Trabajos Originales

  • Virus influenza equina. Adaptación de aislados nacionales a cultivos celulares y aplicación de la prueba de seroneutralización

Resumen

Las cepas chilenas del virus IE se comportan en forma diferente al ser inoculadas en cultivos celulares, la cepa A/equi/l /Santiago 77 (H7N7) produce ECP en células MA - 104, RFE y FEP, el que fue neutralizado con un antisuero homólogo, mientras que la cepa A/equi/2/Santiago 85 (H3N8) no produce ECP en estas células.

La prueba de DPFS se comporta en forma semejante a la prueba de IHA al medir similarmente títulos de anticuerpos antivirus A/equi/1/Santiago 77 (H7N7), presentar títulos promedios de anticuerpos similares, presentar una correlación significativa y una sensibilidad similar, y que por lo tanto puede ser utilizada en el diagnóstico e investigación del virus de la IE, cepa A/equi/1/Santiago 77 (H3N8) con la ventaja adicional de medir anticuerpos protectivos.

Palabras Claves

Influenza equina, serología, cultivos celulares

Abstract

Chilean, strains of equine influenza virus halve different behavior in tissue cultures. Strain A/ equi/1/Santiago 77 (H7 N7) produces constant and specific cytopathic effect in MA-104, EFK and CEF cells. Strain A/equi/2/Santiago 85 (H3 N8) does not produce cytophatic effect in the same cells.

Seroneutralization (SN) test was similar to hemagglutination inhibition (HAI) test when measure specific antibody titres against strain A/equi/I/Santiago 77 (H7 N7). Further more, SN test presents similar average titres, significant correlation and a similar sensitivity than HAI test. It is concluded that SN test may be used in diagnosis and research of equine influenza virus, strain A/equi/1/Santiago 77 (H7 N7), instead of HAI test with the additional advantage of measuring protective antibodies.

Keywords

Equine influenza, serology, tissue culture

Introducción

En el diagnóstico de la influenza equina (IE), evaluación de la respuesta inmune en animales vacunados y detección de anticuerpos maternos, se han utilizado diferentes pruebas serológicas, siendo las más usadas inhibición de la hemoaglutinación (IHA) y fijación del complemento (FC); eventualmente, se han usado hernólisis radial simple, inhibición de la neuroaminidasa, inmunodifusión, seroneutralización (SN), ELISA y recientemente la prueba de fijación de antiglobulina radioisótopa.

Todas las pruebas serológicas citadas anteriormente, con excepción de la seroneutralización, no cuantifican directamente los anticuerpos protectivos que son los neutralizantes. Por esta razón se ha tratado de incorporar la prueba de seroneutralización en cultivos celulares como un método de diagnóstico de la influenza equina. Sin embargo, este método no ha sido usado en forma rutinaria, debido a que la mayoría de las cepas del virus IE no producen efecto citopático (ECP) característico.

Brion y col. (1966), adaptaron los dos subtipos del virus IE en cultivos de fibroblastos de embrión de pollo (FEP), observando un ECP débil. Pette y Teufel (1966), describen la producción de ECP en cultivos primarios de riñón de embrión de pollo y de bovino inoculados con el virus IE A/equi/2/Miami/ 63 (H3N8). Fontaine y Petermann (1969) adaptaron ambos subtipos del virus IE a cultivos celulares de riñón equino, bovino y hamster, obteniendo replicación viral aunque sin observar ECP. Klenk y col., en 1975, estudiaron el efecto de tripsina en la infectividad de varios virus influenza, entre ellos la cepa A/equi/2/Miami/63 (H3N8) en cultivos primarios de embrión de pollo, encontrando que la tripsina produce un aumento significativo en la infecciosidad de todos los virus estudiados. Mahendra y Minocha (1977), lograron una máxima replicación del virus A/equi/2/Miami/63 (H3N8) en células de riñón canino (MDCK), obteniendo 48 horas postinoculación, títulos hemoaglutinantes (HA) de 128. En 1981, Yamagishi y col., observaron ECP en las líneas celulares MDCK, MDBK, riñón porcino (SK-K), riñón de mono africano (VERO) inoculadas con ambos subtipos del virus IE, obteniendo títulos infecciosos altos. En 1986, Higgins y col., aislaron la cepa A/equi/2/Miami/63 en células MDBK observando un ECP semejante al descrito para virus influenza.

En 1967. Beveridge y Rose desarrollaron la prueba de SN en huevos embrionados (HE). encontrando que tanto la prueba de SN como la IHA detectaban niveles de anticuerpos contra ambos subtipos del virus IE, hasta 18 y 24 meses después de una infección natural, siendo similares las curvas de los títulos de anticuerpos seroneutralizantes e inhibidores de la hemoaglutinación.

El objetivo de este estudio es adaptar los aislados nacionales riel virus IE a cultivos celulares v estudiar la relación de la prueba de seroneutralización en cultivos celulares con la prueba de inhibición de la hemoaglutinación.

Materiales y métodos

Cepas virales

Se usaron las cepas nacionales del virus IE: A/equi/1/Santiago 77 (H7N7) (Casanova v col., 1977), y A/equi/2/Santiago 85 (H3N8) (Berríos y col.,1986). inoculadas en embrión de pollo, con títulos hemoaglutinantes ≤ 128.

Cultivos celulares

Las líneas celulares MA-104 y RFE (Gaggero, 1984), y cultivos primarios de FEP fueron utilizadas para adaptar las cepas del virus IE en estudio. Para ello, se realizaron pasajes sucesivos en cultivo celular alternados con inoculaciones en huevos embrionarios, vía alantoídea (Fontaine y Petermann. 1969, Davies v col., 1978).

Para facilitar la multiplicación viral de la cepa A/equi /2/Santiago 85 y evidenciar el posible ECP se procedió a tratar las células con tripsina, para ello se lavaron los monoestratos con medio de cultivo adicionado de 2 µg de tripsina por ml, los que se inocularon con la suspensión viral conteniendo 0,25 µg/ml de tripsina para el cultivo de FEP y de 10 µg/ml para la línea celular MA-104. incubándose a 37° C por 60 minutos; posteriormente, las células se lavaron con medio de cultivo adicionado de tripsina (2 µg/ml), agregándose medio de mantención con 0,25 µg/ml para el cultivo de FEP y 2 µg/ml para la línea MA-104. Como controles se utilizaron células no inoculadas. células inoculadas con suspensión viral sin tripsinizar y células tratadas con tripsina ( Klenk y col., 1975: Chasey y Banks, 1986).

Hemoadsorción

Los cultivos celulares inoculados con ambas cepas virales, así corno los controles. fueron sometidos a la prueba de hemoadsorción, de acuerdo a lo descrito por Pette y Teufel (1966), empleándose eritrocitos de pollo al 0,5%.

Titulación viral

Las suspensiones virales obtenidas en cada pasaje fueron tituladas a través de la prueba de hemoaglutinación en micrométodo: en aquellos pasajes en clac se observó ECP la suspensión viral se tituló midiendo la dosis infectarte cultivo de tejidos 50'% (DICT 50).

Prueba de hemoaglutinación

Se empleó la técnica de microtitulación (WHO, 1975). utilizando eritrocitos de pollo al 0,5% y una incubación a temperatura ambiente por 20 minutos. Se consideró como título hemoaglutinante el valor inverso de la última dilución del virus que produce hemoaglutinación completa (WHO, 1975).

Prueba de inhibición de la hemoaglutinación

El antígeno viral fue ajustado a una concentración que contenía 8 unidades henoaglutinantes del virus IE. Los sueros fueron inactivados a 56° C durante 30 minutos, tratados con caolín y eritrocitos de pollo para remover inhihidores inespecíficos de la hemoaglutinación y substancias autoaglutinantes (Cunirhaln, 1971 ).

Cada suero fue enfrentado a 4 unidades hemoaglutinantes (L11-1A) del virus IE v la mezcla suero-virus se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos, posteriormente se agregaros eritrocitos de pollo al 0,5%. La lectura se realizó luego de 40 minutos de incubación a 25ºC.

Paralelamente se controlaron las UHA del virus, sedimentación de los eritrocitos y autohemoaglutinación de los sueros (WHO, 1975). Se consideró como título inhibidor de la hemoaglutinación al valor recíproco de la mayor dilución del suero que inhibe totalmente la hemoaglutinación de 4 UHA del virus IE.

Prueba de dilución punto final seroneutralización (DPFS).

La prueba de DPFS se realizó en cultivos de FEP, utilizando viras IE sometido a seis pasajes alternados en FEP y HE de gallina. El antígeno viral se empleó en una concentración de 3,2 DICT 50/0,025 ml que es el título infeccioso máximo obtenido con el virus IE cepa A/equi/2/Santiago (H7N7) en células de FEP. Cada suero fue evaluado mediante la prueba de DPFS según la metodología descrita por Jenney y Wessman ( 1976). El título seroneutralizante se expresa como el valor recíproco de la mayor dilución de suero que neutraliza 3,2 DICT 50/0,025 ml.

Tamaño de la muestra

Se estimó un tamaño de nuestra, referido a la prueba de IHA, mínimos de 71 sueros positivos y 71 sueros negativos, considerando los antecedentes bibliográficos para una desviación típica de 27, un alfa de 0,05 y un beta de 0, 1 (Celedón y col., 1981). En este trabajo se estudiaron 169 sueros, 97 positivos con títulos IHA  ≥ a 8 y 72 sueros negativos con títulos IHA < 8. Los sueros provenían de equinos vacunados y no vacunados contra la IE, sin considerar procedencia, sexo, raza o edad.

Análisis estadístico

Se determinó la sensibilidad y especificidad de la prueba de DPFS con respecto a la prueba de IHA (Tizard, 1982). La significancia de los cambios en el diagnóstico de negativos a positivos y de positivos y negativos al comparar ambas pruebas se determinó con la prueba de McNemar (Siegel, 1956). Se estableció el coeficiente de correlación (r) para cuantificar la relación existente entre las pruebas de IHA y DPFS (Snedecor y Cochran, 1964). Las diferencias entre los títulos seroneutralizantes e inhibidores de la hemoaglutinación fueron medidas con la prueba de «t» (Snedecor y Cochran, 1964). Los cálculos fueron efectuados con los títulos transformados al logaritmo del título.

Resultados

La cepa A/equi/1/Santiago 77 (H7N7) produjo ECP desde el primer pasaje en células MA-104, efecto que se mantuvo por tres pasajes sucesivos. El ECP se caracterizó por la aparición de gran cantidad de células que flotaban sobre el monoestrato celular; este ECP no se observó en las células no inoculadas. En pasajes alternados con inoculaciones en HE, el efecto se mantuvo al menos por ocho pasajes. La cepa A/ equi/2/Santiago 85 (H3N8), tratada y no tratada con tripsina, no produjo ECP en células MA -104.

En células de RFE la cepa A/equi/l/Santiago 77 (H7N7) provocó ECP caracterizado por células desprendidas y destrucción de un 80% del monoestrato celular a las 48 horas; este efecto no se observó en las células controles. La cepa A/equi/2/Santiago 85 (H3N8) provocó un efecto similar.

En células de FEP solamente la cepa A/equi/1/Santiago 77 (H7N7) produjo ECP similar al descrito en las otras células, el que se mantuvo durante cuatro pasajes sucesivos y ocho alternados, haciéndose cada vez más manifiesto a medida que aumentaba el número de pasajes, especialmente en los alternados.

La inoculación en células MA-104 con la cepa A/ equi/2/Santiago 85 (H3N8) tratada con tripsina (10 pg/ml) provocó ECP que desapareció al reinocular las células con virus no tripsinizado.

En la prueba de hemoadsorción se observó adsorción de eritrocitos a las células solamente enaquellos cultivos en que se observó ECP causado por el virus IE.

Los títulos hemoaglutinantes obtenidos luego de la inoculación de ambas cepas del virus IE, correspondieron a valores máximos de 8.

En aquellos cultivos donde se observó ECP luego de la inoculación viral, el título fue de 102,1 DICT 50/ ml para la cepa A/equi/1/Santiago 77 (H7N7) en los tres tipos de cultivos utilizados, y 103,1 DICT50/ml para la cepa A/equi/2/Santiago/85 (H3N8) adaptada a células de RFE.

La cepa A/equi/1/Santiago 77 (H7N7), adaptada a FEP, presentó un título IHA y SN de 64 con su antisuero de referencia homólogo. Al enfrentar la cepa A/equi/2/Santiago/85 (H3N8), adaptada a RFE, con su antisuero homólogo, se obtuvo un título IHA de 32, aunque no se logró neutralizar el ECP. No se observaron reacciones cruzadas al enfrentar ambas cepas con antisueros heterólogos.

Al comparar las pruebas de IHA y DPFS en células RFE, empleando la cepa A/equi/1/Santiago 77 (H7N7), se encontró que de 97 sueros positivos en IHA, 91 fueron positivos en DPFS, lo que indica una sensibilidad de 93,8%, de la prueba de DPFS en cultivo celular con respecto a la prueba de IHA. De los 72 sueros negativos en IHA, 54 fueron positivos en DPFS, indicando una especificidad de 75% para DPFS con respecto a IHA.

El valor predictivo de los positivos en la prueba DPFS fue al 83,5% y el valor predictivo de los negativos fue de 90,0%. Consecuentemente, la probabilidad de falsos positivos en la prueba DPFS es 16,5% y la probabilidad de falsos negativos 10,0%. Por otra parte al relacionar la negatividad y positividad con los resultados de la prueba de IHA se obtuvo un 25% de falsos positivos y un 6,2% de falsos negativos.

De los 169 sueros en estudio, 145 de ellos (91 positivos y 54 negativos) no variaron su calidad de positivo o negativo en las pruebas de IHA y DPFS, obteniéndose un índice de concordancia de 85,8% (Cuadro 1).

Al probar la significancia de los cambios en el diagnóstico de negativos a positivos y viceversa, en las pruebas de IHA y DPFS, mediante la prueba de McNemar, se obtuvo un resultado estadísticamente significativo (p ≤ 0,05), lo que indica una tendencia de los títulos negativos en la prueba de IHA a cambiar a positivos en DPFS (Cuadro 1).

CUADRO 1 RELACIÓN DEL NÚMERO DE SUEROSPOSITIVOS O NEGATIVOS AL VIRUS INFLUENZA EQUINA A/EQUI/I/SANTIAGO/77 (H7N7). SEGÚN LAS PRUEBAS DE INHIBICIÓN DE LA HEMOAGLUTINACIÓN (IHA) Y DILUCIÓN PUNTO FINAL SERONUETRALIZANTE (DPFS)

IHA

DPFS

 

Sueros

Sueros

Total

Sueros

91

18*

109

Sueros

6**

54

60

Total

17

72

169

*Cambios en el diagnóstico de negativos a positivos **Cambios en el diagnóstico de positivos a negativos

Al cuantificar la relación entre las pruebas de IHA y DPFS, mediante el coeficiente de correlación (Gráfico 1), se obtuvo un r = 0,70 (p < 0,01), valor significativo.

GRÁFICO 1 CORRELACIÓN ENTRE LOS TÍTULOS DE ANTICUERPOS ANTIVIRUS INFLUENZA A/EQUI/1/SANTIAGO/77 (H7N7), SEGÚN LAS PRUEBAS DE INHIBICIÓN DE LA HEMOAGLUTINACIÓN (IHA) Y DILUCIÓN PUNTO FINAL SERONEUTRALIZANTE (DPFS), EN SUEROS EQUINOS

Al determinarse la existencia de diferencias entre los títulos promedios IHA con una media geométrica de 16,3 y DPFS con una media geométrica de 18,3, mediante la prueba de «t», no se detectaron diferencias significativas (p > 0,05).

Discusión

Se estudia la susceptibilidad de tres cultivos celulares (MA-104, RFE y FEP) frente a dos cepas. aisladas en Chile, del virus IE, como paso previo para encontrar un sistema celular adecuado para la replicación de este virus y que permita implementar la prueba de seroneutralización para reemplazar la prueba de IHA en el estudio y diagnóstico de la IE.

A pesar de que algunos autores han considerado a los cultivos celulares como sistemas poco sensibles para la replicación del virus IE al compararlos con los huevos embrionados de gallina (Coggins y Kemen. 1975, Mumford y Rossdales, 1980), la cepa A/equi/l/Santiago 77 (H7N7) se adaptó a los cultivos celulares MA-104. RFE y FEP, provocando un ECP específico. Este efecto se inició en el primer pasaje con la aparición de gran cantidad de células desprendidas que flotaban en el medio de cultivo y posterior destrucción de la casi totalidad de la monocapa celular. El ECP observado en células de RFE y FEP es similar al descrito por Casanova y col. (1977) y Billik (1979) en células de RFE. Brion y col. (1966) observaron un débil ECP en células de FEP inoculadas con la cepa A/equi/1/Prague/56 (H7N7). Yamagishi y col. (1981), describen la presentación de células globosas, agregación de ellas y destrucción de la monocapa celular al inocular virus IE en células VERO, MDBK, MDCK, SK-K y ESK.

El ECP observado en células de FEP se hace más evidente al aumentar el número de pasajes de la cepa A/equi/1/Santiago/77 (H7N7). El incremento de ECP ha sido descrito anteriormente en estas células (Billik, 1979) y en células MDBK (Celedón y col., 1993).

No existe información sobre la citopatogenicidad del virus IE en células NIA-104. aunque esta línea celular ha sido descrita como un sistema tan sensible corno los huevos embrionados para el estudio de los virus de la influenza en humanos (Davies y col., 1978).

En células MA-104 y de FEP la inoculación con la cepa A/equi/2/Santiago/85 (H3N8) no produjo ECP. Sin embargo, Celedón y col.. en 1993 informan de la aparición de células desprendidas y destrucción de la monocapa celular en cultivos de RFO, RFE, FEP y MDBK inoculadas con la misma cepa. Por otra parte, Yamagishi y col. (1981 ), describen ECP en células VERO, MDBK,

MDCK, SK-K y ESK inoculadas con la cepa A/equi/2/Miami/63 (H3N8); sin embargo, Nlahendra y Minocha (1977), no observan ECPen células de FEP, MDBK, PK-15, cornetes bovinos. MDCK, células conjuntivales y cultivo primario de riñón de embrión de pollo inoculadas con dicha cepa.

En Células de RFE inoculadas con la copa A/equi/2/Santiago/85 (H3N8) se observó un ECP distinto al producido por la copa A/equi/1/Santiago 77 (H7N7) en los otros cultivos celulares: este ECP, caracterizado por acúmulos celulares, no fue neutralizado por el suero homólogo de referencia, postulándose que sería causado por un contaminante no identificado.

En células MA-104, la cepa A/equi/2/Santiago/85 (H3N8) tratada con tripsina produjo ECP con destrucción del 909/ de la monocapa celular luego de 72 a 96 horas postinoculación. Al efectuar pasajes sucesivos, sin tripsinizar el virus, el ECP desapareció. En células de FEP esta cepa no produjo ECP, probablemente debido a la baja concentración de tripsina (0,25 µg/ml) usada en estas células que son biológicamente sensibles a la acción de la tripsina.

Los títulos HA (2 y 8) obtenidos con ambas cepas virales, son menores a los descritos por Brion y col. (1966), quienes describen títulos HA entre 4 y 128 en células de FEP inoculadas con la cepa A/equi/1/ Prague 56 (H7N7). Mahendra y Monocha (1977), obtuvieron valores similares en células de cornetes de bovinos y MDCK.

El título infeccioso obtenido con la cepa A/equi/ 1 /Santiago 77 (H7N7) fue de 102,1 DICT50/ml en los tres cultivos celulares, menor a los obtenidos por Pette y Teufel (1966) y Yamagishi y col. (1981). Debido a esto en la prueba DPFS se utilizaron sólo 3,2 DICT50/ 0,025 ml valor inferior al utilizado por Yamagishi y col. (1981).

Al comparar la variable diagnóstico positivo y negativo entre las pruebas de IHA y DPFS se obtuvo un índice de concordancia de 85,8% considerado como satisfactorio para la prueba de DPFS.

En relación a la sensibilidad de la prueba de DPFS con respecto a la prueba de IHA, el valor obtenido, superior al 90%, es considerado adecuado. Yamagishi y col. (1982), determinaron que las pruebas de SN e IHA tienen la misma sensibilidad con ambos subtipos del virus IE. Al comparar estas pruebas con el virus bronquitis infecciosa aviar se obtuvo un resultado similar (Hatcher y col., 1983).

La prueba de DPFS mostró una especificidad de 75% con respecto a la prueba de IHA. En el caso del sarampión humano Neumann y col. (1985), obtienen una especificidad de 100%.

La significancia del cambio en el diagnóstico que puedan experimentar los sueros en las pruebas de IHA y DPFS, analizado con la prueba de McNemar, mostró un valor significativo de X2 = 7,04 (p < 0,05), lo que indica una tendencia al cambio en el diagnóstico. El cambio de 18 sueros negativos en la prueba de IHA a positivos en la prueba de DPFS probablemente sea debido a la menor dosis de virus empleada en la prueba de DPFS que la hace ser más sensible aunque menos específica.

La validez de las diferencias encontradas entre los títulos promedios de anticuerpos inhibidores de la hemoaglutinación y seroneutralización, con un t = 1,82 estadísticamente no significativo, permite inferir que el título promedio de anticuerpos no es afectado por la prueba utilizada.

La correlación significativa entre las pruebas de IHA y DPFS con un r = 0,70 es inferior a los valores, entre 0,91 y 0,96 descritos por Yamagishi y col. (1981), y Yamagishi y col. (1982), para ambos subtipos del virus IE, aunque dentro de los valores superados para las pruebas biológicas (Snedecor y Cochran, 1964).

Referencias

BERRÍOS, PP., M. ZELEDÓN, O. SEPÚLVEDA. 1986. Influenza equina. Aislamiento del virus A/equi/2/(H3 N8). Av. Cs. Vet. 1: 65-66.

BEVERIDGE, W., M. ROSE. 1967. Influenza in horses: persistence of antibody measured by three methods. Br. Vet. J. 123: 8-13.

BILLIK, M. 1979. Estudio de anticuerpos inhibidores de la hemoaglutinación en equinos inmunizados con vacuna cuádruple antiinfluenza equina. Tesis. Santiago. Universidad de Chile. Facultad de Ciencias Pecuarias y Medicina Veterinaria.

BRION, A., C. CATEIGNE, M. FONTAINE, P. FONTAINE, R. MORAILLÓN. 1966. Grippe équine. Caractérization de virus grippaus isolés en 1965. Bull. Acad. Vét. Fr. 39: 155-163.

CASANOVA, A., I. MARTÍNEZ, M. ROMÁN. 1977. Aislamiento y tipificación del virus de la influenza equina en Chile. Arch. Med. Vet. 9: 91-93.

CELEDÓN, M.O., P. BERRÍOS, L. IBARRA, M. BILLIK. 1981. Estudio de anticuerpos inhibidores de la hemoaglutinación en equinos inmunizados con vacuna cuádruple antiinfluenza equina. Arch. Med. Vet. 13: 16-21.

CELEDÓN,M. O., L. PALOMINOS, M. SANTIBÁÑEZ, P. BERRÍOS. 1993. Caracterización del virus influenza equina cepas A/equi/1/Santiago 77 (H7 N7) y A/equi/2/Santiago 85 (H3 N8). Av. Cs. Vet. 8: 148-152.

CHASEY, D., J. BANK. 1986. Replication of atypical ovine rotavirus in small intestine and cell culture. J. Gen. Virol. 67: 5657-576.

COGGINS, L., M. KEMEN. 1975. Viral respiratory infections of horses: some specific viruses affecting the horse. J. Am. Vet. Med. Assoc. 166: 80-83.

CUNNINGHAM, C. 1971. Virología práctica. Zaragoza (España). Ed. Acribia.

DAVIES, H., G. APPLEYARD, P. CUNNINGHAM, M.PEREIRA. 1978. The use of a continuos cell line for the isolation of influenza viruses. Bull. Wld. Hlth Org. 56: 991-993.

FONTAINE, M., H. PETERMAN. 1969. Adaptation of equine influenza viruses to mammalian cell cultures. Rech. Vét. 3: 1-11.

GAGGERO,A. 1984. Caracterización de una línea celular derivada de riñón fetal equino. Tesis. Santiago. Universidad de Chile. Facultad de Ciencias Agrarias, Veterinarias y Forestales.

HATCHER, J., J. SKEELERS, P. BLORE, J. STORY. 1983. Comparison of the hemmaglutination-inhibition test with the constant virus diluting serum microneutralization test for detecting antibody to avian infectious bronchitis virus. Avian. Dis. 27: 1157-1161.

HIGGINS, W., J. GILLESPIE, D. HOLMES, D. BOBSON. 1986. Surveys of equine influenza outbreaks during 1983 and 1984. Equine Vet. Sci. 6: 15-19.

JENNEY, E., J. WESMANN. 1976. Serology microtiter techniques for diagnostic virology. Diagnostic Laboratory, Animal, Plant and Health Inspection Services. Iowa. USA.

KLENK, H., R. ROTT, M. ORLICH, J. BLODORN. 1975. Activation of influenza A viruses by tripsin treatment. Virol. 63: 426-439.

MAHENDRA, J., H. MINOCHA. 1977. Replication os swine and equine influenza viruses in canine kidney cells..Anr. J. Vet. Res. 38:1059-1061.

MUMFORD, J., P. ROSSDALE. 1980. Virus and its relationship to the «poor performance» syndrome. Equine Vet. J. 12: 3-9.

NEUMANN, P., J. WEBER, A. JESSAINE, O. SHAUGHNESSY. 1985. Comparison of measles antihemolysin test. enzyme-Iinked immunosorbent assay, and hemmagglutination inhibition test with neutralization test for determination of immune status. J. Clin. Microbiol. 22: 296-298.

PETTE, J., P. TEUFEL. 1966. Zuchtung des pferdeinfluenzavirus in gewebekulturen. Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr 24: 473-474.

SIEGEL, S. 1956. Nonparametric statistics: for the behaviorial science. New York. Mc Graw.

SNEDECOR, G., W. COCHRAN. 1964. Métodos estadísticos. México, Continental.

TIZARD,I. 1982. Serological assay. J. Am. Net. Med. Assoc. 181:1162-1165.

WORLD HEALTH ORGANIZATION ( WHO). 1975. The hemmagglutination inhibition test for influenza viruses. New York, Wld. Hlth. Org. Collaborating Center for Influenza.

YAMAGISHI, H., T. NAGAMINE, K. SHIMODA, S. IDE, Y, IGARASHI. 1981. Infectivity assay and neutralization test for equine influenza virus in microplate cell cultures. Vet. Microbiol. 6: 309-315.

YAMAGISHI, H., T. NE, K. SHIMODA, S. IDE, Y. IGARASHI, I. YOSHIOKA, M. MATUMOTO. 1982. Comparative measurement of equine influenza virus in horse sera by single-radial haemolysis, neutralization and hemmagglutination inhibition test. J. Clin. Microbiol. 15: 600-662.

Recibido el 7 de enero de 1995, aprobado el 13 de abril de 1995.