Trabajos Originales

  • Respuesta serológica y protección en terneras revacunadas con cepa 19 en dosis reducida

Resumen

De 8 predios lecheros ubicados en el área centro-sur del país con prevalencias de brucelosis superiores a 20%, se seleccionaron terneras vacunadas 2 a 6 meses antes con Brucella abortus Cepa 19 en forma tradicional. En cada predio se formaron al azar dos grupos, uno Tratado que recibió una revacunación con la misma Cepa 19, en dosis de 4,5 x 109 UFC por vía conjuntival y otro grupo Control, sin revacunar. Las terneras revacunadas totalizaron 157 y las controles 90.

En los días 0, 45, 90, 180, 360, 540 y 720 post-revacunación, se obtuvo muestras de sangre de las terneras de ambos grupos y sus sueros fueron sometidos a las pruebas de seroaglutinación estándar y Rosa de Bengala. Toda muestra reactora a alguna de estas pruebas o a ambas, fue sometida a la prueba de inmunodifusión doble para descartar la reacción debida al efecto vacunal y verificarla como presunta de infección natural.

Se comprueba que en las diferentes oportunidades estudiadas, el número de terneras reactoras a estas pruebas no difiere significativamente entre los grupos Tratados y Controles. Llama la atención que el número de animales reactores decrece hasta el día 360 y comienza aumentar a los días 540 y 720, lo que coincide con la aparición de reactores a la prueba de inmunodifusión.

Se concluye que el esquema de revacunación empleado no aumenta la protección en los animales revacunados durante el período observado. Al mismo tiempo se comprueba que la aplicación de Cepa 19 en forma tradicional practicada con anterioridad a las terneras de ambos grupos, no protege adecuadamente a la totalidad de éstas, pues comienzan a infectarse y hacerse reactoras a las pruebas comunes de diagnóstico luego de los 2 años de vacunadas.

 

Palabras Claves

Cepa 19, revacunación, terneras

Abstract

From 8 dairy farms having more than 20% of brucellosis prevalence, 247 heifer-calves were selected after 2 to 6 months of the traditional immunization withBrucella abortus Strain 19 (S19). Two groups were established in each farm and a total number of 157 animals received a revaccination with 4.5 x 109 CFU of S19 through the conjunctival route, while 90 animals remained unvaccinated.

All the animals were bled at days 45, 90, 180, 360, 540 and 720 after revaccination and the sera were tested by SAT and RBT. The reactors to one or both of these tests were retested by a double immunodiffusion test (ID) using aB. abortus polysaccharide antigen to discard the vaccine response and detect a possible natural infecction. No significative differences (p > 0.05) between the control and revaccinated groups were found respect to SAT and/or RBT reactors. It is noticeable that the number of reactors decreased until the day 360 and increased slowly in the 540 and 720 sampling days, concurrent with the appearence of ID reactors. It is concluded that the effect of revaccination proposed did not enhanced the protection of animals during the period of study. At the same time is was showed that the traditional use of S19 did not protect efficiently because some animals became reactors to ID test after 2 to 2 1/2 years of being vaccinated.

Keywords

Strain 19, revaccination, heifer-calves

Introducción

La vacunación con Cepa 19 ha sido uno de los elementos de mayor importancia utilizados para controlar la brucelosis del bovino, ello basado tanto en la patogenicidad reducida natural de esta cepa, como en su característica de no diseminarse (Manthei, 1959; FAO/OMS, 1986).

Esta vacuna produce una inmunidad adecuada por un tiempo prolongado, aunque pocos días postvacunación genera una respuesta serológica detectable por la mayoría de las pruebas de diagnóstico que puede persistir por meses y aún por más de un año (Alton, 1978; Nicoletti, 1981; Pinochet y col., 1985). Sin embargo en la práctica es corriente encontrar que animales vacunados, cuya respuesta postvacunal ya ha desaparecido, se hacen nuevamente reactores a las pruebas de diagnóstico e incluso llegan a abortar, demostrando que la vacunación ha sido incapaz de protegerlos debidamente. Esta situación se repite frecuentemente en los predios que tienen una elevada prevalencia de la enfermedad (Alton, 1978; Plommet, 1980).

Con el fin de evitar estos problemas, se han propuesto esquemas de revacunación con Cepa 19 a diferentes edades, modificando la dosis y vía de aplicación. Se ha concluido que los problemas de respuestas serológicas post-revacunación no serían tan intensos ni se prolongarían en el tiempo y que el grado de protección del animal mejora convenientemente (Plommet y Fensterbank, 1976; Alton, 1978; Nicoletti, 1979, Plommet, 1984; Pinochet y col., 1986).

En nuestro país se aplicó una vacunación y luego una revacunación en terneras, ambas con dosis reducida de Cepa 19, y se comprobó que la respuesta serológica era menor en intensidad y persistencia a la comparada con la vacunación tradicional (Iriondo, 1984).

Para determinar la eficacia de estos esquemas especiales se han realizado pruebas de protección empleándose el desafío experimental y la comprobación bacteriológica de la infección, además de la presencia de aborto (Plommet y Plommet, 1976). Sin embargo, al respecto se carece de experiencias en terreno.

El objetivo presente es conocer si en un ambiente infectado se mejora la protección de las terneras vacunadas en forma tradicional al revacunarlas con una dosis reducida de Cepa 19, verificando también si la respuesta serológica post-revacunación altera o no el diagnóstico.

 

 

 Financiado por Proyecto FONDECYT 0439/88

Material y métodos

Se seleccionaron ocho predios lecheros ubicados en la zona centro-sur del país, que demostraron una prevalencia de brucelosis superior a 20% a pesar de aplicar rutinariamente a sus terneras la vacunación tradicional con Cepa 19 a través del servicio oficial del Ministerio de Agricultura. Estos predios se identificaron con las letras A, B, C, D, E, F, G y H.

De cada predio se seleccionaron terneras que recibieron la vacunación oficial entre 2 a 6 meses antes del inicio de la experiencia. Estos animales se dividieron al azar en dos grupos identificados como Tratado y Control, los que se mantuvieron juntos y con el manejo usual de cada predio. El número de terneras por grupo fue establecido por el método de la binomial corregida (Morales y Mansilla, 1989), esperando que al final de la experiencia existiese una diferencia de prevalencia entre ambos grupos de un 20%. Los grupos Tratados totalizaron 157 animales y los Controles 90.

Las terneras de los grupos Tratados, recibieron una revacunación con Brucella abortus Cepa 19 en una dosis reducida de 4,5 x 109 UFC (Unidades Formadoras de Colonias), aplicada por vía conjuntival, de acuerdo a lo recomendado por Plommet y Plommet (1976). Los grupos Controles no recibieron revacunación.

La evaluación de la respuesta serológica se realizó a través del análisis de sueros sanguíneos de Tratados y Controles, que fueron obtenidos simultáneamente en los días 0, 45, 90, 180, 360, 540 y 720 post-revacunación.

Las pruebas de diagnóstico utilizadas fueron las tradicionales de seroaglutinación estándar (SAE) (Alton y col., 1988) usando un antígeno normalizado según el patrón de OPS/OMS* y la prueba de Rosa de Bengala (RB) (Alton y col., 1988) utilizando un antígeno comercial.

Con el fin de descartar la respuesta serológica debida a Cepa 19, todas las muestras que resultaron reactoras a SAE con título  ≥ 100 y/o a RB, fueron sometidas a una prueba de inmunodifusión doble (ID) utilizando un antígeno soluble de Brucella normalizado (Pinochet y col., 1990).

Para evaluación de la protección del esquema de revacunación propuesto, frente a un desafío en una situación natural de campo, se consideró animal presumiblemente infectado al reactor a una o ambas pruebas tradicionales de diagnóstico y además a la prueba de ID.

Los resultados de la experiencia, obtenidos a través del tiempo, fueron analizados estadísticamente.

Resultados

En los cuadros 1 y 2 se presenta el número de terneras reactoras a las pruebas de SAE y RB, tanto en los grupos Tratados como en los Controles. Las diferencias entre los grupos no son estadísticamente significativas (p ≥ 0,05) para SAE o RB, en ninguno de los períodos del ensayo. En ambos grupos de terneras el número de reactores disminuye gradualmente, lo que se hace notorio hasta el día 360; luego aumentan en los días 540 y 720. En el cuadro 3 se aprecia la presencia de terneras reactoras a ID, que en el grupo Tratado se presenta sólo desde el día 540 post-revacunación. En el grupo Control esta circunstancia comienza en el día 180 post-inicio del ensayo. Al final de la experiencia, día 720, se diagnosticó un total de cuatro animales reactores a ID, dos en cada grupo en estudio. Estos reaccionantes, en relación al total de animales por grupo, no indican diferencias significativas (p ≥ 0,05). Los porcentajes de reactores acumulados a ID son 3,0% para el grupo Tratado y 4,6% para el grupo Control.

CUADRO 1 NÚMERO Y PORCENTAJE DE TERNERAS DEL GRUPO TRATADO, REACTORAS A SEROAGLUTINACIÓN ESTÁNDAR (SAE) Y ROSA DE BENGALA (RB), EN DIFERENTES PERÍODOS POST- REVACUNACIÓN CON CEPA 19, DOSIS REDUCIDA, VÍA CONJUNTIVAL

Días post- revacunación N SAE reactoras % RB Reactoras %
0 157 26 16,6 21 13,4
45 157 22 14,0 21 13,4
90 157 16 10,2 16 10,2
180 155 9 5,8 6 3,9
360 155 7 4,5 5 3,2
540 154 18 11,7 8 5,2
720 116 13 11,2 6 5,2
CUADRO 2 NÚMERO Y PORCENTAJE DE TERNERAS DEL GRUPO CONTROL, REACTORAS A SEROAGLUTINACIÓN ESTÁNDAR (SAE) Y ROSA DE BENGALA (RB), EN DIFERENTES PERÍODOS POST-INICIO DE LA EXPERIENCIA  
Días post- inicio exp. N SAE reactoras % RB reactoras %
0 90 8 8,9 14 15,6
45 90 8 8,9 8 8,9
90 90 7 7,8 5 5,6
180 90 6 6,7 7 7,8
360 90 1 1,1 2 2,2
540 89 6 6,7 3 3,4
720 81 6 7,4 4 4,9
CUADRO 3 NÚMERO DE TERNERAS REACTORAS A LA PRUEBA DE INMUNODIFUSIÓN (ID), EN LOS DÍAS 180, 360, 540, Y 720 DE LA EXPERIENCIA  
Grupo Días **
180 360 540 720
Tratado 157 155 154 116
ID (+)* 0 0 2 2
% - - 1,3 1,7
Controles 90 90 89 81
ID (+)* 1 0 1 2
% 1,1 - 1,1 2,4

** Reactores a la prueba de inmunodifusión doblé (presuminablemente infectados) ** Días post- revacunación o post- inicio de la experiencia

En el cuadro 4 se observa que el número de reactores a las pruebas clásicas, debidas a vacunación o revacunación, decrece en el grupo Tratado del día 45 hasta el día 360, oportunidad en que comienza a aumentar. De las 10 terneras reactoras que se diagnosticaron el día 720 post-revacunación, 6 lo fueron por efecto de la vacunación o revacunación y 4 por la de infección natural, según la prueba de ID.

CUADRO 4 NÚMERO Y PORCENTAJE DE TERNERAS TRATADAS, REACTORAS A SEROAGLUTINACIÓN ESTÁNDAR Y/O ROSA DE BENGALA, EN DIFERENTES DÍAS POST- REVACUNACIÓN

Días post- revacunación 45 90 180 360 540 720

157

157

155

155

154

116

Reactoras*

31

24

12

11

15

10

% 19,7 15,3 7,7 7,1 9,7 8,6
* No se contabilizan los animales que además reaccionan a la prueba de ID

En el cuadro 5 se aprecian los resultados finales de la experiencia en base al número inicial de terneras en estudio. Sólo dos predios, el A y el E, presentan reactores a ID en el grupo Tratado. En los grupos Controles, tres predios presentan reactores a esta misma prueba.

CUADRO 5 TERNERAS REACTORAS A LA PRUEBA DE INMUNODIFUSIÓN DOBLE, EN LOS GRIPOS TRATADOS Y CONTROLES, Y SU DISTRIBUCIÓN POR PREDIOS

- Grupo tratado Grupo control
Predios ID (+)* ID (+)*
A 34 3 12 0
B 24 0 5 0
C 8 0 13 0
D 24 0 10 1
E 6 1 14 2
F 19 0 15 1
G 14 0 5 0
H 28 0 16 0
- 157 4 (2,54%) 90 4 (4,4%)

* Tenemos reactoras a la pruba de ID (presumiblemente infectadas)

Durante el tiempo que duró la experiencia, la prevalencia de brucelosis en el grupo Control alcanzó a 4,4%.

Discusión

Se consideró que el mantener los animales en estudio, expuestos a tasas altas de infección en un ambiente natural, sería un desafío adecuado, real, de bajo costo y riesgo para evaluar el método de vacunación propuesto. La exposición a la infección se aseguraba con las altas prevalencias de los predios considerados y con antecedentes de experiencias similares realizadas en animales adultos de los mismos predios (Pinochet y col., 1991). Sin embargo en esta experiencia no se logró un número adecuado de animales infectados (detectables por la prueba de ID) en el grupo Control (Cuadro 5). La aparición de tres animales tratados presumiblemente infectados y ninguno en el grupo Control en el predio A, sin duda distorsiona la observación de la presión de infección a que estuvieron sometidos todos los animales en el predio, no teniendo este hecho una explicación coherente. Esto impidió evaluar correctamente el método de vacunación. Posiblemente sea después, en la lechería misma, durante el proceso productivo, donde los animales están más expuestos a la infección. Por problemas de manejo, ajenos a la experiencia, la mayoría de los animales sufrieron un retraso que impidió el ingreso a la producción en una edad adecuada y por lo tanto una exposición más larga al medio infectado. Se aprecia claramente en el cuadro 3, que es en los dos últimos muestreos donde se acumula la mayoría de los animales presumiblemente infectados. Se estima que con una observación más prolongada se lograría que los animales tuvieran más posibilidades de exponerse al desafío natural, permitiendo evaluar en mejor forma la vacunación. Aun considerando el desafío o el período de observación como no adecuado, se aprecia que el efecto de la revacunación no ejercería una protección mayor que la que otorga la vacuna oficial, siendo incluso ambas insuficientes. Existe igual número de animales presumiblemente infectados en los dos grupos, con muy leve diferencia en los porcentajes. Cuando a los dos años, animales vacunados y revacunados presentan una incidencia determinada por la prueba de ID de 2,5% y 4,4% respectivamente, se puede pensar como Viana y col. (1982), que en un medio muy infectado la Cepa 19 no tendría una efectividad mayor a este período.

Las pruebas de SAE y RB utilizadas son de uso corriente en el país y aunque merecen algunos reparos, especialmente SAE, son bastante sensibles frente a casos de respuestas postvacunales y a las reacciones por infecciones de campo (Nicoletti, 1979). La prueba de RB es usada con mucha frecuencia como screening en las campañas y programas de control.

La prueba de ID se utilizó para diferenciar a los reactores cuya respuesta obedecía a infección natural por Brucella, de aquellos cuya respuesta era provocada por la vacunación con Cepa 19. Esta prueba ha demostrado ser bastante eficaz para diferenciar estos sueros, con una sensibilidad de 93,4% y una especificidad generalmente de un 100% (Lord y col., 1989; Pinochet y col., 1990). Al inicio de la experiencia se observa que un porcentaje importante de animales presenta reactividad a las pruebas de diagnóstico, lo que es normal, pues todos fueron vacunados en forma tradicional con Cepa 19 y al momento del inicio del ensayo, 2 a 6 meses después de la vacunación, aún podrían existir anticuerpos en circulación (Alton, 1978; Alton y col., 1980; Nicoletti, 1981; FAO/OMS, 1986). Existió diferencia entre el porcentaje de reactores iniciales a SAE de los grupos Tratados y Controles que se debe a circunstancias del azar ajenas a la experiencia.

Con respecto a la respuesta serológica que produjo la revacunación, se esperaba un mayor número de reactores para el día 45 y que después éste comenzaría a disminuir paulatinamente (Fensterbank y Plommet, 1979). Sin embargo, la revacunación no evidenció ningún efecto serológico, manteniéndose el porcentaje de reactores a la prueba de RB y disminuyendo levemente en la de SAE. Este comportamiento fue muy similar al de los grupos Controles, no apreciándose diferencias significativas en los diferentes muestreos entre los dos grupos. No se encuentra explicación a este hecho, pues no ocurre lo mismo en adultos, los que muestran un aumento significativo de reactores después de una vacunación similar (Pinochet y col., 1991).

Analizando los muestreos siguientes al día 45, se aprecia una disminución de las reacciones serológicas a las pruebas de diagnóstico tradicionales y que se mantiene hasta el día 340, siendo algo más elevada en los animales vacunados que en los controles. La prueba de SAE aparece como más sensible frente a esta situación. El alza en el número de reactores en los días 540 y 720, coincidiendo con la aparición de reactores a ID, indicaría que se hacen presentes las respuestas serológicas debidas a la infección de campo.

Al día 720, la persistencia de reactores a SAE y RB, después de descartar los animales presumiblemente infectados a través de la prueba de ID, fue de 8,6% (Cuadro 4) en el grupo Tratado. Estos resultados difieren de los de Fensterbank y Plommet (1979), quienes establecen en condiciones similares de vacunación que los reactores disminuyen en dos o tres meses. La observación posterior de estos reactores definirá si permanecen como un efecto indeseable de la revacunación o desaparecen, quedando los animales negativos a las pruebas de diagnóstico.

En el seguimiento de un trabajo similar (Iriondo, 1984), hemos encontrado a los 4 años del uso de un esquema repetido de vacunación en dosis reducida en terneras, un porcentaje de reactores a SAE y RB similar, tanto en el grupo de animales que previamente habían sido inoculados con Cepa 19 en forma tradicional como en los animales que recibieron una primovacunación en dosis reducida.

La aparición de reactores a las pruebas de diagnóstico al final del ensayo, especialmente a la ID que preferentemente detecta anticuerpos provenientes de infección natural, refleja una situación que se aprecia en la práctica y que se repite en predios lecheros del área centro-sur que tienen prevalencias altas, como los seleccionados para este estudio. Esta situación se da a pesar de la rigurosidad en el empleo tradicional de Cepa 19 y refuerza la opinión de que en áreas de alta prevalencia, la protección otorgada por esta vacunación no dura más allá de 2 a 3 años.

Concluyendo, se desprende de estas experiencias la necesidad de prolongar el tiempo de observación de los animales y también conocer cuál sería la mejor oportunidad, luego de la vacunación tradicional con Cepa 19, para revacunar a las terneras a manera de mejorar su protección antes de que éstas ingresen en su período reproductivo, lo cual implicará una mayor exposición al agente.

Agradecimientos

Se agradece la importante colaboración de los doctores Nancy Poquet, Osvaldo Domínguez y Patricia Ruiz.

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Recibido el 23 de abril de 1992, aprobado el 3 de noviembre de 1992.