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  • Evaluación de la técnica de cultivos celulares frente a la inoculación en ratones lactantes en el diagnóstico de rabia

Resumen

Se realizó la evaluación de la sensibilidad entre dos métodos de confirmación para diagnóstico de rabia: aislamiento en cultivos celulares y aislamiento en ratones lactantes. Se analizaron 692 muestras provenientes de la vigilancia epidemiológica de rabia entre los meses de marzo a diciembre de 1990, por inmunofluorescencia directa (IFD); y luego de procesadas, simultáneamente se inocularon suspensiones de cerebro en células BHK-21 e intracerebralmente en ratones lactantes.

Ambos sistemas huésped se cosecharon a los 6 días postinoculación. Del total de muestras analizadas, se diagnosticaron 13 casos positivos a rabia por IFD, los cuales fueron confirmados tanto en cultivos celulares como en ratones lactantes. En ratones lactantes se obtuvo: 5 aislamientos positivos a los 6 días postinoculación. 6 a los 12 días y 2 a los 18 días. Sin embargo, en los cultivos celulares los 13 casos positivos fueron aislados a los 6 días postinoculación. La sensibilidad entre ambos métodos es comparable ya que ambos confirmaron los 13 casos positivos. El menor tiempo en la obtención de resultados, de la técnica de cultivos celulares, le otorga ventajas comparativas pues permite adoptar medidas profilácticas y epidemiológicas en forma más oportuna. Además en el laboratorio esta técnica determina una economía de recursos humanos y un menor espacio físico requerido para su ejecución, dejando a la inoculación en ratones como segunda alternativa de diagnóstico de confirmación de rabia.

Palabras Claves

Rabia, diagnóstico

Abstract

Evaluation of the sensibility between two confirmatory methods for the rabies diagnosis was done: isolation in tissue culture and isolation in suckling mice. Direct immunofluorescence (DIF) was used to analized 692 samples coming from the epidemiological surveillance of rabies between March and December 1990. Once they were done, simultaneously were inoculated brain suspension in BHK-21 cells and intracerebrally in suckling mice.

Both host system were harvested 6 days after postinoculation, from the total samples analyzed 13 cases were diagnosed as positive to rabies by DIF, wich were confirmed in cellular culture as in suckling mice. Five positive isollation at 6 days post-inoculation, six at 12 days and two at 8 days were obtained in suckling mice. However, the 13 positive cases in cellular culture were isolated at 6 days post-inoculation. The 13 positive cases were confirmed by the sensitivity compared between both methods. The short time used to obtain results with the cellular culture method gives comparative advantages since it allows to adopt pertinent prophilactic and epidemiological rules. Furthermore, this method economizes human resources and utilize less physical space, so it lets mice inoculation methods as a second alternative for the confirmatory diagnosis of rabies.

Keywords

Rabies, diagnostic

Introducción

Por las características de patogenicidad de la rabia, se requiere de un sistema de vigilancia epidemiológica que permita un control rápido y eficaz de la enfermedad.

El diagnóstico de laboratorio es un soporte estratégico del sistema de vigilancia epidemiológica en un determinado territorio. La sensibilidad y la rapidez de los métodos de diagnóstico en el laboratorio tienen una importancia relevante para establecer las medidas de control (Baer y col., 1982; Com. Expertos en Rabia oMS, 1984; Rudd y col, 1980).

Desde el año 1903 en que Adelchi Negri describe las inclusiones citoplasmáticas en cerebros de animales rabiosos, éstas pasaron a ser consideradas patognomónicas de rabia y usadas como criterio diagnóstico por más de 50 años (Baer y col., 1982; Rudd y col., 1980). En 1959 Goldwaser y Kissling adaptan el test de anticuerpos fluorescentes para el diagnóstico de rabia, que es el método más ampliamente usado por los laboratorios de diagnóstico de rabia (Baer y col., 1982).

La inmunofluorescencia es una técnica rápida y de alta sensibilidad, cercana al 100%; sin embargo requiere de una prueba confirmatoria para disminuir al máximo la probabilidad de obtener resultados falsos negativos dado que la decisión médica que se tome es de vital importancia en el tratamiento post-exposición (Rudd y col., 1980).

A partir de 1935, en que Webster y Dawson introducen la inoculación en ratones adultos como prueba confirmatoria de inmunofluorescencia, se ha buscado constantemente un método más sensible y rápido de confirmación de rabia. Así, en 1970, Bagnaroli y col. demuestran que los ratones lactantes presentan una mayor sensibilidad al virus rábico, por lo que esta técnica es ampliamente utilizada en la confirmación de la inmunofluorescencia. Aunque este método es de fácil aplicación y alta sensibilidad, tiene la desventaja de entregar resultados entre 7 y 18 días postinoculación, que es el período de incubación del virus en ratones (Koprowski, 1976; Larghi y col., 1975).

En Chile desde el año 1970 en que se inició el diagnóstico de rabia por la técnica de IFD, aumentó su concordancia con el diagnóstico biológico en ratones (DB), llegándose en los últimos años a un 100%. (Favi y Durán, 1991).

Dada la importancia de obtener en el menor tiempo posible un diagnóstico concluyente, se iniciaron en 1988 los estudios preliminares en células BHK-21, como método de diagnóstico confirmatorio. Se utilizaron cepas de virus rábico obtenidas en el Laboratorio de Diagnóstico de Rabia del Instituto de Salud Pública; se evidenció antígeno en las células BHK-21, a las 24, 48 y 72 hrs. postinoculación por la técnica de IFD (Favi y col., 1991); no se observó efecto citopático en los cultivos celulares (Fernández y col., 1963; Kaplan y col., 1960).

Estos resultados preliminares obtenidos en células BHK-21 nos llevaron a evaluar la sensibilidad y especificidad de la técnica de cultivos celulares, frente a la inoculación en ratones lactantes, para su utilización en el diagnóstico de rutina.

Material y métodos

Para la realización de este trabajo se utilizó: - Línea celular continua de riñón de Hamster (BHK-21) mantenida por el laboratorio de cultivo celular del Instituto de Salud Pública. Se sembraron 100.000 cel/ml en tubos Leighton usando como medio de crecimiento MEN EE. (Medio Mínimo Esencial Eagle Earle) adicionado de suero fetal bovino y 10% de PTB (Caldo Triptosa Fosfato). Previo a la inoculación, cuando los cultivos celulares mostraron un crecimiento aproximado de 80%, se cambió a medio de mantención (MEN EE + 10% PTB sin suero fetal bovino). - Ratones Albino Swiss cepa CF1 de 1 a 2 días de edad, entregados por el Bioterio del Instituto de Salud Pública.

Se analizaron 692 muestras provenientes de la vigilancia epidemiológica de rabia, recibidas en el laboratorio entre los meses de marzo a diciembre de 1990. Estas muestras corresponden a las siguientes especies: caninos 403; quirópteros 208; felinos 56; ratas 22; y bovinos 3.

A partir de estas muestras se prepararon suspensiones de cerebros al 20% en diluyente (Solución tampón, suero normal equino al 2% y antibiótico) las cuales fueron inoculadas simultáneamente en cultivos celulares (BHK-21) y en ratones lactantes por vía intracerebral.

Se inocularon dos tubos Leighton por muestra con 0,2 ml, por tubo de la suspensión de cerebro y se incubaron a 36ºC por 6 a 7 días hasta el momento de la cosecha. Se inocularon 10 ratones lactantes por muestra con un inóculo de 0,01 ml.

Después del sexto día de inoculación se cosecharon las células BHK-21 mediante el siguiente procedimiento: una vez eliminado el medio de mantención, el cubre objeto fue retirado y depositado en un tubo de ensayo, donde se fijó en acetona durante una hora a - 20ºC. Posteriormente se colocó sobre un porta objeto, sometiéndose a tinción directa con anticuerpos fluorescentes, según la técnica descrita por Larghi (1975).

En el caso de ratones lactantes se sacrificó un ratón por muestra los días 6, 12 y 18 postinoculación. La cosecha de los cerebros se realizó según la técnica descrita por Koprowsky (1976). Se efectuaron dos impresiones por ratón, las cuales fueron fijadas en acetona por una hora a - 20ºC para posteriormente realizar la tinción.

Después de la tinción, en ambos métodos se procede al diagnóstico IFD. Se consideró una muestra como positiva, al tercer antígeno rábico en una o más células.

Resultados

En el cuadro 1 se presentan los resultados obtenidos de las 692 muestras estudiadas durante los meses de marzo a diciembre de 1990, que corresponden a la vigilancia epidemiológica de las distintas regiones del país, analizadas por IFD, diagnóstico biológico en ratón lactante (DB) y aislamiento en cultivos celulares.

CUADRO 1 CASOS ANALIZADOS PARA DIAGNÓSTICO DE RABIA Marzo-Diciembre 1990-Chile

-

Negativos

Positivos

Total

- Diagnóstico rápidos por inmunofluorescencia directa

679

12 (1+/-)

692

- Diagnóstico confirmatorio aislamiento en ratón lactante

679

13

692

- Diagnóstico confirmatorio aislamiento en cultivo celular

679

13

692

+/- indeterminado.

  De las 692 muestras analizadas se detectaron 13 casos positivos tanto en la técnica de inoculación en ratones lactantes como en la inoculación en cultivos celulares. Por IFD se observó un caso indeterminado, el que fue aislado como positivo en ambas técnicas confirmatorias en estudio.

En el cuadro 2 se puede observar la localización geográfica y las especies con resultados positivos a rabia. Se aprecia un mayor número de murciélagos positivos en relación a los perros. La Región Metropolitana presenta la mayoría de los casos positivos del país, en comparación con las Regiones V, VI y VIII.

CUADRO 2 TOTAL CASOS POSITIVOS A RABIA Marzo-Diciembre 1990-Chile
-

RM*

V**

VI***

VIII****

Total

- Murciélagos

8

1

-

2

11

- Perros

1

-

1

-

2

- Total

9

1

1

2

13

**** RM : REGIÓN METROPOLITANA **** V : V REGIÓN **** VI : VI REGIÓN **** VIII : VIII REGIÓN

En el cuadro 3 se observa que la técnica de inoculación intracerebral en ratones lactantes, a los 18 días postinoculación confirma el total de casos detectados por IFD. La técnica de inoculación en células BHK-21 confirmó los 13 casos positivos detectados, a los seis días postinoculación.

CUADRO 3 CONFIRMACIÓN DE LOS CASOS POSITIVOS A RABIA DETECTADOS POR IFD Marzo-Diciembre 1990-Chile

 Aislamiento en:

6 Días

12 Días

18 Días

Total

- Ratones

5

6

2

13

- C.C. (BHK-21)*

13

-

-

13

* Cultivo celular BHK-21.

Discusión

Las células BHK-21 han demostrado ser un sistema huésped que manifiesta rápidamente la inefectividad del virus rábico, lo que está determinado por un corto período de incubación, y por lo tanto permite tener una confirmación de rabia en menor tiempo que la técnica tradicional en ratones lactantes (Favi y col., 1991).

Según Debbie y col. (1972) señalaron que es posible evidenciar antígeno fluorescente en las células BHK-21 infectadas, a las 36 hrs de incubación, y a partir de los 5 días esta fluorescencia se hace extensiva a la mayoría de las células.

Larghi y col. (1975) y Koprowsky (1976) coinciden en señalar que la presencia de sintomatología en ratones lactantes entre los seis y 22 días postinfección, permite sospechar de rabia. El Comité de Expertos de la OMS sobre la rabia en 1984, indican que ratones inoculados con material sospechoso pueden comenzar a sacrificarse sólo a partir del cuarto día de infectados y someter las muestras a inmunofluorescencia a fin de disminuir el período de observación en espera de sintomatología.

Es interesante destacar que, de acuerdo a nuestros resultados, las cinco muestras confirmadas como positivas a rabia a los 6 días por aislamiento en ratones lactantes, correspondieron a murciélagos cuyo título viral fue > 10. El resultado indeterminado por inmunofluorescencia se confirmó como positivo a rabia a los 18 días de inoculación por la técnica de aislamiento en ratones lactantes; sin embargo, en células BHK-21 se obtuvo un diagnóstico concluyente a los seis días de inoculación; o sea una tercera parte del tiempo requerido por la técnica de aislamiento en ratones lactantes, lo que permite adoptar medidas profilácticas y epidemiológicas de manera más oportuna.

De acuerdo a los resultados obtenidos, se puede concluir que la técnica de aislamiento en ratones lactantes y la técnica de aislamiento en cultivo celular (BHK-21) presentan la misma sensibilidad y especificidad como pruebas confirmatorias de inmunofluorescencia para el diagnóstico de rabia. Sin embargo, la técnica de aislamiento en cultivos celulares presenta ventajas comparativas adicionales a su mayor rapidez, pues en su ejecución permite una economía en recursos humanos, animales y mantención de los mismos, menor espacio físico y menor costo operacional, en relación al aislamiento en ratones lactantes. Así mismo permite el reemplazo de animales, por técnicas que evitan su uso eventualmente innecesario en diagnóstico.

Dada nuestra experiencia y sobre la base de los resultados obtenidos durante el año 1990, en el Laboratorio de Diagnóstico de Rabia, actualmente se utiliza como método confirmatorio el aislamiento en células BHK-21, dejándose a futuro sólo como método alternativo el aislamiento en ratones lactantes.

Referencias

BAER, G. 1982. La historia natural de la rabia. México, PrensaMédica Mexicana S.A. Ediciones Científicas. 370 pp.

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Recibido el 9 de julio de 1992, aprobado el 27 de octubre de 1992.