Artículos Generales

  • Rinoneumonitis equina en Chile (1969 -1992)

Resumen

In this general article is presented the situation of equine rhinopneumonitis in Chile from 1969, when a long and heavy outbreak of abortion occurred at the Central Zone of the country, causing serious losses in thoroughbred. After a program of immunization iniciated in 1974 by using a modified live vaccine (Rhinomune), equine rhinopneumonitis decreased gradually. Equine herpes virus type 1 was isolated from liver of aborted fetuses and nasal or ocular discharges of sick adult horses. In 1984 the virus was isolated again from aborted fetuses belong to Victoria, IX Region of Chile; this is the only case of equine rhinopneumonitis described at the south of the country. Moreover, different studies were done about the use of complement fixation test, viral seroneutralization, passive haemag glutination test and direct fluorescent technique to diagnose equine rhinopneumonitis; adaptation of the virus in guinea pigs and post vaccinal response to modified and inactivated vaccines against this disease. Finally it is discussed the current situation of equine rhinopneumonitis in Chile.



Key words: Virus, equine rhinopneumonitis, horses.
Palabras claves: Virus, rinoneumonitis equina, quinos.

Abstract

In this general article is presented the situation of equine rhinopneumonitis in Chile from 1969, when a long and heavy outbreak of abortion occurred at the Central Zone of the country, causing serious losses in thoroughbred. After a program of immunization iniciated in 1974 by using a modified live vaccine (Rhinomune), equine rhinopneumonitis decreased gradually. Equine herpes virus type 1 was isolated from liver of aborted fetuses and nasal or ocular discharges of sick adult horses. In 1984 the virus was isolated again from aborted fetuses belong to Victoria, IX Region of Chile; this is the only case of equine rhinopneumonitis described at the south of the country. Moreover, different studies were done about the use of complement fixation test, viral seroneutralization, passive haemag glutination test and direct fluorescent technique to diagnose equine rhinopneumonitis; adaptation of the virus in guinea pigs and post vaccinal response to modified and inactivated vaccines against this disease. Finally it is discussed the current situation of equine rhinopneumonitis in Chile.



Key words: Virus, equine rhinopneumonitis, horses.
Palabras claves: Virus, rinoneumonitis equina, quinos.

Antecedentes generales

La rinoneumonitis equina o aborto viral equino es una enfermedad infectocontagiosa que afecta a los equinos, siendo el caballo y la mula las especies más susceptibles a la infección natural con el virus herpes equino tipo 1 (VHE-1), agente causal de esta enfermedad. Los antecedentes históricos de la rinoneumonitis equina (RNE) datan desde la mitad del siglo XIX; actualmente se la considera como una enfermedad de distribución mundial. Dimock en 1940 describió por primera vez una enfermedad viral del feto de los equinos, a la que dio el nombre de aborto viral equino, aceptándose que era un virus la causa de la muerte intrauterina del feto casi a término. La primera forma clínica observada fue a comienzos de 1922, año en que se presentó un gran brote de aborto en equinos de Kentucky (USA), denominándose el agente causal como virus aborto equino. Esta enfermedad fue responsable de gran número de muertes de caballos de remonta durante la Segunda Guerra Mundial, generalmente como consecuencia de complicaciones neumónicas. En ese momento la enfermedad se denominó influenza equina, aunque no fue posible demostrar una relación inmunológica entre este virus y el de la influenza porcina o humana. Otra enfermedad viral de los equinos que produce aborto es la arteritis viral equina, que también estuvo incluida en el grupo clínicamente denominado 'influenza'. Trabajos realizados por Doll y col. (1957) permitieron separar netamente esta enfermedad de la influenza. Actualmente el virus que causa la arteritis viral equina ha sido clasificado en la familia Togaviridae género Arterivirus.

En los primeros estudios realizados entre 1922 y 1933 se observó que los fetos abortados eran bacteriológicamente negativos y que las hembras gestantes abortaban luego de contactos naturales con animales enfermos o a través de la inoculación experimental con material filtrado de órganos de los fetos abortados; las células hepáticas y pulmonares de estos fetos presentaban cuerpos de inclusión intranucleares. Cabe señalar que fueron investigadores europeos, entre ellos Meissner y Harms; Hupbauer y Sedlmeier, los que en la década del 30 asociaron la presentación respiratoria con aborto al observar que las hembras equinas preñadas abortaban meses después del cuadro clínico respiratorio; además, demostraron que al reinocular suspensiones de órganos de fetos abortados en otras hembras gestantes, éstas desarrollaban signos clínicos de influenza y subsecuentemente muchas de ellas abortaban, por lo cual consideraron que el aborto era una secuela de la influenza equina. En 1957 al presentarse la arteritis viral equina como una nueva entidad viral abortigénica, se sugirió llamar al virus aborto equino como virus de la rinoneumonitis equina y consecuentemente rinoneumonitis equina a la enfermedad. Dos años después, Shimizu y col. aislaron en cultivos celulares un virus, cepa H45, que por su antigenicidad y rango de huéspedes correspondía al virus de la RNE, aunque presentaba diferencias significativas, en seroneutralización cruzada, con la cepa aislada anteriormente en Kentucky. Cabe señalar que éste fue el primer informe que demostraba la posibilidad de aislar con éxito el virus de la RNE en cultivos celulares. La caracterización del virus de la RNE en base a estudios de morfología viral de los aislados y su comparación con las características morfológicas, bioquímicas y biológicas con el virus herpes simplex, permitió incluirlo en el grupo de los virus Herpes, denominándosele como virus herpes equino tipo 1(VHE-1). Otros virus herpes que afectan a la Familia Equidae son el VHE-2 o citomegalovirus equino, el VHE-3 causante del exantema coital equino, y el virus herpes asnal 3 que produce enfermedad respiratoria en asnos y burros.

La asociación entre el VHE-1 y mieloencefalitis se reportó por primera vez en 1966, cuando se aisló el virus de tejido nervioso de animales con parálisis. La presentación de cuadros encefalíticos ha sido reportada cada vez con mayor frecuencia, en forma independiente o asociada con cuadros respiratorios. En equinos la muerte perinatal se describió en 1970 al observarse el nacimiento de crías débiles que morían antes de las 72 horas de haber nacido, durante un brote de aborto. Posteriormente en 1977 se asoció la muerte neonatal con una infección prenatal por VHE-1.

La RNE en su presentación respiratoria cursa como una enfermedad epidémica especialmente en la población de potrillos después del destete y durante los meses de otoño e invierno, en su primer año de vida. El período de incubación es de 2 a 10 días. Hay fiebre (± 41ºC), congestión nasal y de la membrana mucosa conjuntival, rinitis serosa, faringitis, traqueobronquitis, anorexia, posteriormente descarga nasal mucopurulenta, y tos. Las infecciones bacterianas secundarias, generalmente por estreptococos, pueden producir complicaciones graves como neumonias, pleuritis y enteritis. Los casos no complicados se resuelven en forma natural entre 4 y 8 días (De Negri, 1988).

El aborto ocurre en forma espontánea, sin signos previos. La muerte del feto ocurre poco antes del aborto, de manera que el feto no está descompuesto, lo que facilita el diagnóstico. El aborto puede ocurrir entre los 14 y 120 días después de la infección con el VHE- 1; la mayoría de los abortos se produce entre los 6 y 11 meses de gestación, siendo el 10° mes el más común. En muchos casos la placenta es eliminada también (Howarth, 1971).

Desde un punto de vista patológico, en la enfermedad respiratoria se observa edema, congestión y petequias en la membrana mucosa nasal; hiperplasia linfoide en la faringe; petequias en los nódulos linfáticos regionales y pequeñas áreas de consolidación en los lóbulos apicales del pulmón. El feto abortado presenta frecuentemente decoloración amarillenta en zonas blancas de la piel, membranas mucosas y principalmente en cascos. En el 90% de los fetos se presenta edema de los pulmones y aumento del líquido pleural. También hay edema subcutáneo, y acúmulo de líquido en la cavidad peritoneal, lo que distiende el abdomen. A veces se observa hemorragias en el pericardio, peritoneo y submucosa intestinal. Las lesiones más constantes y graves son las respiratorias, destacando una intensa inflamación de los cornetes nasales. En la mayoría de los casos se presenta necrosis focal en el hígado, encontrándose además cuerpos de inclusión intranucleares tipo 'A' de Cowdry de gran valor diagnóstico; estas inclusiones también se pueden encontrar en pulmones y nódulos linfáticos (Gibson y Stater, 1992).

En brotes de aborto que se producen tardíamente en la época de las pariciones, nacen potrillos infectados, débiles, que mueren dentro de las 24 horas, con severos signos respiratorios; algunos nacen sanos para enfermar y morir 2 a 3 días después. Las lesiones macroscópicas más llamativas se ubican en los pulmones que aparecen voluminosos y firmes, observándose alveolitis no supurativa, bronquitis y bronquiolitis necrotizante (Edington y col., 1991).

El síndrome neurológico se puede presentar en animales de cualquier edad apreciándose incoordinación, ataxia o imposibilidad de mantenerse en pie. El mecanismo patogénico del VHE-1 en el sistema nervioso central no es bien comprendido. Este virus no es neurotrópico. Las lesiones primarias afectan al endotelio de los vasos sanguíneos del sistema nervioso central, provocando vasculitis, hemorragias y trombosis; las áreas de necrosis que se observan en cerebro y médula serían secundarias a estas alteraciones vasculares (Whitwell y Blunden, 1992).

El diagnóstico de la RNE es relativamente fácil de realizar: se requiere para ello muestras de exudado nasofaríngeo profundo en la enfermedad respiratoria; muestras de hígado, bazo, pulmón y timo de fetos abortados; muestras de pulmón y timo en animales muertos al nacer; y cerebro, médula ósea y sangre de casos de encefalitis. En los casos que los estudios histopatológicos y virológicos resulten negativos, es recomendable tomar muestras séricas pareadas para establecer un diagnóstico por seroconversión (Berríos, 1984).

 

 Los estudios realizados por los autores han sido financiados por el Depto. Técnico de Investigación de la Universidad de Chile, proyrcto A-147 (1977- 1982) y proyecto 1027-90 FONDECYT (1990- 1992)

Virus de la rinoneumonitis equina

El virus de la RNE está incluido en la familia Herpesviridae que comprende al menos 100 virus distintos, diferenciados en base al tipo de células involucradas en la infección, persistencia en el huésped natural y efecto en los huéspedes relacionados. Los virus herpes se han agrupado en tres subfamilias: la subfamilia Alphaherpesvirinae, donde se ubica el VHE- 1, se caracteriza porque sus miembros tienen un rango variable de huéspedes, son altamente citopáticos, presentan un ciclo replicativo corto y frecuentemente establecen una infección latente. En esta subfamilia se encuentra la mayoría de los virus herpes que afectan a los animales domésticos. En la subfamilia Betaherpesvirinae se incluyen los citomegalovirus del hombre y diferentes especies animales. En la subfamilia Gammaherpesvirinae se encuentran el virus humano Epstein-Barr, el virus de la enfermedad de Marek, el virus herpes bovino tipo 3 causante de la fiebre catarral maligna y el virus herpes saimiri, entre otros.

En la actualidad se acepta que los subtipos 1 (fetal) y 2 (respiratorio) del virus RNE corresponden a dos tipos de virus con características genéticas y biológicas muy diferentes, denominados virus herpes equino tipo 1 (VHE-1) y virus herpes equino tipo 4 (VHE-4) (Tabla 1).

TABLA 1 PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS DEL VIRUS HERPES EQUINO TIPO 1 Y TIPO 4

Características

VHE-1

VHE-4

Denominación anterior

Subtipo 1 fetal (f). Ej. cepas RAC-H, A-183, K y D

Subtipo 2 respiratorio (r). Ej. cepa H45

Estructura antigénica

Homología de secuencia de bases

Menos de un 20% entre ambos subtipos

Mapa genómico por enzimas de restricción

'Fingerprints' del ADN muy diferentes; escasos sitios de cortes y no comunes.

Variabilidad genética

Relativamente baja

Alta

Patogenicidad

Potencial abortigénico

Alto

Bajo

Enfermedad respiratoria

Baja incidencia

Alta incidencia

Mortalidad neonatal

No

Paresia en caballos

No

Neurovirulencia para ratones recién nacidos

No

Adaptabilidad a hamsters

No

Tropismo para células endoteliales

No

Viremia asociada a leucocitos

No

Efectos en cultivos celulares

Rango de huéspedes origen de las células

Amplio (Más de 15 tipos de células)

Restringido a líneas celulares de equino y PK-15

Tamaño de placas

Pequeñas (menos de 1 mm)

Grandes (mayores de 1 mm)

Estructura antigénica

Proteínas estructurales

Diferencias de movilidad electroforética intersubtipos en 8 poli péptidos

Relaciones antigénicas Presencia de determinantes antigénicos únicos y compartidos en cada subtipo, detectados por anticuerpos policlonales y monoclo nales; presentan reacciones antigénicas cruzadas; protección cruzada sólo demostrable después de repetidas infecciones

(Allen y Bryans, 1986)

El VHE-1 posee ácido desoxirribonucleico (ADN) de doble hebra, el que al unirse a proteínas constituye el cuerpo central (core) del virión, el que se rodea por una cápside de simetría icosaédrica o cúbica, compuesta por 162 capsómeros parcialmente perforados, de los cuales 150 son de sección hexagonal y 12 ubicados en los vértices, son pentagonales. El diámetro de la nuclecápside es de 100 a 110 nm. Externamente poseen una envoltura lipoproteica laxa o 'envelope' que le confiere al virión una forma ligeramente redondeada y un tamaño de 120 a 180 nm de diámetro (Figura 1).

Figura 1. Modelo de virus herpes

El ADN del VHE-1 posee un peso molecular de 100 x 106 daltons, una densidad de flotación de 1,716 g/ml y un porcentaje de guanina más citocina de 57%. El genoma viral de un tamaño de 120-220 kbp se compone de un ADN dh de 94 MDa formado por dos segmentos covalentemente unidos, región larga o L de 73 MDa y región corta o S de 21 MDa. La región S contiene dos cadenas idénticas repetidas, de 8 MDa, una interna IRs y otra terminal TRs; entre ellas se ubica una región única corta, Us, de 5 MDa. La otra secuencia única, no repetida, se denomina Ul. (Figura 2). La presencia de Us permite que las regiones L y S se inviertan formando dos isómeros. Solamente el virus herpes simplex (VHS) tiene cuatro isómeros (Studdert, 1989).

Figura 2. Estructura genómica del VHE-1. L = región larga; S = región corta; UI = región única larga; Us = región única corta; IRs, Rs = secuencias repetidas invertidas.

La secuencia genómica completa de nucleótidos de algunos virus herpes de humano ha sido determinada; así el VHS prototipo de los virus herpes comprende 152.260 residuos con 72 'open reading frames', estimándose una capacidad de código de 80 a 100 genes. El genoma del VHS codifica 70 polipéptidos diferentes, 27 de estas proteínas codificadas por Ul no tienen una función conocida. Una proteína, gD, codificada por la región Us es esencial para la replicación del virus herpes en cultivos celulares.

Mediante el uso de enzimas de restricción, clonaje molecular, hibridización y secuenciación de nucleótidos, se han identificado y localizado importantes genes del VHE-1 en la región de secuencia única larga (Sabine y Whalley, 1989), (Figura 3).

Figura 3. Mapa genómico del VHE-1 y localización de genes identificados en la región Ul. Se utilizó la enzima de restricción Bam H-l. El orden y posición de estos genes es muy parecido a los del virus varicela zoster y virus herpes simplex.

El genoma del VHE-4 es semejante al VHE-1. Está formado también por una doble cadena de ADN de 144 kbp compuesto por dos segmentos ligados en forma covalente, la región L de 109 kbp y la región S de 35 kbp (Nicolson y Onions, 1990).

En la cápside de estos virus se encuentra una fosfoproteína denominada VP9 que se repite 800 veces, representando el 65% de la masa de proteínas de esta estructura viral. Rodeando la cápside se encuentra el tegumento que es una estructura amorfa constituida por 6 a 8 proteínas. En la envoltura se ubican las proteínas de mayor importancia biológica para el virus, radicando en ellas la capacidad de adsorción y penetración del virus a la célula, la especificidad de subtipo y la variación antigénica (Allen y Bryans, 1986). El virión tiene 28 proteínas estructurales con pesos moleculares entre 16 y 276 Kd. Ambos virus tienen la capacidad genómica de expresar 6 glicoproteínas mayores conocidas como: Gp2, Gp 10, Gp 13, Gp 14, Gp 17/ 18, y Gp21/22. Además se describen 6 glicoproteínas menores. Tanto las glicoproteínas mayores como las menores se encuentran en la envoltura; algunas de ellas se proyectan hacia el exterior en forma de espículas o proyecciones de superficie.

Antigenicidad del virus de la rinoneumonitis equina

Las glicoproteínas anteriormente descritas corresponden a los principales inmunógenos responsables de la respuesta inmune humoral y celular. El VHE-1 y el VHE-4 poseen un antígeno específico de grupo, ubicado en la nucleocápside, que es fácilmente demostrable por pruebas serológicas de fijación del complemento e inmunodifusión en gel de agar. Laespecificidad de tipo está dada por las glicoproteínas de la envoltura viral (Mitsumara y col., 1992).

Los animales infectados por el VHE-1 respondenproduciendo anticuerpos específicos, detectablespor diferentes pruebas serológicas tales como seroneutralización viral en cultivos celulares, fijación del complemento, inmunodifusión e inmunofluorescencia indirecta, incluso por inhibición de la hemoaglutinación, debido a que estos virus presentan una hemoaglutinina que aglutina eritrocitos de cobayos; sin embargo, esta hemoaglutinina se encuentra en pequeña proporción en el virión, necesitándose aproximadamente 0,65 µg de proteína viral para obtener una unidad hemoaglutinante. También se ha descrito la hemoaglutinación indirecta o pasiva para el estudio seroepidemiológico de la RNE (Berríos y col., 1986).

Los anticuerpos seroneutralizantes específicos contra el VHE-1 alcanzan títulos máximos aproximadamente a las 3 semanas después de la inferción, pudiendo ser detectados durante 4 a 5 me es; enseguida disminuyen paulatinamente hastii desaparecer entre los 6 y 12 meses. Los anticuerpos inhibidores de la hemoaglutinación son detectados entre 7 y 14 días después de la infección, manteniéndose en títulos bajos durante 6 meses hasta que desaparecen totalmente. Cabe señalar que los equinos que presentan títulos altos de anticuerpos seroneutralizantes poseen una baja respuesta medida en anticuerpos inhibidores de la hemoaglutinación.

Los anticuerpos dependientes del complemento alcanzan títulos máximos ya a los 14 días después de la infección y están relacionados directamente con la fase aguda de la enfermedad, siendo los anticuerpos seroneutralizantes los que se detectan en el período de convalescencia. En la respuesta inmune secundaria a una reexposición con el virus,los anticuerpos seroneutralizantes alcanzan títulos cuatro veces mayores que los producidos en la respuesta inmune primaria de la primo infección, mientras que los títulos de anticuerpos fijadores del complemento no varían (McBeath y col., 1983).

Inmunoprofilaxis

La respuesta inmune del caballo contra la infección por el VHE-1 es similar a la de otras especies afectadas por virus herpes, incluyendo la producción de anticuerpos específicos, células inmunes e interferón (McBeath y col., 1983).

En la infección natural por el VHE-1 la inmunidad es de corta duración, la mucosa respiratoria puede ser reinfectada luego de 3 a 4 meses, siendo esta reinfección generalmente asintomática. La inmunidad contra el aborto es variable e incompleta. Se han descrito abortos con un intervalo de 7 a 11 meses aparte. Yeguas inoculadas experimentalmente en el primer mes de gestación y de nuevo 4 a 6 meses después, abortaron luego de la segunda inoculación; incluso yeguas con altos títulos de anticuerpos seroneutralizantes anti VHE-1 puede abortar después de una infección (Howarth, 1971; Ardans, 1982).

Según Bryans (Seminario sobre enfermedades respiratorias virales del equino. 17 de marzo de 1986; Santiago, Chile), la inmunidad protectiva del caballo contra reinfecciones con el VHE-1 y sus consecuencias neuropatológicas y de aborto, es de corta duración, de allí que las modernas estrategias para inmunizar a los caballos contra el VHE-1 están basadas en este concepto. Además, se debe considerar en la preparación de vacunas anti RNE y en la estrategia de su aplicación, que la ruta primaria de infección y de reinfección de los caballos es la vía respiratoria, con la excepción de los animales portadores infectados latentemente. Por lo tanto la prevención de la RNE requiere de vacunas que impidan o limiten significativamente en la mayoría de los animales vacunados, la infección por la vía respiratoria. En la naturaleza esto ocurre a través de múltiples reinfecciones en los potrillos. Por otra parte, estas vacunas deben prepararse de manera tal que sean capaces de estimular una eficiente respuesta inmune contra las glicoproteínas de superficie que son responsables de la infectividad viral.

La adaptación del VHE-1 a Syrian hamsters y cultivos de tejidos tipo de Maitland permitió propagar el virus en cantidades suficientes como para desarrollar vacunas comerciales. Las primeras vacunas, químicamente inactivadas, además de ser poco inmunogénicas provocaban reacciones anafilácticas al contener proteínas del hamster. Casi simultáneamente apareció una vacuna preparada con virus vivo adaptado a hamster, que se usaba por vía intranasal en lo que se llamó 'infección planificada'. Este singular método de inmunización requería que todos los animales en áreas endémicas fueran vacunados, sin excepción, ya que el virus vacunal era transmisible a los no vacunados susceptibles, siendo capaz de producir aborto. Las yeguas eran vacunadas en los primeros meses de gestación, aplicándose la primera dosis en julio y la segunda en noviembre del hemisferio norte (Kentucky, USA); este calendario se apoyaba en la' premisa que la inmunidad conferida en la primera inmunización protegería a la mayoría de las yeguas al ser vacunadas por segunda vez y no se produciría aborto en los críticos meses finales de la gestación. A pesar de obtenerse una disminución de los abortos de 13,4% a 0,88% (Campbell y Studdert, 1983), y especialmente por el hecho de utilizar un virus vivo que no había perdido totalmente su virulencia y los consiguientes problemas de manejo, el método de infección planificada se dejó de usar en 1979 (Allen y Bryans, 1986).

Las vacunas anti RNE han sido generalmente preparadas con virus correspondientes al subtipo 1 o VHE-1 inactivado o virus vivo modificado. Las primeras vacunas inactivadas fueron de baja inmunogenicidad, incluso cuando se preparaban en hamsters producían efectos colaterales indeseables como anemia hemolítica inmune. Para evitar estos problemas se utilizó virus obtenido en cultivos celulares. Una vacuna inactivada, preparada en 1974 por Shimizu y col., inducía una respuesta medida de anticuerpos seroneutralizantes, solamente cuando los caballos habían sido previamente infectados con el VHE-1, proponiéndose por lo tanto el uso de un programa combinado que usaba inicialmente un virus vivo de origen respiratorio y luego la vacuna inactiva. Mayr y col., en 1978, prepararon una vacuna inactivada con beta-propiolactona o acetiletilenimina que producía una buena respuesta en hamsters, la que se mejoraba al incluir en la preparación vacunal un coadyuvante oleoso mineral o hidróxido de aluminio. En equinos, al probar estas vacunas, los anticuerpos seroneutralizantes duraban 6 a 8 meses, mientras que los anticuerpos fijadores del complemento desaparecían rápidamente entre las 6 y 8 semanas. Otra vacuna inactivada, preparada por Bryans en 1978 también producía buenos títulos de anticuerpos neutralizantes en equinos y una adecuada resistencia ante el desafío con una cepa fetal del VHE-1. Los anticuerpos neutralizantes se mantuvieron por más de 21 semanas en yeguas preñadas luego de tres vacunaciones (5º, 7º y 9º meses de gestación) con intervalos de 2 meses. Estudios realizados en terreno con el producto comercial de esta vacuna 'Pneumabort-K' demostraron que el 94% de las yeguas vacunadas mantenían niveles protectivos de anticuerpos neutralizantes con títulos 80 durante 5 a 6 meses del período de gestación; al comparar con los controles se encontró que la incidencia de abortos había bajado en 65% en los vacunados. Otras vacunas inactivadas preparadas con virus purificado en polietilenglicol, inactivadas con formalina e hidróxido de aluminio (Alhydrogel) y coadyuvante-65 inducían una adecuada respuesta protectiva en animales convencionales (Thomson, 1978). Además se constató algo muy importante en relación con la especificidad de los subtipos de este virus, al comprobarse que los anticuerpos eran específicos para la cepa vacunal RAC-H del subtipo 1 reaccionando débilmente con la cepa H-45 del subtipo 2 (Campbell y Studdert, 1983).

Con respecto a las vacunas anti RNE preparadas con virus vivo modificado antes de 1968 solamente se usaba la 'infección planificada' con un virus virulento (Pneumabort) pero adaptado al hamster (50-100 pasajes). En 1968 Mayr y col. desarrollaron una nueva vacuna no patógena para el hamster, potrillos y yeguas gestantes y con una alta capacidad inmunogénica; el producto comercial 'Prevaccinol' fue muy usado en Europa. Recomendándose una primo doble vacunación aplicadas con 12 a 16 semanas de intervalo a todos los caballos mayores de 3 meses y una revacunación anual. Las yeguas preñadas debían ser vacunadas a los 2 a 3 meses de gestación, y luego a los 6 y 7 meses. Sin embargo, Burrows y Goodridge, en 1978, observaron que esta vacuna era potencialmente patógena para el feto equino, al inducir aborto en dos yeguas inoculadas directamente en el útero con dicha vacuna. En 1973 empezó a usarse en USA la primera vacuna anti RNE con licencia llamada 'Rhinomune' preparada con la cepa RAC-H y atenuada en cultivos celulares, recomendándose una primo doble vacunación inicial, aplicada con un intervalo de 4 a 8 semanas, seguida por una revacunación cada 6 meses; indicándose además que los potrillos fuesen vacunados después de los 3 meses de edad para evitar la interferencia de los anticuepos maternos, y que las yeguas preñadas fueran vacunadas después del segundo mes de gestación. De esta vacuna se decía que no provocaba síntomas clínicos ni el virus era diseminado al medio ambiente después de la vacunación; sin embargo, entre 1975 y 1978, varios investigadores cuestionaron la eficacia de esta vacuna para proteger a las yeguas preñadas contra el aborto, más aún, Burrows y Goodridge demostraron que esta vacuna era capaz de provocar aborto en yeguas preñadas al aplicarla directamente por vía intra uterina, considerando por lo tanto que el virus era potencialmente patógeno para el feto equino. En septiembre de 1977 al laboratorio productor de la vacuna Rhinomune se le pidió que corrigiera sus recomendaciones en cuanto se refiriera al uso de la vacuna para prevenir el aborto. Una segunda vacuna atenuada en cultivos celulares VERO fue desarrollada en USA por Purdy y col., en 1977, quienes, al aplicarla por vía intramuscular con un intervalo de 3 a 4 semanas, demostraron su inmunogenicidad y su capacidad para proteger a las yeguas gestantes contra el desafío con virus virulento. La vacuna denominada 'Rhinoquin' fue retirada del comercio en julio de 1977 debido a las reacciones adversas que provocaba en los animales vacunados, tales como paresia del tren posterior. Se estimó que alrededor de 60.000 dosis de la vacuna fueron aplicadas, constatándose unos 480 casos de enfermedad neurológica postvacunal que variaba entre una paresia suave del tren posterior hasta una parálisis total (Campbell y Studdert, 1983).

Con respecto a los títulos de anticuerpos seroneutralizantes considerados como protectivos, Bryans indica un valor de 100, aunque otros investigadores encuentran que yeguas preñadas con títulos mayores de 64 resistían el desafío a los 7 a 11 meses de la gestación sin abortar. Considerando que la inmunidad humoral es transitoria, algunos investigadores han sugerido que es necesario una aplicación vacuna¡ cada 3 ó 4 meses para mantener títulos de anticuerpos específicos que aseguran una adecuada protección en potrillos de 1 año y animales adultos, recomendando vacunar a las yeguas no preñadas una vez antes del período de montas o después del parto; revacunar las hembras preñadas a los 2 a 3 meses de gestación, y administrar una tercera vacunación a los 7 a 8 meses de gestación. Estos autores recomiendan además revacunar cada 3 a 4 meses a los animales recién destetados y a los potrillos de 1 año. En USA se ha enfatizado en la inmunización de las yeguas antes o durante la preñez, debido a que existen antecedentes sobre el uso de las vacunas contra la RNE en el sentido de reducir las pérdidas debidas a aborto o muerte neonatal; sin embargo, estas vacunas, inactivadas o modificadas, no siempre confieren una adecuada protección y el VHE- 1 se mantendría como un agente responsable de graves pérdidas económicas por muertes fetales o neonatales; incluso se sospecha que el uso de estas vacunas preparadas con cepas de origen fetal sería responsable de la diseminación de cepas abortigénicas (Paweska y col., 1991) . Los problemas antes planteados han abierto la posibilidad del uso de vacunas subunitarias preparadas con virus purificados, ya sean componentes de la nucleocápside o partes de la envoltura, a través de ultracentrifugación en gradientes o en electroforesis en geles; así, en ensayos preliminares se ha determinado que los elementos inmunogénicos del VHE1 son glicoproteínas de la envoltura viral (Guo y col., 1989; Guo y col., 1990). La aplicación de estas fracciones en vacunas subunitarias podría ser una buena alternativa en vez de las vacunas convencionales (Campbell y Studdert, 1983). Recientemente, se ha preparado una vacuna recombinante, utilizando virus vaccinia y la principal proteína de la envoltura del VHE-1 (gB). Otra proteína posible de usar en este tipo de vacunas es la gH glicoproteína menor, la que en el virus herpes simplex es fuertemente neutralizada por anticuerpos monoclonales inhibiendo la infecciosidad viral (Sabine y Whalley, 1989).

Rinoneumonitis equina en Chile

'En la década del 60, la rinoneumonitis equina fue una epizootia que produjo grandes estragos en muchos criaderos, a tal punto que en algunos con pocas yeguas no conservaron ninguna cría. La gran mayoría de los criadores sufrió el problema silenciosamente y otros se defendieron trayendo vacunas de Estados Unidos de Norteamérica y aplicando las medidas profilácticas entregadas por Circular de la Sociedad de Criadores a sus asociados. Finalmente llegó la importación que directamente hizo la Sociedad de Criadores, pero también tuvo un atraso por los controles que aquí en Chile hace el Servicio Nacional de Salud'. En estos términos se refiere el Dr. Rodolfo Retamales N. a la RNE y sus problemas en Chile en los inicios de la presentación de esta enfermedad en el país (Retamales, 1989).

Haciendo un poco de historia, el 1º de octubre de 1969 se recibe, en el incipiente laboratorio de Virología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Ciencias Pecuarias de la Universidad de Chile, una muestra de pulmón de feto equino abortado, rotulada como AE-1-69 según consta en protocolo, que se inoculó, preparada al 25%, en cuatro hamster lactantes de 3 a 4 días de edad, en cantidad de 0,1 ml por vía intraperitoneal. Un hamster fue sacrificado 'in extremis' en el día 7º post inoculación, encontrándose los típicos cuerpos de inclusión intranucleares eosinófilos en células hepáticas, típicas del agente causal de la RNE. La muestra AE-1-69 provenía de un predio agrícola de riego 'en el que se explotan ovinos, vacunos y equinos'. La explotación equina va más allá de 100 animales de Fina Sangre. A fines de julio y hasta noviembre (1969) se habían presentado siete casos de aborto con edades fetales de 7 a 10 meses, y ocho casos de muerte de potrillos entre las 12 y 48 horas del nacimiento, llamando la atención que cumplieran en su totalidad un período de gestación entre 320 y 330 días. Las hembras que abortaron tuvieron temperatura normal y se recuperaron normalmente en el postpartum en un total de 59 yeguas preñadas. Una sola yegua preñada fue tratada con suero sanguíneo (60 ml vía intramuscular) proveniente de hembras que habían abortado, teniendo este animal un parto normal 2 días después del tratamiento. Cabe señalar que la muestra fue enviada por el Dr. Rodolfo Retamales N. En carta fechada el 28 de noviembre de 1969, el Dr W. H. McCollum de la Universidad de Kentucky opina que la enfermedad en cuestión corresponde a 'fetal rhinopneumonitis' (Retamales, 1989).

En la 1ª Reunión Reunión Científica Interna de la Escuela de Medicina Veterinaria de la Universidad de Chile, realizada entre el 27 y 29 de noviembre de 1969, Pinochet y col. presentaron un trabajo sobre la rinoneumonitis o aborto viral equino referente al primer caso comprobado en el país, relatando que en fetos abortados, mortinatos y animales recién nacidos muertos, provenientes de un haras de la provincia de Linares, por las características epizootiológicas y lesiones macroscópicas, se sospecha de rinoneumonitis o aborto viral equino, encontrándose lesiones celulares en forma de cuerpos de inclusión intranucleares eosinófilas en hepatocitos y células epiteliales bronquiales. Al inocular extractos de tejidos fetales en hamsters y huevos embrionados (membrana corioalatoidea) se reproducen las lesiones intranucleares específicas de la enfermedad, resultando los controles negativos. Los autores plantean continuar trabajando con animales de laboratorio hasta poder realizar pruebas serológicas que permitan tipificar sin lugar a dudas el virus de la RNE (Pinochet y col., 1969).

A fines de noviembre de 1972, Agrícola Matancilla Ltda. pidió autorización para importar la vacuna del Laboratorio Norden de USA, petición que fue rechazada por ser la vacuna a virus vivo (modificado), (Retamales, 1989).

Ante la gravedad de la situación causada por esta epizootia de abortos o tormenta de abortos, el Directorio de la Sociedad de Criadores de Caballos F. S. de Carrera y Tattersal S.A., realizó la primera importación directa de una vacuna contra la RNE preparada con virus vivo atenuado. En carta dirigida a los criadores inscritos, con fecha 6 de diciembre de 1974, se entregaron las siguientes normas sobre el manejo y uso de la vacuna (Laboratorio Norden): La vacuna debe ser mantenida en refrigeración y sacar solamente las dosis que se van a usar; en un haras se debe, en primer lugar, separar el grupo de yeguas presumiblemente preñadas, es decir aquellas con más de 2 meses de rechazo; aplicar la primera dosis a toda yegua con más de dos meses de rechazo. Este grupo quedará en potrero aparte; la segunda dosis se aplicará 4 a 8 semanas después de la primera, en ningún caso después del séptimo mes de preñez; posteriormente se irán vacunando los productos al pie de la madre que hayan cumplido 3 meses de edad, para luego aplicarles una segunda dosis entre el 4º y 6º mes de vida, es decir antes del destete; igual procedimiento se deberá seguir con los potros, potrillos de 1 año y todos los caballares de trabajo del haras; las yeguas que queden secas en un haras después del período de montas seguirán en potrero aparte, y recibirán también dos dosis de la vacuna, con un intervalo de 4 a 8 semanas; las yeguas que ingresen al haras para ser servidas deberán quedar totalmente aisladas en un potrero aparte, hasta que cumplan su período de vacunación; las yeguas que abortaran o murieran sus crias dentro de las 48 horas después de nacer, deberán ser totalmente aisladas y practicar en ellas un aseo (lavado) riguroso de su grupa, piernas, cola y región vulvar, cascos, etc., con una solución de carbonato de sodio al 5 ó 10%, además de vacunarlas, al igual que las otras yeguas, con las dos dosis correspondientes. Finalmente el Dr. Retamales reiteró a los señores criadores el compromiso suscrito referente a que la vacuna deberá ser aplicada bajo la responsabilidad de un médico veterinario, profesional que deberá evacuar un informe completo sobre sus resultados (Retamales, 1989).

A fines de 1974 se realizó una experiencia con esta vacuna, cuyo permiso para su importación tenía el carácter de experimental, en el Haras Matancilla, lugar donde se había corroborado el diagnóstico de la RNE tras la autopsia practicada por los médicos veterinarios Dres. Ulises Guajardo, Lautaro Pinochet y Rodolfo Retamales, en el Instituto de Investigaciones Veterinarias del Ministerio de Agricultura, a un potrillo muerto a las 24 horas de nacido (Retamales, 1989). La experiencia se llevó a cabo en la siguiente forma: 1º se tomó una primera muestra de sangre al total de las yeguas, el día 20 de diciembre de 1974. 2º el mismo día se vacunaron todas las yeguas con más de 2 meses de rechazo. También se vacunaron los potros. 3º el 4 de enero de 1975 se tomó la segunda muestra de sangre. El estudio se realizó en el laboratorio de virología del Servicio Agrícola y Ganadero a cargo de la Dra. Adriana Casanova. 4º en distintas fechas se repitió la segunda vacunación, tomándose muestras 15 a 20 días después. Durante este período de vacunación no se presentaron abortos y hubo dos a fines de temporada, así como también cuatro potrillos muertos 24 a 48 horas de nacer; todas las yeguas con fecha normal de parto. Concluye el Dr. Retamales que de acuerdo a los resultados obtenidos (Tabla 2) durante 10 años de trabajo en el Haras, con un número de 72 a 75 yeguas madres, es posible controlar la RNE con un buen manejo y la adopción estricta de ciertas medidas preventivas, más la vacunación, evitando las grandes pérdidas que ocasiona tanto al criador de caballos como a la economía del país (Retamales, 1989).

TABLA 2 CONTROL DE LA RINONEUMONITIS EN EL HARAS MATANCILLA

-

1965

1966

1967

1968

1969

1970

1971

1972

1973

1974

1975

Yeguas servidas

72

63

66

85

82

88

88

84

78

74

75

Yeguas preñadas paraparir año siguiente

44

44

44

57

59

61

49

49

45

43

55

Abortos temporada

-

-

-

-

1

5

2

5

-

2

2

Abortos mellizos

-

-

-

2

3

1

4

1

2

-

1

Muertes después de nacer (12-36 hrs.)

-

-

-

1

6

9

13

5

10

7

4

Crías vivas temporada

-

44

44

42

47

44

42

38

37

36

36

Abortos temporada

-

-

-

3

10

15

19

11

12

9

7

(Retamales, 1989)

En Chile se empezó a estudiar la RNE, cuando Planas (1974) ensayó la prueba de fijación del complemento (100% de hemolisis) en un estudio prospectivo de la RNE en caballos Fina Sangre de Carrera, realizado entre los meses de febrero y junio de ese año, en el Policlínico de Animales Mayores de la Escuela de Medicina Veterinaria de Santiago y en el Laboratorio de Virología del Dpto. Laboratorios de la División de Salud Animal del SAG: Para ello se tomaron 104 muestras de sangre de equinos F.S. de Carrera del Club Hípico de Santiago, Hipódromo Chile y de 5 haras. Se consideró como muestras positivas aquellas con títulos 8 o mayores; los títulos 2 y,4 indicarían una infección de más de 4 meses. En este trabajo se encontró un 55% de positivos, y se observó que las hembras presentaban títulos levemente superiores a los machos, aunque en el único caso en que hay una diferencia clara es en el título 16, en que los machos presentaron 29% de positivos y las hembras un 10%; en los demás casos las diferencias no son significativas; tampoco se observó diferencias significativas entre muestras provenientes de hipódromos y haras probablemente debido a que se consideraron animales jóvenes que van del hipódromo al haras y viceversa. Con respecto a las muestras tomadas en verano y principios de otoño se observó que los títulos encontrados eran mayores que los obtenidos en muestras tomadas a fines de otoño (Planas, 1974).

En el mismo año, Casanova y Bass (1974) describen el aislamiento del virus de la RNE desde hígado y pulmones de fetos abortados entre el 6º a 11º mes de preñez, con las siguientes lesiones: edema pulmonar, aumento del líquido pleural, focos necróticos en el hígado, coloración ictérica de los rodetes coronarios y de las mucosas. Las muestras fueron inoculadas en hamster lactante y membrana corioalantoídea de huevos embrionados de gallina. En estudios histopatológicos se encontraron cuerpos de inclusión acidófilos intranucleares en el hígado y pulmón de 6 de las 8 muestras estudiadas. Estas muestras resultan positivas al aislamiento vi ral en hamster lactante, lo que se demuestra por la presencia de cuerpos de inclusión característicos en el hígado de los animales inoculados y por el aumento de la patogenicidad viral para el hamster en pasajes seriados, observándose que en el primer pasaje la mortalidad era de un 4,5%, aumentando hasta alcanzar un 86,2% en el 4º pasaje hasta estabilizarse entre un 90 y 95% en los pasajes sucesivos. Los hamster lactantes inoculados presentan pocas lesiones macroscópicas; la mayoría presenta enteritis hemorrágica en el intestino delgado; la cavidad abdominal presenta frecuentemente líquido turbio en pequeña cantidad. El hígado es el órgano más afectado, presentándose generalmente pálido y en algunos casos con hemorragias y focos necróticos; histológicamente las células hepáticas están severamente afectadas, presentando entre un 50 y 80% necrosis y cuerpos de inclusión acidófilos intranucleares. Posteriormente se logra adaptar el virus a embrión de pollo mediante pasajes alternados entre hamster lactante y membrana corioalantoídea. A partir del 6º pasaje las membranas presentan edema y leve opacidad; al estudio histológico estas membranas muestran alteraciones citoplasmáticas y cambios necrotizantes en las células del ectoderma y en algunas áreas del mesoderma. Ciertas células presentan cuerpos de inclusión intranucleares. La patogenicidad para el embrión de pollo aumenta con los pasajes seriados, produciéndose muertes embrionarias desde el 15º pasaje (Casanova y Bass, 1974)

Riveros, en 1976, al estudiar la etiología viral y aspectos clínicos de cuadros respiratorios en equinos Fina Sangre de Carrera en Chile, aisló el virus de la RNE en un 10% de las muestras obtenidas en equinos enfermos y en un 50% de las muestras de fetos abortados entre el 7º y 11º mes de gestación. En este estudio se analizaron 50 muestras de secreción nasal y ocular de equinos que clínicamente presentaban problemas respiratorios, provenientes del Hipódromo Chile y de tres haras de la Zona Central del país; sus edades fluctuaban entre 3 meses y 7 años. Aproximadamente 500 animales fueron examinados clínicamente de un total de 1.900 equinos F.S. de Carrera. Las muestras fueron inoculadas en cultivos celulares de corteza renal de fetos equinos. En los equinos con sintomalogía respiratoria se observó tos, congestión de la mucosa nasal, secreción nasal bilateral de característica mucosa a mucopurulenta; disnea inspiratoria y expiratoria, soplo tubario y murmullo vesicular aumentados en intensidad; en la mayoría de los casos se comprobó anorexia y ganglios retromaxilares inflamados. Aborto se presentó en dos animales. La distribución por edades de los animales enfermos indica que en el 74% de los casos las edades fluctuaron entre 3 y 24 meses, y de este grupo el 52% correspondía a animales de 12 a 24 meses de edad; en el 26% restante las edades fueron mayores de 3 años. Con respecto a la temperatura corporal el 62% de los animales con sintomatología respiratoria presentó temperaturas entre 38 y 38,9ºC y en el 10% entre 39 y 39,9ºC; solamente en el 4% se observaron temperaturas mayores de 40ºC (Riveros y col., 1978).

De las 50 muestras inoculadas en cultivos celulares, sólo cinco produjeron un efecto citopático específico, semejante al causado por virus herpes, caracterizado por la presencia de focos de destrucción celular rodeados de células aumentadas de tamaño, redondas, globosas y refringentes; luego de 4 a 6 días los focos citopáticos de lisis abarcaron toda la monocapa celular. En los cultivos celulares con efecto citopático se observaron cuerpos de inclusión eosinófilos intranucleares tipo 'A' de Cowdry. Mediante la técnica de seroneutralización, índice neutralizante, realizado en cultivos celulares se obtuvieron índices de neutralización viral de 3,0 al enfrentar los aislados virales con un suero de referencia específico, proporcionado gentilmente por A. Casanova (Laboratorio de Virología, SAG), tipificándose los aislados virales como virus herpes equino tipo 1 (VHE-1) agente etiológico de la rinoneumonitis equina o aborto viral equino (Riveros y col., 1978).

Durante la epizootia de aborto equino, existente en la Zona Central de Chile en 1976, se estudiaron 18 fetos equinos abortados entre el 7º y 11º mes de gestación; las muestras de hígado y pulmones fetales fueron inoculadas en cultivos celulares de corteza renal de feto equino y bovino, detectándose 9 aislados virales que producían un efecto citopático caracterizado por células aumentadas de tamaño y refringentes, además de placas circulares con bordes irregulares de un diámetro de 1 a 2 mm. En algunas células se observaron cuerpos de inclusión intranucleares tipo 'A' de Cowdry. Todos los aislados virales fueron sensibles al tratamiento con solventes de lípidos, pH 3,0 y temperatura de 56°C por 30 minutos. El estudio serológico realizado por seroneutralización en cultivos celulares y fijación del complemento permitió tipificar los 9 aislados virales como virus herpes equino tipo 1 (VHE-1) (Berríos y col., 1979).

Durante el brote antes señalado se realizó un estudio serológico, utilizando la prueba de seroneutralización viral en cultivos celulares de riñón fetal equino, en una muestra de 183 sueros de hembras adultas, provenientes de 10 haras dedicados a la crianza de equinos Fina Sangre de Carrera, de los cuales 157 provenían del Area Metropolitana, 11 de la VII Región y 15 de la IX Región. En dos de estos haras existían antecedentes fidedignos de aborto herpético; en cinco haras se había vacunado contra la RNE (Vacuna Rhinomune, Norden) (Manzur, 1978).

El 99,45% de los sueros estudiados (182/183) presentaron anticuerpos seroneutralizantes específicos contra el VHE-1, con títulos entre 2 y 64 y una media geométrica (MG) de 13,3. En la Tabla 3 se aprecia que los 93 equinos vacunados, provenientes de haras sin antecedentes de aborto, presentaron títulos entre 8 y 64 con una MG de 17,0; en los 40 equinos no vacunados, provenientes de haras con antecedentes de aborto, se detectaron anticuerpos con títulos entre 8 y 32 y una MG de 16,3. En cuanto a los 50 equinos no vacunados y sin antecedentes de aborto, se detectaron títulos entre 4 y 16 y una MG de 7,06.Mediante análisis de varianza de los resultados se demostró la existencia de diferencias significativas entre los grupos (p < 0,01). La prueba de comparaciones múltiples de Schefee reveló diferencias significativas entre los grupos de vacunados y no vacunados (con y sin abortos) (p < 0,01); entre el grupo de vacunados sin aborto y el grupo de no vacunados sin aborto (p < 0,01). No se encontró diferencias significativas entre el grupo de vacunados sin aborto y el grupo de no vacunados con aborto (p > 0,01). El alto porcentaje de sueros positivos obtenidos en este estudio se explicaría porque las muestras séricas fueron tomadas en un lapso no mayor de 12 meses después de ocurrido un brote epizoótico de aborto viral y de haberse autorizado la vacunación contra la RNE en Chile. Las variaciones entre los títulos de anticuerpos seroneutralizantes específicos contra el VHE-1 se deberían a los antecedentes de vacunación y aborto existentes en los haras estudiados. Según Mayr la respuesta inmune humoral en RNE frente a una infección natural o ante un estímulo vacunal son semejantes en cuanto a niveles de títulos de anticuerpos alcanzados; por otra parte,los títulos encontrados en los equinos del grupo no vacunados y sin antecedentes de aborto se deberían a la respuesta contra la infección respiratoria del VHE-1, en este caso la inmunidad es de corta duración y los niveles de anticuerpos aumentan en cada reinfección, para luego disminuir a niveles mínimos detectables. Finalmente hay que consignar que los resultados obtenidos en este trabajo no permiten inferir el grado de inmunidad protectiva de los animales, que estaría dada por factores más complejos que involucran no solamente anticuerpos seroneutralizantes, sino que anticuerpos locales clase IgA secretoria, interferones e inmunidad celular, como un todo complejo e interactuante (Manzur y col., 1980).

TABLA 3 PROMEDIO DE TÍTULOS DE ANTICUERPOS SERONEUTRALIZANTES POR HARAS SEGÚN ANTECEDENTES DE VACUNACIÓN Y ABORTO

Antecedentes de vacunación y aborto

Haras

Promedio de título

Vacunados sin aborto (MG = 17,0)

I

29,30

II

18,50

III

20,00

IV

16,00

V

11,30

No vacunados con aborto (MG = 16,3)

VI

23,70

VII

12,40

No vacunados sin aborto (MG = 7,06)

VIII

8,22

IX

8,00

X

5,00

MG = Media geométrica

(Manzur y col., 1980)

En 1978 se preparó una gamaglobulina homóloga, específica anti VHE-1 para ser utilizada en casos clínicos cuya naturaleza impidiera utilizar vacunas preparadas con virus vivo modificado, como es el caso de las hembras en estado avanzado de gestación. El trabajo se realizó en el Laboratorio de Virología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Chile y en el Laboratorio de Inmunobioquímica de la Facultad de Matemáticas y Ciencias Naturales de la Universidad de Chile de Valparaíso. Para ello se inoculó un equino macho de aproximadamente 10 años de edad y un peso calculado de 300 kg con VHE-1 (Cepa FAE- 13-76). La primera aplicación fue realizada por vía intra nasal con 2,0 ml de una suspensión viral con título 105,1 DICT50/ml; posteriormente se realizaron nueve inoculaciones por vía intraperitoneal, cada 15 ó 30 días. Para la separación de la gamaglobulina anti VHE-1 se utilizaron dos métodos de fraccionamiento: etanólico y DEAE Sephadex  A-50 y la pureza de las proteínas se determinó por eletrofo resis en acetato de celulosa, obteniéndose valores entre 70 y 80%. Por Biuret se obtuvieron valores entre 65 y 84 mg/ml. Los títulos máximos de anticuerpos seroneutralizantes específicos anti VHE-1 fueron de 64 y 128 (Gálvez, 1979).

En 1980 Aedo estudia la respuesta inmune en conejos inoculados con VHE-1 mediante la técnica de hemoaglutinación pasiva o indirecta; como antígeno viral se usó el VHE-1 (Cepa FAE-13-76), inoculándose el virus por vía intramuscular, subcutánea y endovenosa, usando coadyuvante completo (Perrigen-C) y coadyuvante incompleto de Freund. Los niveles de anticuerpos anti VHE-1 se midieron en una muestra de 52 sueros de conejos inoculados con el virus, a través de las pruebas de dilución punto final seroneutralizante (DPFS), índice neutralizante (IN), fijación del complemento (FC), inmunodifusión en gel de agar (ID) y hemoaglutinación indirecta o pasiva (HAIP), determinándose además la sensibilidad de estas técnicas serológicas. DPFS es la técnica que detecta títulos más altos; la prueba de IN tiene un comportamiento similar con DPFS, encontrándose entre estas pruebas un coeficiente de correlación (r) de + 0,53 (p < 0,01). Al comparar los resultados obtenidos con HAIP y DPFS, se observó que HAIP no es lo suficientemente sensible para detectar anticuerpos en sueros de bajos títulos, aunque fue similar a DPFS cuando los títulos de anticuerpos eran altos; el r entre estas pruebas serológicas fue + 0,48 (p < 0,01). La prueba de FC detectó anticuerpos desde el día 7º postinoculación, y aunque presentó la mayor positividad, sus títulos fueron inferiores a los entregados por DPFS, con la cual presentó un r de + 0,48 (p < 0,01). La inmunodifusión presentó una baja sensibilidad, siendo positivos a esta prueba solamente los sueros obtenidos en la fase final de la experiencia cuando los títulos de anticuerpos específicos son más altos; no se encontró un r significativo al relacionar los resultados de esta prueba con los obtenidos por DPFS. Se concluye que el procedimiento DPFS es la prueba serológica más adecuada para cuantificar la respuesta sérica anti VHE-1. En cuando a la prueba de hemoaglutinación pasiva o indirecta al presentar una sensibilidad semejante a las otras pruebas estudiadas, podría ser aplicada al diagnóstico y estudio seroepidemiológico de la rinoneumonitis equina (Berríos y col., 1985a).

Posteriormente Riquelme (1984) determina el comportamiento de la prueba de hemoaglutinación pasiva al medir títulos de anticuerpos anti VHE-1 en equinos, comparando los resultados obtenidos en la prueba de seroneutralización DPFS. La correlación entre estas pruebas serológicas se determinó en 341 sueros equinos considerando como prueba patrón a DPFS; se compararon los resultados obtenidos al medir títulos anti VHE-1 en 228 sueros equinos con títulos mayores o iguales a 2, y en 113 sueros negativos con títulos menores a 2.

La prueba de hemoaglutinación pasiva presentó una sensibilidad de 93,4% y una especificidad de 97,3%. Los resultados de diagnóstico positivo y negativo en ambas pruebas fueron concordantes en 323 sueros (94,7%); tres sueros negativos en DPFS cambiaron a positivos en HAP, encontrándose un valor significativo de x2 = 6,72 (p < 0,05) en la prueba de McNemar, lo que estaría indicando una tendencia al cambio de diagnóstico. Entre ambas pruebas se determinó un coeficiente de correlación r = 0,61 (p < 0,01). Por otra parte las diferencias entre los títulos seroneutralizantes y hemoaglutinantes pasivos no fueron significativas obteniéndose un valor -z = 1,131 (p > 0,05) en la prueba de Wilcoxon. De acuerdo con estos resultados se concluye que la prueba de hemoaglutinación pasiva o indirecta se comporta en forma semejante a la prueba de seroneutralización DPFS, recomendándose por lo tanto su aplicación al estudio y diagnóstico de la RNE, lo que es favorecido por sus ventajas adicionales de economía, rapidez y facilidad en su ejecución (Berríos y col., 1986).

En Chile el uso de la técnica de anticuerpos fluorescentes en el estudio y diagnóstico de enfermedades virales ha estado circunscrito a rabia, peste porcina clásica, rinotraqueítis infecciosa bovina, diarrea viral bovina y micoplasmosis equina (Scheidegger y Berríos, 1982). En 1982, Cortés determinó la especificidad de la técnica de anticuerpos fluorescentes, método directo, en el estudio y diagnóstico del VHE-1. El suero anti VHE-1, obtenido en conejos inoculados con la cepa FAE-13-76, conjugado con isotiocianato de fluoresceína presentó un título 8; al aplicar esta dilución en cultivos celulares de RFE (Gaggero, 1984) se observó una intensa fluorescencia de color amarillo verdoso en el citoplasma de las células adyacentes a los focos de efecto citopático en cultivos celulares de riñón fetal equino, destacándose el núcleo con un halo nítido de fluorescencia en la membrana nuclear, mientras que en las células controles, no inoculadas, emitían una leve fluorescencia opaca y homogénea. Las membranas corioalantoideas inoculadas con el VHE-1 y tratadas con el antisuero conjugado presentaron una nítida e intensa fluorescencia de color amarillo verdoso en las áreas con lesiones tipo 'pock', lo que no se apreció en las membranas no inoculadas. En hígado, pulmón y bazo de un feto equino abortado se observó fluorescencia positiva y específica, ratificada por el examen histopatológico. Considerando los resultados anteriormente presentados se concluye que la técnica de anticuerpos fluorescentes en su método directo se comporta en forma específica para el VHE-1, recomendándose su aplicación en estudios de patogenicidad de este virus y en el diagnóstico de la RNE, lo que ha sido ratificado recientemente por Gunn (1991).

Con el fin de adaptar el VHE-1 a cobayos (Cavia porcellis), se inocularon cobayos lactantes de 1 a 3 días de edad con la cepa FAE-13-76 de título 105,4 DICT50/ml en cultivos de riñón fetal equino (RFE), realizándose nueve pasajes sucesivos; se inocularon cuatro cobayos por pasaje, dejando dos como controles. En el 1er pasaje se usó la vía intraperitoneal; desde el 2º al 7º pasajes se inoculó una suspensión constituida por partes iguales de sobrenadante de cultivos celulares de RFE inoculados con el VHE-1 y una suspensión al 50% de hígados de cobayos obtenidos en el pasaje anterior; en los pasajes 8º y 9º se inoculó solamente una suspensión hepática obtenida en el pasaje anterior. Durante todos los pasajes los cobayos fueron observados durante 7 días; una vez sacrificados se tomaron muestras de hígado para realizar estudios histológicos y de inmunofluorescencia. Este órgano se observaba pálido, aumentado de volumen y con algunas áreas blanquecinas bien delimitadas. En células hepáticas obtenidas en los diferentes pasajes, a excepción del 1º, se detectaron cuerpos de inclusión intranucleares eosinófilos, tipo 'A' de Cowdry, cuyo número al igual que la cantidad de células hepáticas aumentaba en cada pasaje. En todas las muestras hepáticas se observaron algunos focos de necrosis, incluso en el 5º y 8º pasaje una gran infiltración linfocitaria. El examen realizado por inmunofluorescencia fue positivo en muestras de hígado de los pasajes 3º, 4º, 6º, 7º, 8º y 9º; observándose una intensa fluorescencia amarillo verdosa en grupos de células, especialmente en citoplasma.

En los cultivos celulares de RFE inoculados con muestras de hígado de cobayos, provenientes de los pasajes 7º, 8º y 9º, se observó focos de ECP semejante a los causados por virus herpes y cuerpos de inclusión intranucleares eosinófilos. El virus aislado fue tipificado por seroneutralización como VHE-1. De acuerdo con los resultados expuestos, se concluyó que la prueba de anticuerpos fluorescentes, realizada con el suero hiperinmune anti VHE-1 cepa FAE-13-76 y conjugado con isotiocianato de fluoresceína, es específica y por lo tanto factible de ser usada en el estudio de este virus y en el diagnóstico de la RNE (Cortés, 1982).

Con respecto a otros aislamientos del VHE-1 en Chile, cabe destacar dos casos: uno ocurrido en 1984, cuando se aisló una cepa de este virus desde muestras de órganos, hígado y pulmón, de un feto abortado horas después que la madre había ingresado al país, vía área, proveniente del estado de Kentucky y previamente vacunada contra la RNE, lo que demostraría una de las posibilidades del ingreso de este virus al país (Berríos, 1984). El otro caso se refiere al aislamiento del VHE-1 en la IX Región, desde muestras de hígado y pulmón fetal, de casos de aborto ocurridos en un predio ubicado en la localidad de Victoria, que tenía un total de 173 hembras preñadas a principio de temporada y que no estaban vacunadas contra la RNE. En dicho predio se presentaron 87 abortos, 79 de ellos entre mayo y septiembre de 1982, y 8 entre octubre y diciembre del mismo año. La edad de los 24 fetos encontrados en el terreno era de 5 a 11 meses. El VHE-1 fue aislado en cultivos de una línea celular de RFE (Gaggero 1984), produciendo el típico ECP, sincicios y cuerpos de inclusión intranucleares; el virus fue identificado como VHE-1 mediante la prueba de seroneutralización en cultivos celulares, utilizando un suero de referencia específico. El diagnóstico se confirmó con la prueba de inmunofluorescencia directa aplicada en impresiones de las muestras originales; el virus aislado se denominó VHE-1 cepa Victoria Chile, 1982 (Berríos y col., 1985b). Aproximadamente 2 ó 3 meses después del brote de aborto se estudiaron 40 muestras séricas de hembras que habían abortado, detectando por seroneutralización 17 animales (42,5%) positivos al VHE-1 con títulos de anticuerpos entre 8 y 16, hallazgo confirmado con la prueba de hemoaglutinación pasiva que puso en evidencia títulos de anticuerpos específicos entre 4 y 8. Este hallazgo constituyó el primer aislamiento del VHE-1 descrito en la zona sur de Chile, confirmando su diseminación desde la zona central (Berríos y col., 1986b).

Durante el invierno de 1982 se examinaron 305 muestras séricas de equinos fina sangre del Hipódromo Chile, provenientes de 50 equinos con cuadros respiratorios en que se sospechó de una etiología viral, tomándose una muestra al inicio de la afección respiratoria y la otra 15 días después; el resto de los sueros se obtuvo de 205 equinos elegidos por muestreo aleatorio simple. Con respecto al VHE-1 no se detectaron sueros con títulos de anticuerpos > 2 considerados como positivos; en las muestras pareadas no hubo seroconversión. Lo mismo ocurrió con el virus parainfluenza tipo 3. En relación al virus influenza equino sólo un 4,8% de los animales presentó títulos 32 pese a que todos habían sido vacunados 6 meses antes del muestreo: además no se observó seroconversión, lo cual indicaría que los virus en estudio no fueron la causa de las afecciones respiratorias en los animales estudiados (Smith y col., 1986).

En base al conocimiento de la existencia de subtipos del VHE-1, de variaciones antigénicas en diferentes aislados de este virus y de relaciones antigénicas entre el VHE-1 y VHB-1, se realizó un estudio para conocer las relaciones antigénicas existentes entre cepas chilenas y de referencia de estos virus a través de la cinética de neutralización resultante de la reacción de cada cepa viral con su suero homólogo y sueros heterólogos. Para ello se utilizaron las cepas RAC-H (de referencia), FAE13-76, Tarapacá-81 del VHE-1, y las cepas Los Angeles, Puente Alto, 1977, Frutillar, 1982 y VMLB, 1979 del VHB-1. El método usado consistió en enfrentar 100 DICT 50 de cada cepa viral con una cantidad fija de suero homólogo y de cada uno de los heterólogos, los cuales contenían una concentración de anticuerpos equivalentes al doble de la necesaria para neutralizar 100 DICT del virus en 60 minutos (Celedón, 1987). En lo concerniente al VHE-1 se demostró que existen diferencias antigénicas entre las cepas chilenas con respecto a la cepa estándar prototipo RAC-H, todas ellas provenientes de órganos de fetos abortados; también se encontraron diferencias antigénicas menores entre las cepas FAE-13-76 y Tarapacá 81. Es importante destacar que las cepas chilenas del VHE-1 fueron neutralizadas por sueros anti VHB-1, considerándolas como antigénicamente similares (p > 0,05) lo que abre una gran interrogante sobre su origen (Celedón y col., 1992). Llama la atención que cepas del VHE-1 han sido aisladas de fetos bovinos. Según Chowdhurry (1987) el VHE-1, VHB-1 (Rinotraqueítis infecciosa bovina) y el VHP-1 (Seudorrabia o enfermedad de Aujeszky) presentan regiones genómicas altamente conservadas lo que indica que serían originadas de un ancestro común.

En Chile al menos en una ocasión, se aisló el VHE-1 desde casos respiratorios (Riveros y col., 1978), lo que implica la posibilidad que el subtipo 2 o tipo 4 (VHE-4) se encuentre en nuestro medio; podríamos asumir que las cepas FAE-13-76 y Tarapacá-8 1, a pesar de haber sido aisladas de casos de aborto equino, pertenezcan al subtipo 2 o VHE-4 dada la gran diferencia existente con el prototipo 1 abortigénico. Para comprobar esta hipótesis tendríamos que realizar la cinética de neutralización con un VHE-4 cepa prototípica del subtipo 2 respiratorio (Celedón y col., 1992). Otras metodologías utilizadas con esta finalidad se refieren al análisis genético con enzimas de restricción, pruebas de inmunofiltración enzimática o inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos monoclonales para cada subtipo (Sabine y Whalley, 1989).

Respuesta post vacunal. En 1982 se estudió la respuesta inmune humoral en equinos inmunizados con la vacuna anti RNE Rhinomune(R) usada en los últimos 7 años, utilizando las pruebas serológicas de seroneutralización (dilución punto final seroneutralizante e índice de neutralización), y fijación del complemento. Para ello se vacunaron 10 hembras adultas, 8 potrillos de un año y 6 potrillos menores de un año, provenientes de dos haras sin antecedentes de aborto ni de vacunación contra la RNE en los 2 años previos a la experiencia. En un haras se tomaron muestras de suero cada 7 días durante un mes; en el otro haras, cada 15 ó 30 días durante 3 meses (Dinamarca, 1984).

En las hembras adultas, a los 7 días postvacunación, se detectó mediante las tres pruebas serológicas, un alza en los títulos de anticuerpos específicos contra el VHE-1, los que alcanzaron un máximo entre los 7 y 15 días, disminuyendo gradualmente hasta el término de la experiencia. En los potrillos de un año los resultados son similares a los obtenidos en las hembras adultas, aunque los títulos de anticuerpos son menores. Los potrillos menores de un año no respondieron a la vacunación (Tabla 4). Al comparar los títulos promedios obtenidos al inicio de la experiencia con los títulos máximos alcanzados en hembras adultas y potrillos de un año se encontraron diferencias significativas (p < 0,05) con las tres pruebas serológicas; no se encontraron diferencias significativas en los potrillos menores de un año. Además se encontraron diferencias significativas (p < 0,05) entre los títulos promedios de anticuerpos específicos en hembras adultas y potrillos de un año en las pruebas de dilución punto final seroneutralizante y fijación del complemento, en la mayoría de los tiempos de medición; sin embargo, ambas pruebas detectaron el mismo perfil inmunológico, ya que las correlaciones obtenidas son significativas (p < 0,05). En este trabajo se concluyó que la vacuna anti RNE Rhinomune(R) preparada con virus vivo modificado, cepa RAC-H subtipo 1 fetal, tiene la capacidad de inducir un alza estadísticamente significativa en los niveles de anticuerpos anti VHE-1 en hembras adultas y potrillos de un año. Además se recomendó utilizar la prueba de dilución punto final seroneutralizante para medir la respuesta inmune humoral post vacunal (Berríos y col., 1985c ).

TABLA 4 TÍTULOS PROMEDIO DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS DETECTADOS POR PRUEBAS SEROLÓGICAS EN EQUINOS VACUNADOS CONTRA LA RINONEUMONITIS EQUINA. SEGÚN CATEGORÍA Y TIEMPO DE SANGRÍA

Categoría

Tiempo de sangría (1)

Prueba Serológica

DPFS (2)

FC (3)

(4)

IN (5)

Hembras adultas

0

5,3

1,1

*

2,8

7

19,7

12,1

-

3,4

14

26,9

8,0

*

3,6

21

16,0

4,0

*

3,3

28

14,0

3,2

*

3,2

Potrillos de un año

0

3,0

0,0

*

1,3

7

17,4

4,4

*

2,7

14

13,5

4,2

*

3,2

21

8,8

4,2

*

3,2

28

6,5

3,2

*

3,3

Potrillos menores de un año

0

1,3

0,0

-

0,7

7

1,1

1,3

-

0,3

14

1,3

1,3

-

0,5

21

1,4

1,1

-

0,7

28

1,1

1,1

-

0,3

(1) Días. (2) Dosis punto final seroneutralizante (log. 2). (3) Fijación de complemento (log. 2). (4) Comparación entre DPFS y FC por la prueba de Wilcoxon      * (p < 0,05) (5) Índice neutralizante.

(Berríos y col., 1985)

En 1987 se analizaron mediante seroneutralización en cultivos celulares 48 sueros de hembras provenientes de un haras en donde se había inmunizado con vacuna inactivada (Pneumabort-K) 1 ó 2 meses antes del muestreo, encontrándose todos los sueros con títulos menores a 2 frente al VHE-1 (cepas FAE-13-76 chilena y cepa estándar prototipo RAC-H); cuatro meses después se repitió la experiencia obteniéndose los mismos resultados.

Discusión

La rinoneumonitis equina se presentó en Chile por primera vez en el último trimestre de 1969, en un gran brote de abortos que duró aproximadamente hasta 1976, causando serias pérdidas económicas en la hípica nacional. El uso sistemático de una vacuna preparada con virus vivo modificado (Rhinomune), iniciado con carácter experimental a fines de 1974 y continuado desde 1976, con la autorización oficial del Servicio Agrícola y Ganadero, es coincidente con la disminución gradual de casos de abortos registrados en la zona central del país. Solamente en 1984 se detectó la enfermedad en la zona sur, al aislarse el VHE-1 desde casos de abortos ocurridos en Victoria, IX Región.

Después de este grave brote de abortos que duró casi un decenio, la rinoneumonitis equina se ha presentado esporádicamente en Chile y en muchos casos el diagnóstico, en órganos de fetos abortados sólo ha sido realizado a través de métodos anatomopatológicos, sin poderse aislar el VHE-1.

Considerando los antecedentes señalados, cabe preguntarse si la rinoneumonitis se autocontroló o la vacunación desesperada con una vacuna viva modificada, cuestionada en otros países, tuvo un papel relevante. Cualquiera que sea la respuesta, es lícito pensar que podríamos estar en una fase epidemiológica silente, con escasos abortos cuya etiología no ha sido determinada, a lo cual se agregaría una disminución en las vacunaciones, situación crítica al tenerse una población equina desprovista de inmunidad de masa. Al respecto habría que recordar que las vacunas inactivadas contra la RNE de uso en el país tampoco han tenido el éxito deseado en el control de esta enfermedad en otros países. Finalmente es necesario consignar que no es posible realizar un análisis de la RNE en un contexto continental al no encontrarse mayores referencias al respecto, salvo la situación argentina.

La existencia de la rinoneumonitis equina en la República Argentina fue comunicada por primera vez en 1949 por Monteverde y Garbers; posteriormente en 1965 se detectaron anticuerpos específicos contra el VHE-1. En 1978 mediante inmunodifusión doble se encontró un 25% de animales positivos pertenecientes a dos haras de la Provincia de Buenos Aires. Recién en 1980 se aisló el VHE-1 a partir de un feto abortado (Etcheverrigaray, 1982). Dos años después se describieron brotes epizoóticos de enfermedad nerviosa asociados con este virus, comunicándose el aislamiento del VHE-1 a partir de un equino con sintomatología nerviosa (Nosetto, 1985). En 1985 se realizó aislamiento del VHE-1 a partir de leucocitos de un equino con cuadro clínico respiratorio (Galosi, 1988). En 1990 Galosi realizó un estudio serológico por seroneutralización en 466 equinos, vacunados y no vacunados, pertenecientes a 6 haras de la provincia de Buenos Aires encontrando un 48% de positividad, mientras que en los establecimientos que no vacunan se encuentra un 11% de positivos. En los últimos 4 años se han continuado realizando aislamientos del VHE-1, con un total de 12 cepas en estudio (Galosi y col.,1991).

Al igual que en Chile, en Argentina la vacunación no está oficialmente reglamentada; los programas de vacunación consisten en inmunizar hembras preñadas y potrillos jóvenes para prevenir abortos y enfermedad respiratoria, respectivamente. Las crías que van a ser destetadas a los 6 meses de edad, reciben dos dosis de vacuna con 3 a 4 semanas de intervalo y un refuerzo 6 meses después. Las hembras preñadas reciben tres dosis al 5º, 7º y 9º mes de gestación; en caso de tratarse de hembras recién arribadas al establecimiento son vacunadas cada 2 meses hasta el parto; el resto de los animales recibe una dosis ante cualquier circunstancia que pueda producirles estrés o bien previamente a la llegada de nuevos animales. En Argentina no es común la aparición de brotes epizoóticos de esta virosis, solamente se presentan casos aislados de abortos y sintomatología respiratoria (Galosi y col.,1991).

Como colofón de esta revisión sobre la rinoneumonitis equina, desde 1969 a la fecha, se recomienda afinar el estudio de todos los casos de aborto en que se encuentran cuerpos de inclusión intranucleares y no se aísla el virus con el propósito de establecer si el VHE-1 aún está presente en el país, y continuar vacunando ante la eventualidad de un rebrote de la enfermedad.

Agradecimientos

Es de implícita justicia agradecer la dedicación y eficiencia de todos aquellos alumnos de tesis que participaron en gran parte de los estudios nacionales sobre rinoneumonitis equina. En particular agradecemos al Sr. Rodrigo A. Guerrero V., alumno del VI Semestre de la Escuela de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile.

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