corazón se encontraron lesiones necróticas de carácter leve en el endocardio de los tres grupos, siendo más frecuente en el grupo 3. Necrosis miocárdica se observó en los tres grupos, mostrando un ligero predominio en el grupo 3 con una frecuencia del 37% y grado leve. En todos los casos se observó una inflamación muy leve, no concordante con la gravedad de las lesiones observadas. Lesiones similares han sido descritas en salmones coho (Cvitanich y col., 1991).

En la mayoría de los tejidos los procesos inflamatorios presentes se caracterizaron en general por un infiltrado leve de tipo linfocitario concomitante a una proliferación de tejido conectivo en diferentes grados. Sin embargo, esta respuesta no se relaciona con la gran alteración de los tejidos.

Por otra parte, en los órganos estudiados, las alteraciones vasculares se caracterizaron por hemorragias, congestión y formación de trombos. En el hígado se observó hemorragia con una alta frecuencia sólo en el grupo 3, siendo ésta de carácter leve a moderada. Los trombos fueron más frecuentemente observados en el grupo 1, lo que concuerda con la mayor frecuencia de presentación de lesiones endoteliales.

En relación al riñón, se observó hemorragia renal en los tres grupos estudiados, siendo en todos de similar frecuencia, pero con mayor severidad en el grupo 3. Los trombos se observaron también en los tres grupos pero con una mayor frecuencia de presentación en el 3. La congestión y hemorragia glomerular fueron más relevantes en el grupo 1, donde presentaron un carácter leve.

A nivel cardíaco, sólo el grupo 1 presentó edema y hemorragia miocárdica, siendo ésta de un grado severo y el edema leve. La tabla 1 presenta un resumen de las alteraciones patológicas (en porcentaje) entre los tres grupos estudiados.

En el presente trabajo, no fueron observadas ciertas lesiones descritas para el salmón coho, tales como coagulación intravascular diseminada (Cvitanich y col., 1991), o grandes células oscuras y basofílicas (Branson y Nieto, 1991).

En relación a la presencia de la rickettsia, ésta fue encontrada en la mayoría de los casos en el citoplasma de células presentes en hígado, riñón anterior y posterior, bazo, branquias, encéfalo, corazón, intestino y ciegos pilóricos, tanto en cortes teñidos con HE como con AT. Lo anterior demuestra la inespecificidad del agente por diferentes tipos celulares lo que no se observa para otras rickettsias descritas en mamíferos (Connor y Gibson, 1988).

Las diferencias en los tres grupos estudiados indica la existencia de lesiones previas a las manifestaciones de los primeros signos de enfermedad, aunque el microorganismo se encuentra diseminado, produciendo lesiones, en diferentes tejidos. Es posible que los tres grupos estudiados representen diferentes grados de presentación de la enfermedad.

De acuerdo con las características clínicas y lesiones observadas en los tres grupos, sugieren que la enfermedad es de tipo crónico en el ambiente natural.

Los resultados obtenidos concuerdan con estudios previos en salmones coho y Atlántico inoculados en forma experimental, donde el tejido hematopoyético es uno de los más afectados por P. salmonis (Larenas y col, 1994). Cabe señalar que en los peces salmonídeos, el riñón cumple funciones hematopoyéticas similares a la médula ósea en vertebrados superiores (Ferguson, 1989). Adicionalmente, el riñón en los teleósteos tiene un sistema retículoendotelial muy activo y células productoras de anticuerpos (Ellis, 1989). Gran parte de los antígenos son atrapados por fagocitos que se encuentran en los bordes de los sinusoides tanto de las porciones anteriores y posteriores del riñón y en forma tardía son redistribuidos al bazo (Ferguson, 1989).

Las intensas lesiones necróticas de bazo y riñón, particularmente del tejido inmunopoyético renal, que se han determinado en peces infectados con P. salmonis, sugieren que el sistema inmune estaría severamente afectado. Por lo anterior, esta enfermedad predispondría a la acción de otros agentes patógenos u oportunistas que podrían desencadenar cuadros de mortalidad multicausales. Adicionalmente, el daño ocasionado a las células inmunocompetentes podría disminuir la eficacia de programas de inmunoprofilaxis contra ésta u otras enfermedades en peces de cultivo.

Foto 1. Lesiones macroscópicas en un salmón del Atlántico moribundo. Se aprecia hepatomegalia con focos blanquecinos circunscritos (flechas) y hemorragias en base de la aleta pectoral (a) y en musculatura (b). Foto 2. Riñón posterior. Grupo 3. Severa necrosis e hipocelularidad del tejido hematopoyético. Proliferación celular glomerular (a) y tumefacción tubular (b). H&E. 150X.
Foto 3. Bazo. Grupo 3. Severa necrosis endotelial (flecha) y material amorfo eosinofílico perivascular. H&E. 600X. Foto 4. Corteza cerebral. Grupo 3. Necrosis y vacuolización neuronal. Satelitosis (a) y focos de desmielnización (b). H&E. 600X.

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan sus sinceros agradecimientos a la Asociación de Productores de Salmón y Trucha de Chile AG., al Dr. Andrés Johnson, Dr. Enrique Madrid y a las empresas que facilitaron la obtención de las muestras.

Referencias

BRANSON, E.J.; D. NIETO. 1991. Description of a new disease condition occurring in farmed coho salmon, Oncorhynchus kisutch, in South America. J. Fish Dis. 14, 147-156.

BRAVO, S.; M. CAMPOS. 1989. Síndrome del salmón coho. Chile Pesquero 54: 47-48.

BROCKLEBANK, J.R.; D.J. SPEARE; R.D. ARMSTRONG; T. EVELYN. 1992. Septicemia in farmed Atlantic and Chinook Salmon due to a Rickettsia - like Agent. Fish Health Section/American Fisheries Society, Newsletter 20: 1.

CONNOR, D.H.; D.W. GIBSON. 1988. Infectious and Parasitic Diseases. In: Pathology. Edited by Rubin, E. and Farber, J.L.; J.B. Lippincott Company, Philadelphia. pp. 349-351.

CUBILLOS, V.; C. FARÍAS; A. ALBERDI; V. ALVARADO; W. SCHAFER; M. MONRAS. 1990. Características anatomopatológicas del Síndrome del Salmón Coho (SSC), nueva enfermedad de los salmonídeos. Patología Animal 4: 14-17.

CVITANICH, J.; O. GARATE; C.E. SMITH. 1991. The isolation of a rickettsia-like organism causing disease and mortality in Chilean salmonids and its confirmation by Koch's postulate. J. Fish Dis. 14: 121-145.

ELLIS, A.E. 1989. The Immunology of Teleosts. In: Fish Pathology. Edited by R. Roberts. Brailliére Tindall, London, U.K. pp. 135-153.

FERGUSON, H.W. 1989. Systemic Pathology of Fish. Iowa State University Press/Ames, USA.

FRYER, J.L.; C.N. LANNAN; L.H. GARCÉS; J.J. LARENAS; P.A. SMITH. 1990. Isolation of a rickettsiales-like organism from diseased coho salmon (Oncorhynchus kisutch) in Chile. Fish Pathol. 25: 107-114.

FRYER, J.L.; C.N. LANNAN; S.J. GIOVANNONI; N.D. WOOD. 1992. Piscirickettsia salmonis gen. nov., sp. nov the causative agent of an epizootic disease in salmonid fishes. Int. J. Syst. Bac. 42(1): 120-126.

KENT, M.L. 1992. Diseases of seawater netpen-reared salmonid fishes in the Pacific norwest. Canadian Special Publication and Aquatic Sciences. 116: 17-19.

LARENAS, J.J.; P.A. SMITH; L.H. GARCÉS; C. LANNAN; J.L. FRYER. 1994. Piscirickettsiosis of Atlantic salmon (Salnao salar) and coho salmon (Oncorhynchus kisutch) inoculated with P. salmonis. International Symposium on Aquatic Animal Health. Seattle, Washington, USA.

OLSEN, A.B.; O. EVENSEN; L. SPEILBERG; H.P. MELBY; T. HASTEIN. 1993. «Ny» laksesykdom forarsaket av rickettsie. Norsk Fiskeoppdrett 12: 40-41.

RODGER, H.D.; E.M. DRINAN. 1993. Observation of a rickettsialike organism in Atlantic salmon, Salmo salar, L., in Ireland. J. Fish Dis. 16: 361-369.

SCHAFER, J.W.; V. ALVARADO; R. ENRÍQUEZ: M. MONRAS. 1990. The «Coho Salmon Syndrome» (CSS): A new disease in Chilean Salmon, reared en Sea Water. Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 10: 130.

WOLF, K. 1981. Chlamydia and rickettsia offish. Fish Health News, 10: 1-5.

Recibido el 29 de diciembre de 1994, aprobado el 17 de abril de 1995.