Artículos Generales

  • Nuevas herramientas para el estudio histológico del sistema nervioso

Resumen

 A brief review is given of the use of enzymes and lectines; these vegetal substances are transported through the axonal low in the retrograde as well as in the anterograde direction and are therefore tools to label monosynaptically connected pathways.



The weat germ agglutinine conjugated with horseradish peroxidase result in fifty fold increase of the labeling. The utilization of certain neurotropic virus as transneuronal markers are described.



Key words: Anterograde, retrograde labeling, transneuronal markers, WGA-HRP,  neurotropic virus.
Palabras claves: Marcación retrógrada y anterógrada, marcadores transneuronales, WGA-HRP, virus neurotrópicos.

Abstract

 A brief review is given of the use of enzymes and lectines; these vegetal substances are transported through the axonal low in the retrograde as well as in the anterograde direction and are therefore tools to label monosynaptically connected pathways.



The weat germ agglutinine conjugated with horseradish peroxidase result in fifty fold increase of the labeling. The utilization of certain neurotropic virus as transneuronal markers are described.



Key words: Anterograde, retrograde labeling, transneuronal markers, WGA-HRP,  neurotropic virus.
Palabras claves: Marcación retrógrada y anterógrada, marcadores transneuronales, WGA-HRP, virus neurotrópicos.

Introducción

Desde su introducción por Kristensson o Olsson (1971), el uso del transporte intraaxonal retrógrado de trazadores macromoleculares, especialmente Horseradish Peroxidase (HRP), ha probado ser un método seguro y sensible para la identificación positiva de cuerpos neuronales desde los que se originan proyecciones hacia el interior del sistema nervioso o hacia la periferia.

Aunque las investigaciones de las conexiones neurales enfatizan el transporte retrógrado de HRP (Jacobson y Trojanowski, 1975), el transporte anterógrado también ha sido descrito por varios investigadores (Colman y col., 1976).

La HRP es una glicoproteína de origen vegetal que contiene un grupo heme esencial para su actividad histoquímica (Straus, 1974); con un peso molecular de 40 KDa y un radio molecular de 3 Onm. El proceso neurohistoquímico para esta enzima consiste en una serie de etapas sucesivas: inyección intracerebral in vivo, incorporación neuronal, transporte axoplasmático y visualización histoquímica de la enzima.

La inyección directa de HRP al interior del cerebro con una microjeringa da como resultado la difusión de la enzima de varios milímetros en el Sitio de liberación, dependiendo de la cantidad inyectada y la velocidad de la inyección. La zona visible de difusión constituye el sitio de inyección que consiste de una región central en la que todo el elemento tisular aparece lleno con HRP, rodeado de un halo progresivamente débil a medida que aumenta la distancia al centro. Cuando las inyecciones son atraumáticas el marcador HRP es captado principalmente desde la región central del sitio de inyección, por los terminales sinápticos (Turner y Harris, 1974).

Estudios con microscopía electrónica han mostrado que a diferentes tiempos después de la inyección, HRP aparece sucesivamente en vesículas pinocíticas, sacos membranosos, túbulos y cuerpos densos multivesiculares. Con intervalos prolongados después de la inyección, HRP desaparece de estos elementos en la misma secuencia, sugiriendo, que las etapas de incorporación, empacamiento y degradación lisosomal del trazador involucra aquellos organelos ultraestructurales.

La captación de HRP por los terminales está directamente acoplada a su actividad sináptica (Holtzman, 1977). La captación se reduce marcadamente por inhibición de la actividad sináptica por pentobarbital sistémico (Turner, 1977) o por remoción del input excitatorio de las neuronas (Singer y col., 1977). En cambio está aumentada por estimulación de células en crecimiento, en animales juveniles, en la reinervación por regeneración (Kristensson y Sjostrand, 1971) o 'sprouting' axonal (La Vail y La Vail, 1972).

El proceso de visualización de la enzima se lleva a cabo por incubación del tejido fijado y seccionado en un medio conteniendo H202 y una amina aromática como cromógeno, éste polimeriza y adquiere un color intenso cuando es oxidado. Es así como en el sitio de actividad el complejo HRP-H202 oxida al cromógeno y resulta en la precipitación de un producto de reacción coloreado el cual actúa como marcador de la actividad del HRP. Variaciones en la técnica original han sido objeto de mejoras en aspectos tales como el grado de incorporación, visualización del material transportado por cromógenos más sensibles y la restricción del sitio de inyección (Mesulam, 1978).

Conjugados de HRP con Lectines: carbohidratos ligados a proteínas de plantas y animales, tal como aglutinina de germen de trigo (WGA), (Shipley, 1985), ha logrado aumentar la sensibilidad de marcación en calidad y cantidad de neuronas en 20-50 veces más que HRP libre. La HRP-WGA exhibe una especificidad por los receptores de membrana plasmática neuronal, azúcares de membrana (Sawchenko y Gerhen, 1985) que no posee la HRP además, el daño a las neuronas y sus procesos provocados por la inyección del conjugado, no altera la cantidad de marcador incorporado. El proceso de visualización de HRP-WGA es el mismo empleado para HRP.

Cuando se inyectan concentraciones mayores al 2,5% de HRP-WGA, se produce marcación transneuronal débil (Shipley, 1985), el trazador atraviesa el espacio sináptico, y puede involucrar algunas de las neuronas sinápticamente conectadas.

Recientemente ha ocurrido un novedoso acontecimiento en el campo de la marcación transneuronal. Los virus neurotrópicos están comenzando a ser utilizados como marcadores transneuronales de cadenas de neuronas (Kuypers y Ugolini, 1990). Éstos son dos virus herpes: virus herpes simplex tipo 1 y virus herpes suis (seudorrabia) y dos rhabdovirus inactivados: virus de la rabia y un virus mutante de estomatitis vesicular sensibles a la temperatura. Similar a los trazadores convencionales descritos anteriormente, estos virus son transportados tanto en sentido anterógrado como retrógrado a través de axones y son transferidos transneuronalmente in vitro (Price y col., 1982) e in vivo (Kristensson, 1982).

Antígenos virales como también antígeno HRP, pueden ser fácilmente detectados en neuronas por medio de técnicas inmunohistoquímicas. El uso del virus como trazadores transneuronales ofrece la gran y singular ventaja que luego de ser transferido transneuronalmente son replicados en células recipientes. Estas replicaciones, que no ocurren con trazadores transneuronales no vírales, originan masivas amplificaciones del trazador señal en neuronas recipientes, las cuales resultan más fácilmente identificables (Martin y Dolivo, 1983).

Cuando se usan los métodos inmunohistoquímicos Peroxidasa-Antiperoxidasa o el método Avidin-Biotin, las neuronas marcadas por transferencia transneuronal del virus herpes simplex tipo 1 muestran una tinción semejante a neuronas impregnadas con el método de Golgi, se ven bien teñidos sus cuerpos neuronales y dendritas (McLean y col., 1989) y débilmente teñido su axón (Ugolini y col., 1987).

En esta breve revisión mostraremos algunos resultados obtenidos en nuestro laboratorio después de inyectar periféricamente HRP en el músculo aductor mandibular de la 'rana' chilena, e inyectar intracerebralmente WGA-HRP en el núcleo rojo una estación de relevo troncoencefálica del sistema motor del gato. Este felino es para nosotros la especie animal experimental de preferencia. ¿Por qué tal preferencia?

Los principios de las interrelaciones de las redes neuronales son notablemente similares en el sistema nervioso de todos los vertebrados. Las principales estructuras del cerebro son tan parecidas, por ejemplo, en el gato y en el hombre que para la mayoría de los problemas no parece haber diferencias enestudiar el cerebro de uno u otro. Sin embargo, por principios éticos y religiosos no podemos recurrir a material humano. Por otra parte, los cambios postmortem ocurren tan rápidamente en el cerebro que resulta difícil lograr una adecuada fijación, lo cual imposibilita la utilización de muchos métodos anatómicos en el cerebro humano. El uso de biopsias evita esta dificultad, pero tiene sus limitaciones obvias.

El gato doméstico común es un animal muy prolífero (dos camadas al año); posee un repertorio conductual-neurológico sofisticado y respecto de su sistema nervioso existe abundante información, ya que ha sido un animal clásicamente usado para investigaciones neurológicas. Por otra parte, es necesario hacer notar que para otros estudios experimentales aplicables al daño cerebral en el hombre y en que el estado de maduración es una variable importante, el gato parece de nuevo ser la especie ideal. El estado de madurez del cerebro del gatito al nacer coincide con el del niño según lo indica abundante información anatómica, neurológica, electrofisiológica y metabólica (Villablanca, 1991). Consecuentemente, el estado de desarrollo del cerebro del gatito al nacer es equivalente al del feto humano entre los 168-182 días de gestación. Más adelante el cerebro del gatito madura más rápido de tal modo que a las 3-4 semanas de vida ha alcanzado un desarrollo comparable al de un infante nacido de término. En contraste, al momento de nacer el cerebro de los monos es más maduro y el de los roedores menos desarrollado que el del hombre.

1. Inyecciones de HRP en el Sistema Nervioso Periférico de la "rana"

Con el propósito de sistematizar la técnica de transporte intraaxonal de HRP, nos interesó investigar, como primer intento con HRP la distribución topográfica de las neuronas ganglionares del tectum óptico de la 'rana' endémica de Chile, Calyptocephalella caudiverbera (Saavedra, 1980). De acuerdo con datos recientes, las neuronas tectales jugarían un papel importante en la conducta visuo-motora de los anuros.

Uno de los problemas más comunes en el manejo de este trazador es el control de la cantidad y concentración del marcador inyectado. Si la cantidad es muy grande, la difusión del trazador en el sitio de inyección compromete estructuras no blancas y fibras nerviosas de paso, lo que dificulta la interpretación de los resultados. Para obviar tales problemas inyectamos el trazador en la periferia, lejos del mesencéfalo, en el músculo aductor mandibular de la rana. Después de inyecciones de 1 µl de HRP al 50% (Sigma tipo vi) encontramos neuronas marcadas de tres sitios diferentes del mesencéfalo de la rana. 1. Algunas neuronas en el ganglio de Gasser (Figura 1A). 2. Gran cantidad de neuronas en toda la extensión ántero-posterior del núcleo trigeminal motor (Figura 1B). 3. Un número mayor de neuronas ganglionares HRP positivas en el tectum óptico, distribuidas en el área pretectal y pars rostral del tectum desde la capa ependimaria hasta la capa 6 (Figura 1C).

 

 

Figura 1. A- B- C. Micrografías con microcsopía de luz de los resultados obtenidos después de inyecciones de 1 µl (tres inyecciones) de HRP en el músculo aductor mandibular de la 'rana' chilena. A. Neurona del ganglio de Gasser, marcada con HRP, rodeada de otras ganglionares no marcadas, sólo se observan sus contornos. Barra indica 50 mµ.

Figura 1. B. Grupo de neuronas triangulares del núcleo trigeminal motor, llenas con gránulos de HRP, característica principal de ese tipo de marcación. Barra: 50 mµ.    

Figura 1. C. Ganglionares tectales (G) a bajo aumento distribuidas en las diferentes capas del tectum óptico de la 'rana', a partir de la capa periventricular ependimaria (Ep) hasta la capa celular 8. Se observa que el mayor número de G se encuentra en las capas 4 y 6. Abreviaciones: V = ventrículo. Barra: 50 mµ

El músculo aductor mandibular de la rana está ricamente inervado por ganglionares tectales del núcleo trigeminal mesencefálico, motoneuronas bulbares y pobremente por el ganglio de Gasser. En el área pretectal y capas tectales ependimaria 4 y 6 están la mayor cantidad de ganglionares (Figura 1C).

2. Inyecciones intracerebrales de HRP y HRP-WGA en el gato

Las primeras experiencias llevadas a cabo en nuestro laboratorio con inyecciones intracerebrales de HRP se hicieron en el complejo nuclear talámico pulvinar-lateral-posterior (Saavedra y col., 1987), y en el núcleo rojo (R) (Saavedra y col., 1988). Con el objeto de poner en evidencia el locus intralaminar tectal y los tipos de neuronas del colículo superior (CS) y substancia negra (SN), que dan origen a las aferencias CS-R y SN-R que no fueron evaluados con HRP (Saavedra y col., 1988), inyectamos HRP-WGA en un nuevo grupo experimental de 6 gatos.

Volúmenes de 0,2 µl de HRP-WGA al 2,5% fueron liberados por presión a través de una jeringa Hamilton de 1 µl montada sobre un aparato estereotáxico. Después de 48 horas postinyección y bajo anestesia profunda los animales fueron perfundidos a través del corazón con 1.000 ml de solución salina al 0,9% y 1.000 ml de fijador compuesto por 2% de paraformaldehído y 1,5% de glutaraldehído diluidos en buffer fosfato a pH 7,4. Los cerebros extraídos del cráneo fueron puestos en solución de sucrosa-fosfato al 30% por una noche. Después fueron cortados parasagital y coronalmente a 60 µm de espesor en un micrótomo de congelación y reactados con el cromógeno tetramethylbenzidine de acuerdo con el protocolo de Mesulam (1978).

Figura 2. A. Micrografía con microscopía de luz de los diferntes tipos de neuronas tectales que envían sus axones al R, marcados con HRP- WGA. A-a triangulares grandes; B-b triangulares de tamaño medio y C-c triangulares pequeñas. Barra: 30 mµ.

Figura 2. B. Neurona de tamaño pequeño marcada con HRP- WGA en la parte rostral del R. contralateral. Nótese la calidad de la marcación (célula no descrita en el texto). Barra: 30 mµ.

 
 

 

Figura 2. C. Micrografía de neuronas marcadas en sección coronal de la pars rostromedial de la capa intermedia del colículo superior ipsilateral; G: neuronas grandes; M: medianas. 

Figura 2. D. Neuronas marcadas en substancia negra reticular (SNR); T: triangulares de tamaño medio: F: fusiformes y P: neruronas redondas pequeñas. Barra: 70 mµ

 

Los resultados mostraron que R recibe un número importante de aferencias de tres tipos de neuronas: grandes, medianas y pequeñas, localizadas en la pars rostromedial de las capas oculomotoras intermedias de ambos CS (Figura 2A), como también de tres tipos de neuronas: triangulares, fusiformes, ambas de tamaño medio y ovales pequeñas, distribuidas en los tres subnúcleos de la SN: SN compacta; NS lateral y principalmente SN reticular (Figura 2C).

Los resultados reseñados demuestran que tanto HRP como HRP-WGA son excelentes herramientas para trazar retrógradamente vías nerviosas monosinápticas. La calidad de marcación de las neuronas del tectum óptico de la rana (ver Figuras 1A, B y C) y la ninguna difusión de HRP desde la periferia a otras estructuras cerebrales, le confieren el carácter de óptimo para estudios del sistema nervioso periférico.

Uno de los problemas que acarrea el uso de marcadores inyectados intracerebralmente es inyectar sólo la estructura elegida como blanco. La difusión fuera del blanco compromete a fibras de paso dañadas por la aguja de inyección que dificultan posteriormente la interpretación de los datos. Para este tipo de trabajos se prefiere un marcador más selectivo como HRP-WGA, puesto que éste exhibe una serie de características que no tiene HRP libre, por ejemplo: 1. especificidad para receptores de membrana plasmática neuronal, 2. provee una mejor morfología y sensibilidad y 3. el daño a las neuronas y sus procesos, provocado por la inyección del conjugado, no altera la cantidad de marcador incorporado.

El uso de HRP y HRP-WGA hace posible visualizar axones individuales, su arborización terminal como también su cuerpo neuronal de origen; sin embargo, aún es difícil visualizar cadenas de neuronas conectadas sinápticamente por medio de estos trazadores. La llegada de los virus neurotrópicos vivos ha llenado esta necesidad y están comenzando a ser usados como trazadores transneuronales. Estas poderosas herramientas que son capaces de demostrar conexiones neuronales monosinápticas y polisinápticas como por ejemplo entre nervios periféricos y neuronas cerebrales, han provocado una verdadera explosión, sólo vista en épocas pasadas cuando Camilo Golgi puso en manos de don Santiago Ramón y Cajal su extraordinario método de tinción.

Agradecimientos

Se agradece a la Srta. Alicia Vicente C., por mecanografiar este artículo.

Referencias

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