Comunicaciones

  • Virus bronquitis infecciosa aviar unido a fase sólida para detección de anticuerpos específicos en pruebas de ELISA

Resumen

Se desarrolló una prueba de ELISA ('enzyme-linked immunosorbent assay') empleando virus de la bronquitis infecciosa aviar sin purificar en la sensibilización de las microplacas. Los resultados indican diferencias en sensibilidad y especificidad de la prueba al emplear microplacas de diferente origen comercial. El medio de sensibilización salina fosfato (PBS) a pH 7,4 demostró inducir una mayor adhesión de este antígeno a la microplaca sobre otros buffers probados. La dilución del material viral en el medio de sensibilización también demostró constituir un factor de variación en las lecturas con los mismos sueros de referencia. De acuerdo al contenido proteico (0,887 µg/µl) y el título infectante del material viral (106.25 EID50/ml) empleado en este trabajo, se estableció que una dilución 40% (v/v) en el 'buffer' determinaba una mayor sensibilidad en la prueba. Al comparar microplacas sensibilizadas de esta forma con microplacas sensibilizadas con antígeno purificado de origen comercial, se observó una sensibilidad mayor de ELISA con las últimas. A pesar de ello, se determinó que microplacas sensibilizadas con VBIA sin purificar demuestran una sensibilidad que podría permitir su uso en la elaboración de perfiles serológicos rutinarios en planteles avícolas comerciales. Finalmente, el proceso de congelación de las microplacas así sensibilizadas no alteró mayormente los resultados de ELISA en sensibilidad y especificidad.

Palabras Claves

Bronquitis infecciosa aviar, ELISA

Abstract

An enzyme-linked immunosobent assay (ELISA) was performed using infections bronchitis virus (IBV) infected alantoic fluid for the sensitization of microplates. Microplates of different commercial origin showed different sensitivity and specificity when assessing the same reference sera. Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4, used as coating buffer, induced highest adsorption rates of this antigen to the plates. The dilution factor of IBV in the coating buffer showed to induce optical density variations when testing reference sera. In this study, according to the protein content (0.887 µg/µl) and infectivity of the viral material (10/6.25 EID50/ml), a 40% (v/v) dilution factor gave highest sensitivity. Microplates sensitized with purified IBV from a commercial source showed a higher sensitivity than microplates coated with non purified IBV. However, sensitivity of microplates sensitized as described herein could be used for routine profiling of antibody prevalence in poultry farms. Finally, freezing of IBV coated microplates did not influence significantly optical densities obtained with reference sera.

Keywords

Avian infectious bronchitis, ELISA

Introducción

En el diagnóstico serológico de bronquitis infecciosa aviar (BIA) se han empleado en forma rutinaria las pruebas de seroneutralización viral, inhibición de la hemoaglutinación y la prueba de precipitación en gel de agar (Woernle, 1960; Alexander y col., 1983; Gelb Jr., 1989). La prueba de ELISA ('enzyme-linked immunosorbent assay'), altamente sensible y rápida en la detección de antígenos y anticuerpos específicos (Voller y Bidwell, 1986), fue inicialmente empleada en la detección de anticuerpos contra el virus de la BIA (VBIA), por Mockett y Darbyshire en 1981.

La prueba se realiza empleando microplacas de poliestireno, polivinilo o poliuretano de diferente origen comercial que son sensibilizadas con el VBIA purificado de acuerdo a metodología estándar (Snyder y Marquardt, 1989). La sensibilización de la microplaca con el antígeno purificado emplea diferentes 'buffer' entre los que se pueden mencionar carbonato-bicarbonato pH 7,4, fosfato salino (PBS) pH 9,6, PBS pH 7,4, entre otros, dependiendo del antígeno en estudio (Voller y Bidwell, 1986). Debido al alto costo de 'kits' de ELISA de origen comercial, dado fundamentalmente por los procesos de purificación viral empleados, el presente trabajo tuvo como objetivo establecer si es posible implementar una prueba de ELISA con placas sensibilizadas con el VBIA incluido en el líquido alantoídeo de huevos embrionados y si la sensibilidad obtenida es adecuada permitiría su uso en detección rutinaria de anticuerpos contra esta enfermedad.

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 Financiado en parte por FONDECYT, International Foundation for Science y DTI, Universidad de Chile

Material y métodos

Virus. Para la sensibilización de las microplacas de ELISA se empleó la cepa vacunal H-120 del virus de la BIA de origen comercial (Intervet, Boxmeer, Holanda). Esta cepa fue sometida, den acuerdo con otros autores (Hidalgo y Raggi, 1976), a un pasaje en huevos embrionados provenientes de un plantel que no había sufrido brotes asociados a agentes de posible transmisión vertical como adenovirus, virus de encefalomielitis aviar y virus de la leucosis linfoide de acuerdo a otros autores. Previo a su utilización en sensibilización de microplacas, el material viral fue titulado en forma estándar (Lukert, 1975) empleando huevos embrionados de 9 a 11 días de incubación de la misma fuente. El contenido proteico de la suspensión viral fue determinado de acuerdo a Bradford (1976).

Sueros de referencia. El suero de referencia positivo empleado en ELISA corresponde a un 'pool' de 15 antisueros obtenidos por inoculación de aves susceptibles los días 1 y 22 con la cepa H-120 y el día 56 con la cepa H-52 del VBIA. El suero negativo empleado fue de origen comercial (Idexx, Portland,EUA).

Microplacas empleadas en ELISA. Se compararon las microplacas de origen comercial Nunc (Nunc, Riskilde, Dinamarca), Nunclon (Nunc, Riskilde, Dinamarca) y Linbro (Flow Laboratories, Virginia, EUA) en términos de su capacidad para ser sensibilizadas con el VBI.

Además se emplearon microplacas sensibilizadas con el VBIA de origen comercial (Idexx, Portland, EUA) con el objeto de comparar sus resultados con las lecturas obtenidas con las placas sensibilizadas en este laboratorio.

Sensibilización de microplacas. La suspensión viral previamente titulada y determinada su concentración proteica fue diluida en primer término al 50% (v/v) en tres 'buffer' empleados en sensibilización preparados de acuerdo a Voller y Bidwell (1986), carbonato, bicarbonato pH 7,4; PBS   pH 7,4 y PBS pH 9,6. Posteriormente se realizaron diluciones adicionales de la suspensión viral desde 100% hasta 0,1 % (v/v) en aquel 'buffer' que, realizada la prueba de ELISA con los sueros de referencia, demostró mayor sensibilidad y especificidad.

La sensibilización de las placas fue realizada con 100 µl de cada una de las diluciones del material viral por pocillo y mantenidas en refrigeración (4ºC) toda la leche. Los controles consideraban microplacas sometidas a sensibilización con líquido alantoídeo de huevos embrionados sin infectar y PBS pH 7,4.

Prueba de ELISA. La prueba de ELISA fue realizada en forma estándar (Voller y Bidwell, 1986) con las siguientes particularidades: Los sueros de referencia fueron diluidos 1/100 en PBS conteniendo 1% de seroalbúmina bovina (BSA); con cada suero se realizaron 10 determinaciones; se empleó como substrato enzimático orthofenildiamina (OPD) (Figura Lbas. St. Louis, USA). Por último la reacción enzimática fue detenida con 100 µl de ácido fluorhídrico (0,12% v/v).

La prueba de ELISA empleando los kits comerciales, fue conducida en forma similar de acuerdo a las indicaciones del fabricante (Idexx, Portland,EUA).

Efecto de la congelación sobre las microplacas sensibilizadas. Algunas microplacas sensibilizadas de acuerdo al protocolo que demostró los mejores resultados en sensibilidad y especificidad fueron sometidas a congelación (-20ºC) por dos semanas. Luego se realizaron pruebas de ELISA empleando estas microplacas y se compararon con placas recién preparadas.

Resultados

La suspensión viral empleada en la sensibilización de las microplacas demostró un título de 106,25 dosis infectantes embrión 50/ml. La determinación proteica mediante Bradford (1976) demostró un contenido de 0,887 µg/µl.

La figura 1 muestra las densidades ópticas obtenidas con los sueros de referencia en cada uno de los tres tipos de microplaca en estudio, cada cual sensibilizado con la suspensión viral diluida en cada uno de tres tipos de 'buffer' de sensibilización.

Figura 1. Densidad óptica obtenidas en ELISA con sueros de referencia, en microplacas de diferente origen comercial sensibilizadas con el virus bronquitis infecciosa aviar diluido en tres medios de sensibilización

La comparación de acuerdo a Scheffe entre los tres tipos de microplaca demostró claras diferencias entre las placas dependiendo del medio sensibilizante empleado. La mayor sensibilidad y especificidad de la prueba se obtuvo con placas Linbro y Nunclon, excepto cuando se empleó 'buffer' carbonato-bicarbonato. En este caso, las lecturas de los sueros positivos fueron mayores en Nunc que en microplacas Linbro y Nunclon. Las lecturas de sueros de referencia negativos no mostraron mayores diferencias entre los tres tipos de microplaca.

Los medios de sensibilización también presentaron diferencias marcadas en las densidades ópticas obtenidas con los sueros de referencia en cada uno de los tres tipos de placas usados. Los valores de densidad óptica más altos se obtuvieron con PBS pH 7,4. El PBS pH 9,6 demostró una sensibilidad levemente inferior mientras que el buffer carbonato-bicarbonato mantuvo en todos los casos lecturas significativamente más bajas (Figura 1).

Las densidades ópticas obtenidas empleando placas Nunclon y Linbro sensibilizadas con distintas diluciones del material viral en PBS (pH 7,4) demostró resultados similares (Figuras 2 y 3). Los valores de densidad óptica más altos con el suero de referencia positivo, tanto en placas Nunclon como Linbro se obtuvieron con la dilución 40% (v/v) del material viral en PBS pH 7,4, aunque las diluciones entre 10 y 50% (v/v) no demostraron diferencias significativas de acuerdo a un análisis t-Student en las microplacas Linbro. Los valores de densidad óptica obtenidos con placas Nunc demostraron una sensibilidad muy inferior y no se muestran en las figuras. Cuando se realizó un mayor número de diluciones del antígeno en PBS pH 7,4 dentro del rango que demostró la mayor sensibilidad, es decir entre 10 y 50% (v/v), las placas Linbro no demostraron diferencias estadísticamente significativas en sus lecturas entre las diluciones 23 y 42% (v/v). El valor promedio de las lecturas más alto (0,13) se obtuvo con la dilución 40% (v/v). Los promedios de las lecturas para los sueros de referencia negativos variaron entre 0,00 y 0,011 sin diferencias estadísticamente significativas.

 

Figura 2. Densidades ópticas obtenidas en ELISA con sueros de referencia en microplacas Linbro sensibilizadas con distintas diluciones del VBIA en PBS pH 7,4

 

 

Figura 3. Densidades ópticas obtenidas en ELISA con sueros de referencias en microplacas Nunclon sensibilizadas con distintas diluciones del VBIA en PBS pH 7,4

  En placas Nunclon los sueros positivos no presentaron diferencias estadísticamente significativas de acuerdo a Student entre las diluciones 26 y 42%Ic (v/v). El calor de lecturas promedio más alto (0,126) se registró en la dilución 30% (v/v). Los valores obtenidos con los sueros negativos variaron entre 0,00 y 0,014 sin diferencias estadísticamente significativas entre ellos.

Todos los medios de sensibilización empleados como controles (líquido alantoídeo sin infectar, PBS y BSA) demostraron lecturas con los sueros positivos y negativos que variaron entre 0,00 y 0,019.

La figura 4 muestra las densidades ópticas obtenidas con los sueros de referencia en placas Linbro sensibilizadas con el material viral suspendido en PBS pH 7,4 (dilución 40% v/v) sometidas a congelación durante 2 semanas. Los valores obtenidos con el suero positivo no demostraron diferencias estadísticamente significativas entre el uso de placas congeladas o recién preparadas. Sin embargo, los sueros negativos demostraron lecturas estadísticamente inferiores a las placas sometidas a congelación. Las microplacas Nunclon presentaron diferencias significativas entre tratamientos (congeladas y frescas) tanto con los sueros positivos como negativos. Los mayores valores de densidad óptica obtenidos con microplacas recién preparadas indicaron una mayor sensibilidad. Las placas Nunc no fueron sometidas a estos tratamientos debido a su bajo rendimiento anterior.

Figura 4. Densidades ópticas obtenidas en ELISA con sueros de referencia en microplacas Linbro frescas y sometidas a congelación sensibilizadas con el VBIA diluido en PBS pH 7,4 (40% v/v).

En la figura 5 se presentan los resultados obtenidos con los mismos sueros de referencia en pruebas simultáneas empleando microplacas Linbro y Nunclon sensibilizadas en el laboratorio y microplacas sensibilizadas de origen comercial. De acuerdo a esa figura, las densidades ópticas obtenidas con microplacas de origen comercial fueron aproximadamente cuatro veces mayores.

Figura 5. Densidades ópticas obtenidas en ELISA con sueros de referencia en microplacas sensibilizadas con el VBI en PBS pH 7,4 sometidas a congelación y en microplacas frescas sencibilizadas con el VBIA de origen comercial

Discusión

Al comparar los diferentes medios empleados en la sensibilización de las microplacas con el VBIA, se determinaron valores de densidad óptica más altos con el suero de referencia positivo con PBS pH 7,4 producido de acuerdo a Voller y Bidwell (1986). Este medio por lo tanto, permitiría una mejor adhesión del antígeno a la placa y una mayor sensibilidad de la prueba. Herling y col. (1981) emplearon carbonato-bicarbonato pH 9,6 con buenos resultados; sin embargo estos autores no compararon diferentes medios de sensibilización en su trabajo.

Al comparar microplacas de diferente origen comercial empleando los mismos sueros de referencia (Figura 1), se detectaron diferencias claras en las lecturas. En este ensayo, las microplacas Nunclon y Linbro demostraron los mejores resultados para la sensibilización con el VBIA. En un estudio anterior, García y Bankowski (1980) también habían obtenido buenos resultados con placas Linbro usando VBIA sin purificar. Este resultado indica la necesidad de probar diferentes microplacas que se encuentren disponibles para obtener una mayor sensibilidad y especificidad en ELISA. Además, al no aparecer diferencias significativas en las densidades ópticas determinadas con los mismos sueros de referencia en estas placas luego de un trafamiento de congelación (Figura 4), éste constituye una alternativa para su almacenamiento.

Los resultados indicaron que una dilución determinada del material viral en el medio de sensibilización demostraba mayor sensibilidad de la prueba (Figuras 2 y 3). Este factor ciertamente depende del contenido proteico, establecido mediante Bradford (1976), y del título viral obtenido en la titulación previa. Es decir, es posible que títulos infectantes y/o contenidos proteicos diferentes, determinen una dilución también diferente a ser empleada para alcanzar la mejor sensibilidad. La diferencia detectada con los mismos sueros de referencia al emplear microplacas sensibilizadas de origen comercial (Figura 5) puede atribuirse al uso del agente purificado. En la sensibilización de microplacas con antígeno sin purificar, se establece una competencia entre proteínas irrelevantes y el VBIA por unirse a la placa. Consecuentemente, un número relativamente menor de partículas virales puede unirse al material repercutiendo este hecho en la sensibilidad de la prueba. A pesar de ello las diferencias entre el suero negativo y el suero positivo fueron de aproximadamente 12 veces. Esta diferencia posiblemente podría dificultar mediciones de niveles traza de anticuerpos en algunos trabajos de investigación. Sin embargo, esta sensibilidad permite la detección de niveles mayores de anticuerpos tales como los consecuentes a una vacunación y la posterior determinación de tendencias o perfiles en un plantel comercial.

Referencias

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Recibido el 16 de enero de 1992, aprobado el 28 de octubre de 1992.