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  • Patología molecular: aspectos básicos

Resumen

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Abstract

Modern concepts about conventional pathology, molecular procedures and new techniques applied to veterinary pathology, are reviewed in this general article. Besides, it is described the basis and some processes of inimunochernistrv with monoclonal antibodies, including polimerase chain reaction (PCR), to study main diseases of domestic animals.



Key words: Molecular pathology, immunohistochemistry.







 

I. Principios básicos

Introducción

La Patología Molecular ofrece imágenes de estructuras muy convincentes, con base en métodos y técnicas de la biología molecular; sin embargo, para arribar a un diagnóstico, es muy difícil identificar de una manera simple la imagen con la realidad. Por ello, es necesario que ciertas consideraciones abstractas o teóricas precedan a la elección del objeto o muestra cuya imagen se desea estudiar y, a la vez, emplear el método de estudio adecuado.

Luego, esta imagen aparece como producto de un conjunto de procedimientos mecánicos necesarios para su realización, además de discernimientos y reflexiones, considerando múltiples experiencias propias y de otros investigadores, para finalmente obtener la imagen.

Esta misma ciencia ha desarrollado y adaptado técnicas de enorme impacto práctico para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas y no infecciosas, que incluyen la inmunohistoquímica, reacción en cadena de la polimerasa (RCP), el uso de antígenos recombinantes, immunoblot, citometría de flujo y diagnóstico por imágenes computarizadas, que cuantifican poblaciones celulares circulantes o componentes estructurales de un órgano.

En el estado actual de conocimientos, aún se tiene como sueño no muy lejano ahora- ver la materia a escala atómica, seguir los procesos biológicos en tiempo real y en tres dimensiones.

En Europa los investigadores tienen muchas expectativas en el European Synchroton Radiation Facility (ESRF), el cual, proporcionará radiación sincrotón y haces intensos de rayos X que permitirán a los biólogos examinar la estructura de las macromoléculas a escala del Angstrom (A°).

Definición

La Patología es esencialmente el estudio de la enfermedad (pathos), una ciencia que encierra el tratado de todas las anormalidades de estructura y función biológica (Dorland, 1986). Es también un arte médico que comprende la multitud de variables inmensurables, las cuales constituyen la vida y la salud, y que define a los animales como entidades, no como máquinas.

A pesar de que esta ciencia actualmente se ha expandido mucho más allá de los conceptos tradicionales, aún persiste el concepto errado de que es una curiosidad reconocer lesiones y denominación de enfermedades. Este fue el rol de la Patología Descriptiva, la cual se extendió desde los tiempos pregriegos hasta el siglo xix. Comprendía el estudio y registro de cambios macroscópicos, por medio de los cuales fue reconocido un estado de enfermedad.

En el siglo pasado, la Patología Celular nació a partir del distinguido trabajo de Virchow y otros morfólogos del siglo XIX. Posteriormente, el advenimiento de la Biología Molecular con Watson y Crick, a mitad del siglo XX, actuó como trampolín para el desarrollo de la Patología Ultraestructural y luego Molecular, cuando se inventa el microscopio electrónico y se empieza el estudio de las moléculas biológicas y posteriormente la producción de anticuerpos monoclonales (Köler y Milstein, 1975).

La Patología Molecular Diagnóstica se define como el empleo de sondas moleculares (ADN, anticuerpos monoclonales), para el diagnóstico y estudio de la enfermedad. Principalmente utiliza el principio de pareamiento de bases de nucleótidos para hibridización específica entre una sonda ADN o ARN y su secuencia blanco complementaria. Además de la afinidad y atracción biofísica del complejo antígeno-anticuerpo.

Se dispone de sondas de este tipo para virus, bacterias y parásitos, enfermedades neoplásicas y enfermedades hereditarias, haciendo un screening para genes mutados específicos, y la diferenciación de especies o las « quasi especies» mediante el fingerprinting.

En la actualidad, la atención de los patólogos se ha centrado en comprender los eventos mecánicos a nivel atómico (Patología Atómica), constituyéndose en una ciencia fundamentalmente multidisciplinaria.

Cuando se imparte esta disciplina en las universidades, se acepta dividirla-por pedagogía- en: Patología General, que se sitúa en la descripción de aquellas anormalidades celulares o lesiones. que tienden a ser comunes a los amplios aspectos del proceso de enfermedad, por ejemplo, inflamación y reparación, necrosis, tumores y otros. Mientras que la Patología Especial trata de enfermedades específicas o tejidos particulares, por ejemplo hepatitis, TBC, gastroenteritis parasitaria.

En general el patólogo adquiere una amplia y diversa gama de conocimientos, pero como en otras ciencias, la mayoría tiende a especializarse, mencionándose entre estas especialidades: Histopatología, Inmunopatología, Patología Clínica, Patología Quirúrgica, Patología Toxicológica, Patología de animales de laboratorio, Patología de animales silvestres y otras. Además, muchos patólogos pueden especializarse en el estudio comparado de especies animales y el hombre, inclusive.

Le corresponde al patólogo que ejerce la patología diagnóstica, seleccionar los métodos v pruebas que mejor se adapten al problema presente y que puedan conducirlo a obtener una interpretación de las anormalidades existentes, decisión que será tomada en base a la experiencia personal, especialización, información publicada y equipamiento de laboratorio.

El microscopio en Patología

El instrumento básico para el diagnóstico lo representa el microscopio óptico, el cual continúa siendo imprescindible en todo laboratorio de investigación y de diagnóstico, debiendo por ello adaptar métodos y técnicas a la posibilidad de emplear este tipo de microscopio, por ejemplo, inmunocito e histoquímica empleando enzimas.

Sin embargo, este microscopio ha llegado a sus límites teóricos de 0,2-0,3 µm de resolución, reconociendo así su simplicidad de funcionamiento, como la interpretación casi sin ambigüedad de las imágenes que proporciona y la observación en tiempo real.

El microscopio electrónico (ME), por otro lado, es de utilidad para el estudio ultraestructural de bacterias y virus (Figura l); ha sido empleado para el reconocimiento de las fibrillas asociadas al agente del scrapie (Prión), inclusiones virales y defectos genéticos.

Figura 1. Virus Parainfluenza tipo 3 ovino (VPI-3) en gemación. Célula riñón fetal ovino. Microscopía electrónica de transmisión. 35.000 X.

En cuanto a la microscopía de rayos X y a la rnicroscopia confocal, similar al ME, en su primera etapa de observación siempre se ilumina la muestra en estudio, lo que permite una resolución del orden del nanómetro (nm). Entre las fuentes de luz tenemos la radiación sincrotón (Europeas Syrzchrotorr Radiation Facility (ESRF). El microscopio de rayos X tiene una resolución 10 veces mayor que el microscopio de luz, con la capacidad de realizar análisis químicos en tejidos anormales o de los contenidos celulares como calcio y plomo, entre otros.

En tanto, en el microcopia de efecto túnel o el de fuerza atómica (Bennig y Rolzrer; 1983), la muestra es explorada por una SONDA y en el barrido de la muestra se detectan los cambios de estado de la sonda. Como las informaciones reflejan la interacción, cualquiera sea su naturaleza, entre el haz o la sonda y la muestra, dichas informaciones son registradas inmediatamente por detectores adecuados. Luego, los datos pueden observarse directamente o registrarse para ser sometidos a tratamientos analógicos o numéricos. La particularidad del microscopio de efecto túnel es que mide corrientes eléctricas que hay que cartografiar; para ello, se emplea un ordenador. que permite trabajar sobre la imagen mediante algoritmos.

La microscopía confocal inventada por Minsky (1955), se trata de microscopía óptica, en la que se focaliza un haz luminoso sobre una superficie muy pequeña de la muestra (220 x 200 m) y la luz procedente de la muestra se detecta después de haber seguido el mismo camino óptico que la iluminación incidente; el haz barre la muestra, ya sea por desplazamiento mecánico del objeto observado o por desplazamiento del punto de iluminación mediante sistemas ópticos.

Se trata, en realidad, de una microtomografía no invasiva, ya que con ajustes del camino óptico, en especial de la distancia del punto focal, la muestra puede observarse corte a corte, es decir, se «secciona ópticamente» el objeto estudiado y con un tratamiento informático se puede reconstruir una imagen tridimensional y en tiempo real de las anormalidades celulares.

Los microscopios confocales de fluorescencia son los más empleados, permitiendo realizar citología cuantitativa empleando marcadores químicos sintetizados en función de su afinidad con los puntos a observar, por ejemplo, determinados puntos de una molécula de ADN; se emplea un haz de láser emitiendo una luz cuya intensidad es proporcional a la concentración del marcador, la cual, a su vez, guarda relación con la concentración de las moléculas que se estudian. Se está empleando para la observación de células y de núcleos y para el estudio de los embriones en investigación básica.

El microscopio de efecto túnel fue inventado por Bennig y Rohrer (1983), valiéndoles para obtener el Premio Nobel 1986. Se basa en un efecto cuántico: la corriente túnel creada al aplicar una pequeña diferencia de potencial, del orden del voltio, entre una punta metálica muy fina y una muestra; la sonda está muy cerca (a menos de un nanómetro) de la superficie de la muestra. Esta corriente decrece exponencialmente, en función de la distancia a la superficie. Por tanto, las variaciones de la corriente, cuando la superficie es barrida por la sonda, proporciona una información muy precisa sobre la topografía de la superficie.

Mientras que el microscopio de fiera atómica necesita igualmente una punta muy fina (monocristal) constituida por un solo átomo, pero tiene que estar en contacto con la superficie de la muestra. Los desplazamientos verticales de la punta durante el barrido de la muestra por la sonda permiten cartografiar la topografía de la superficie. Su resolución es de 1 a 2Aº.

El enfoque que se ha dado en la descripción previa se centra en los cambios tisulares del huésped; sin embargo, no siempre es éste el que varía en sus reacciones de defensa, sino que, el agente patógeno es el que cambia su virulencia, patogenicidad, toxicidad o persistencia.

Esta alteración o mutación es probable que afecte el escenario macro o microscópico observado por el patólogo, y su experiencia será probada en interpretar con exactitud los cambios celulares presentes, para concluir en un correcto diagnóstico.

En casos en que se involucran múltiples etiologías, pueden necesitarse pruebas de seguridad para que no ocurra confusión en el patólogo, por ejemplo, envenenamiento en animales con función hepática o renal reducida o con infección bacteriana secundaria, en pacientes inmunocomprometidos por virus o toxinas. En tales casos, las muestras de sangre pueden producir falsos negativos, siendo de vital importancia un análisis de marcadores histopatológicos de la enfermedad (Sidoli y col., 1990).

En un laboratorio de patología, las muestras de estudio proceden de animales vivos o muertos. En ambos casos el objetivo es obtener un diagnóstico definitivo de la enfermedad; para ello, obviamente es necesario realizar un conjunto de pruebas. Las muestras pueden tratarse de fluidos orgánicos, biopsias o secciones de tejido.

Es importante el raciocinio del patólogo, previo a la decisión de qué muestras tomar para el estudio, el cual implica considerar el diagnóstico presumible del clínico, la anamnesis, los posibles agentes patógenos involucrados y los métodos y técnicas que serán utilizados.

ll. Métodos y técnicas de la patología molecular

En este artículo pretendemos mostrar los métodos y técnicas más relevantes, de acuerdo con nuestra experiencia y apreciaciones particulares.

Es obvio que se requiere un laboratorio con equipo elemental. Además de los equipos y ambientes inherentes a un laboratorio de patología convencional, se necesita un laboratorio de cultivo celular, cámara estéril, criomicrótomo, equipo de electroforesis, congelador -20° C y -70° C, tanque de nitrógeno líquido y reactivos específicos.

1. Inmunohistoquímica

El botánico francés Francois Vincent Raspail es considerado el fundador de la Histoquímica. Fue el primero que estudió el pH del protoplasma utilizando un colorante indicador: Tornasol (en solución ácida cambia de azul a rosado).

Hacia fines del siglo pasado, Kosel y Matheus (1898), desarrollaron la técnica descrita como análisis enzimático. Poco tiempo antes, Keebs (1868) y Struve (1872), registraron por primera vez la presencia de peroxidasa en tejidos (se encuentra en las granulaciones de los tejidos). Brandengurg (1900), fue el primero en demostrar- la reacción de las peroxidasas en los leucocitos. Posteriormente, Misher (1873), aisló cromatina nuclear valiéndose de su afinidad selectiva con el verde de metilo.

Muchos años más tarde en la década de los sesenta- se introducen por primera vez enzimas como marcadores para identificar las uniones antígeno-anticuerpo, las que al actuar sobre un substrato definido forman un precipitado coloreado visible al microscopio óptico (Fenner y col., 1987). El nombre genérico de técnicas inmuno-erráticas se relaciona con el empleo de enzimas como «colorante» (marcador), pudiendo emplearse peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa, beta galactosidasa, entre otros.

En general los marcadores enzimáticos no son visibles directamente al microscopio óptico, por lo que requieren un proceso de revelado, consistente en reacciones histoquímicas cuyo fundamento es que un cromógeno adquiere un determinado color por acción del marcador enzimático. Los principales cromógenos son la diaminobenzidina de color marrón, cloronaftol, de color negro y aminoetilcarbazol de color rojo.

Las técnicas de la inmunoperoxidasa se han constituido en la actualidad en las pruebas inmunoenzimáticas más utilizadas. Esta técnica es versátil y tiene modificaciones como la inmunoperoxidasa directa (Word y Kaeberle, 1984), en que el anticuerpo primario se conjuga con la enzima, mientras que en la inmunoperoxidasa indirecta (Doster y col., 1988) es el segundo anticuerpo el que se conjuga con la enzima (Figura 2). También se describen otras técnicas como el complejo peroxidasa-artiperoxidasa (PAP) y el complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC) (Rockborn y col., 1990).

Figura 2. Inmunoperoxidasa indirecta positiva en cultivo de células de riñón fetal bovino inoculadas con virus. Parainfluenza tipo 3 ovino.

Técnica de la peroxidasa antiperoxidasa (PAP)

Este complejo está constituido por dos moléculas de inmunoglobulinas y tres de peroxidasa; es necesario que se desarrolle el complejo peroxidasa antiperoxidasa y obtener anticuerpos por inmunización de animales de la misma especie que los utilizados en la obtención del anticuerpo primario.

Además, es preciso aplicar tratamientos complementarios en cortes histológicos, con el objeto de resaltar la reacción inmunológica específica. Uno de estos procesos consiste en el bloqueo de la actividad peroxidásica endógena, puesto que ciertas estructuras tisulares, como es el caso de eritrocitos, granulocitos, macrófagos, entre otras, poseen actividad peroxidásica; ésta, es bloqueada con soluciones en base a metanol y peróxido de hidrógeno al 0,3%, o también con tratamientos con ácido clorhídrico y ácido peryódico.

Otro tratamiento complementario es el desenmascaramiento de grupos antigénicos, que se basa en que al utilizar formol para la fijación se producen puentes de unión de tipo cruzado entre los componentes protéicos, que pueden ocultar algunos antígenos o hacerlos inaccesibles al anticuerpo primario, haciéndose necesario devolver la actividad antigénica eclipsada, evento que se realiza mediante el tratamiento enzimático con tripsina.

El background o tinción de fondo, es un problema serio cuando no hay la suficiente experiencia en el manejo de la técnica; se debe a difusión extracelular de antígenos, a la persistencia del medio de inclusión (deficiente desparafinado), al uso de anticuerpos mal purificados o a la unión de anticuerpos mediante el complemento o la región Fc. Esta tinción inespecífica definitivamente genera dificultades para una correcta delimitación de las áreas correctamente positivas. Algunos autores recomiendan utilizar una dilución óptima de los anticuerpos primarios.

El revelado de la reacción peroxidásica se realiza mediante la producción de un precipitado insoluble local, el cual se forma cuando reacciona la peroxidasa con el peróxido de hidrógeno, complejo que posteriormente va a reaccionar sobre uno de los cromógenos descritos anteriormente.

Técnica del complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC)

La biotina es una vitamina de muy bajo peso molecular, perteneciente al complejo B; tiene una notable afinidad con la avidina, la cual es una glicoproteína que comúnmente se encuentra en la clara de huevo.

Estas dos moléculas se unen de una manera irreversible y muy rápida; esta unión es un millón de veces mayor que la mostrada por la unión antígeno-anticuerpo. Debe considerarse que el complejo ABC se halla formado por una red tridimensional de múltiples moléculas de peroxidasa biotinadas y entrelazadas con la avidina.

Las ventajas de esta técnica son el ahorro de reactivos, mínima tinción de fondo y, lo más importante, una elevada sensibilidad que se explica por el proceso de amplificación que ocurre al corresponder a un lugar de unión antigénica múltiples moléculas de peroxidasa activa (Figura 3).

 

Figura 3. Técnica ABC en corte de pulmón ovino positivo a virus Parainfluenza tipo 3 ovino (presencia del virus donde lo indica las flechas). Evidente ausencia de background.

Sin embargo, es de importancia considerar que ciertos tejidos corno hígado, riñón y sistema nervioso contienen biotina y substancias de estructura afín, las cuales pueden fijar el complejo ABC, produciendo resultados equivocados (falso positivo), por lo que es necesario bloquear dichas sustancias.

2. Técnicas genéticas

Los avances en la Biología Molecular y Biotecnología Médica están contínuamente creando excitantes posibilidades para el diagnóstico, basadas en el ADN.

La combinación innovadora de técnicas inmumoenzimáticas, anticuerpos monoclonales y proteínas trazas recombinantes, dan como resultado nuevas pruebas basadas en el ADN, para la determinación de importantes enfermedades infecciosas, inclusive para la determinación de parámetros bioquímicos ligados al riesgo individual a una enfermedad (factores genéticos).

Los procedimientos del ADN recombinante han sido utilizados para la identificación de defectos moleculares que ocurren en enfermedades hereditarias, mutaciones somáticas asociadas con neoplasia y enfermedades infecciosas, de manera que esta técnica ha facilitado rápidamente nuestra capacidad para el dignóstico de enfermedades. Estos métodos son notablemente sensibles y discriminadores para detectar ADN de agentes viriles específicos e inclusive mutaciones entre especies

Reacción en cadena de la polimerasa (RCP)

La polimerase chain reaction (PCR) traducida también como «polimerización en cadena del ADN», permite acceder a una porción cualquiera del genoma, a partir de una cantidad muy pequeña de ADN.

No es frecuente que una técnica tenga un inmediato y dramático impacto en la ciencia, como ha ocurrido con la polymerase chain reaction (Saiki y col., 1988). La capacidad para amplificar grandes cantidades de una región definida de ADN, rápida y específicamente a partir de unas cuantas copias, ha llevado a un replanteamiento de muchos de los procedimientos antiguos y a un gran número de nuevas aplicaciones; muchos de éstos están metodológicamente dirigidos simplemente a donar y manipular genes.

La reacción en cadena de la polimerasa está revolucionando el diagnóstico de las enfermedades, particularmente en los países en desarrollo, cuando de enfermedades infecciosas se trata, porque, en estos países estas enfermedades tienen una importancia notable en la casuística de salud humana y animal.

El fundamento de la PCR es la capacidad que tienen cortos oligonucleótidos (15-25 bases) para hibridizar rápida y específicamente a secuencias de ADN completamentario, aún en presencia de grandes cantidades de ADN no complementario y el requerimiento de polimerasa que tiene el ADN, para una primera unión (pareado) a una banda patrón. para luego sintetizar ADN.

Esto quiere decir que si se emplea un adecuado oligonucleótido, la síntesis de ADN puede iniciarse específicamente en algún punto del genoma, considerando que todo esto ocurre in litro. Pero si se emplean dos primers que se unen a bandas diferentes del ADN blanco, separadas por unos cuantos cientos de nucleótidos luego de que ocurra la síntesis de ADN, dos nuevas bandas de ADN serán sintetizadas, cada una de las cuales incluye las secuencias complementarias del otro oligonucleótido 'primer'.

Luego de los pasos de desnaturación y reordenamiento, todas las nuevas bandas actuarán como substrato para posteriores ciclos de síntesis de ADN y la repetición de este ciclo por muchas veces lleva a un incremento exponencial en copias del ADN blanco específico.

Los tres elementos del ciclo -desnaturación, ordenamiento y síntesis de ADN- pueden ser controlados simplemente por variaciones pequeñas de temperatura. Después de los dos primeros ciclos, virtualmente todos los ADN sintetizados serán de una longitud específica, flanqueados por las dos secuencias iniciadoras. La detección puede ser mediante la visualización, empleando fluorescencia bajo luz ultravioleta, de un pequeño fragmento de ADN de tamaño predicho o de sondas marcadas (radiactivas, fluorescentes, enzimáticas), después de una electroforesis en gel de agarosa y en presencia de bromuro de etidio.

Los avances técnicos que han hecho de la técnica PCR una herramienta de rutina son el uso de una ADN polimerasa I termoestable (Taq polimerasa), la cual puede soportar las altas temperaturas requeridas para la desnaturación del ADN, o de una ARN replicas; actualmente se ha comunicado sobre una polimerasa con propiedades ADN y transcriptasa, lo cual indudablemente facilita estudios en busca de ADN o ARN blancos (Chirnside y Spaan, 1990; Harding y col., 1994), la fabricación de microprocesadores -con bloques controlados de calor- programables y la disponibilidad de oligonucleótidos sintéticos en el mercado.

El mayor impacto de la técnica PCR ha sido en el diagnóstico de enfermedades virales (Senda y col., 1995) (Cuadro 1). Las pruebas tradicionales incluyendo cultivo de virus, son lentas y costosas. Alternativamente, los métodos inmunológicos pueden incluir pruebas para la presencia de anticuerpos en el huésped, lo cual no confirma una infección actual y no puede utilizarse en recién nacidos: otras pruebas para antígenos virales muestran cierta pérdida de sensibilidad y no pueden detectar virus latentes porque están integrados en el genoma del hospedero (Neitzer y col., 1991).

CUADRO 1 PRINCIPALES VIRUS ESTUDIADOS POR LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Agente

Hospedero

Enfermedad/Muestra

llerpesvirus 1-4

Bovino, equino

Respir/Nerv

Pestivirus

Varios

Sistématica

Virus Sincicial Respiratorio

Bovino

Respiratoria

Virus Cólera Porcino

Cerdo

Peste clásica

Rotavirus

Cerdo, bovino. hombre y otros.

Entérica

Vais Leucemia bovina

Bovino

Leucemia

Virus Seudorabia

Porcino

Enf. latente

Virus de la Rabia

Diversos

Rabia (1 )

Herpesvirus

Ovino

Fiebre catarral

Coronavirus

Felino

Peritonitis

Virus Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino

Porcino

Sistema reproductivo y respiratorio

Virus de la inmunodeficiencia Felina

Felino

Sistemica

Parvovirus

canino

Digestiva

Papilomavirus

Bovino

Verruga

Virus de la necrosis pancreática

salmón copo

Digestiva

Virus (le la Fiebre Aítosa

Diversos

(1)

Adenovirus 2

Canino

(1)

Virus de la Anemia Aviar

Ave

Anemia Infecciosa

Virus de la Lengua Azul

Bovino

Lengua azul

Virus del Nevwcastle

Ave

(1)

Virus Influenza

Equino

Respiratorio

Virus de la Enfermedad Bursal

Ave

Gumboro (1)

Rotavirus

Ave

-1

Retrovirus

Ave

-1

African Horsesicknes Virus serotipo 4

Equino

Sistémica

1 Variación genómica

Esta técnica tiene enorme influencia en estudios epidemiológicos. Es extrema su utilidad al usar PCR en tejido parafinado, porque posibilita realizar estudios retrospectivos en una vasta cantidad de muestras fijadas (Imprain y col.. 1987).

Otra aplicación de la PCR es la detección de organismos viables, después de la quimioterapia, puesto que está basada en la presencia de ácido nucleico, el cual es más lábil que la proteína o carbohidrato (Liebane y col., 1995). La detección de ARN. el cual es más lábil aún, puede ser una medición más sensible que el ADN en este concepto.

A pesar de todas las ventajas que se describen para esta técnica, hay que observar ciertas consideraciones. Cuando aparece alguna técnica nueva, siempre existe la tendencia a polarizar, en dos campos, las apreciaciones; un grupo elogia la innovación y otro la trata con gran escepticismo. Ninguno de estos puntos de vista extremos se justifican; PCR será una técnica apropiada y útil en unos casos y en otros no, y cada aplicación será juzgada sobre sus méritos.

Entre los problemas que se presentan cuando se utiliza la PCR, tenemos la contaminación, pues debido a su extrema sensibilidad, cantidades contaminantes mínimas de ADN de alguno de los componentes necesarios en la reacción llevará a resultados falsos positivos. El ADN amplificado es particularmente generoso, debido a su alta concentración amolar con respecto al ADN genómico.

Sin embargo, esto no difiere de los problemas encontrados en exámenes microbiológicos rutinarios; la solución está en identificar como tales a estos contaminantes y en aplicar procedimientos rigurosos. Las medidas que ayudan a disminuir las contaminaciones son: aislar físicamente la sala donde se prepara el material y sobre todo el lugar donde se hace el estudio de los productos de ampliación.

Otro problema se relaciona a cómo interpretar la significancia de resultados, cuando la PCR es menos sensible que métodos previos. Puede ser necesario realizar estudios epidemiológicos, para asegurar que el agente infeccioso no es muy prevalente en la población general que había sido originalmente utilizada.

Igualmente, es importante considerar en la interpretación de resultados de la PCR, el que no es en esencia una técnica cuantitativa. Por la metodología y el fundamento de la técnica debemos observar que no podemos determinar el número de moléculas de ADN que se encuentra en la muestra, ni tampoco establecer si el número de estas moléculas coinciden o corresponden al número de moléculas de la enzima (ADN-polimerasa).

Sin embargo, debemos tener en consideración que muchas enfermedades pueden diagnosticarse fácilmente por otros métodos, si hay abundantes microorganismos en la muestra.

La PCR es empleada para el estudio de numerosas enfermedades infecciosas (Cuadros 1 y 2).

CUADRO 2 PRINCIPALES AGENTES INFECCIOSOS NO VIRALES ESTUDIADOS POR LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Agente

Hospedero

Enfermedad/Órgano

Clamidia psitacca

Bovino

Secr. nasal/semen

Micoplasma

Humano/animales

Diferenciación de subespecies

Renibacteritim salmoninarum

Peces

Enfer. renal bact.

Sarcocystis neurona

Equino

Sist. nerv.

Tichostrongylus

Rumiantes

Digestiva

Brucella abortus

Bovino

Diferenciación de biovares

Fasciola hepática

Hosped. inter.

Fasciolasis

Borrelia burgderfori

Vector

Enf. de Lyme

Salmonella typhimuriums

Ave

Contenido cecal

Plasmodium

-

Diferenciación de especies

Schistosoma

-

Diferenciación de especies

Ehrlicia risticii

Equino

Erlichiosis monocítica equina

Mycobacterium tuberculosis

Bovino

Caracterización genética

Eimeria tenella

-

Variación genómica

Bahesia

Bovino

Variación genómica

Erilicia rhusiopathi ic

Porcino

Multisistémica

Serpulina hyodiscntcriac

Porcino

Entérica

Criptosporidium

-

Criptosporidiosis

Erlichia canis

Canino

Erlichiosis canina

Leptospira

Varios

Caracterizar serovares

Bacteria intracelular sinbionte ileal

Porcino

Enteropat a prohferatlva porcina

Bacillus respiratorio asociado a cilios

Roedores de laboratorio

Enfermedad respiratoria

Cytophaga psychrophila

Peces

Sistémica

AGRADECIMIENTOS

Al doctor Patricio Berríos E., por la revisión del texto original.

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