Trabajos Originales

  • Evaluación de la penetración de semen fresco y descongelado de caprino en gel de poliacrilamida

Resumen

 Con el propósito de estudiar el comportamiento de la penetración espermática en gel de poliacrilamida como método de estimación de la fertilidad poten­cial del caprino, se analizaron 54 eyaculados, pro­venientes de 6 chivatos criollos, obtenidos a través de electroeyaculación durante el período invierno­primavera. Las características del semen obtenido, evaluadas por métodos convencionales, se encon­traron dentro de los rangos normales para la es­pecie.

La penetración espermática se realizó con semen fresco diluido y semen descongelado, utilizando la cámara doble de penetración de Kremer, donde se midió la longitud de migración en tres tiempos sucesivos, la cual alcanzó valores de 32,44 ± 6,3; 38,14 ± 7,2 y 39,97 ± 7,8 mm para semen fresco y de 19,82 ± 7,8; 23,5 ± 9,8 y 24,6 ± 10,2 mm para semen descongelado, a los 15,30 y 45 minutos de incubación respectivamente. Esta prueba se corre­lacionó positivamente con la motilidad progresiva tanto en semen fresco como descongelado; mientras que las anormalidades espermáticas influyeron so­bre la penetración sólo cuando se utilizó semen descongelado. La incorporación de esta prueba co­mo método de evaluación seminal sería de utilidad en la medida que se requiera una estimación más exacta de la fertilidad potencial de reproductores caprinos.

 

Palabras Claves

Penetración espermática, semen, caprino

Abstract

In vitro sperm penetration test employing polyacrylamide gel to evaluate potential fertility in caprine was studied using 54 eyaculates from 6 bucks obtained by electroeyaciclation during winter and spring time. Semen samples were evaluated routinely and seminal variables were normal for this species. The sperm penetration was done lvith both fresh and frozen thawed semen using the Kremer's double penetration chamber at 37°C. The sperm migración was measured at there consecutive times of incubation, reaching a value of 32,44 ± 6,3; 38,14 ± 7,2 and 39,97 ± 7,8 mm in fresh semen, and of 19,82 ± 7,8; 23,5 ± 9,8 and 24,6 ± 10,2 mm in thawed semen, at 15,30 and 45 minutes respectively. This assay was positively correlated with sperm motility both in fresh and thalved semen, Whereas sperm morphology influenced sperm penetration only when thalved semen was used. The useful­ness of this test in the establishment of potential fertility and its inclusion in the rocítinary analysis óf caprine semen is discussed.

Keywords

Sperm penetration, semen, caprine

Introducción

Ha sido de especial interés para los investigadores la obtención de métodos que reflejen en mejor me­dida la capacidad fertilizante de los espermatozoi­des en las diversas especies. Para ello, se han idea­do una serie de técnicas in vitro, cuyo objetivo principal es determinar cuántas y/o cuáles células espermáticas son funcionalmente competentes para llevar a cabo el proceso de fecundación (Garner, 1984). Estos métodos pueden ser físicos, bioquími­cos o biológicos. Dentro de estos últimos resulta de gran importancia evaluar la interacción entre los espermatozoides y el mucus cervical.

Las pruebas de migración espermática en mucus cervical han sido consideradas de gran valor como medio para evaluar la capacidad fertilizante de los espermatozoides. Una alternativa al mucus cervical es el empleo de un medio sintético, el gel de polia­crilamida para los ensayos de migración en tubos capilares (Kummerfeld y col., 1981) ya que es posible elaborarlo en grandes cantidades; b) es uni­forme; c) es posible almacenarlo por varios meses a bajas temperaturas sin variaciones en la penetración de los espermatozoides (Lorton y col., 1981).

El objetivo del presente trabajo fue estudiar el comportamiento de la penetración espermática en gel de poliacrilamida, como método de estimación de la fertilidad potencial en los reproductores ca­prinos.

Material y método

Se utilizaron 6 caprinos criollos (Capra hircus), clínicamente sanos, a los que se les extrajo semen dos veces por semana por medio de estimulación eléctrica (electroeyaculación), durante el período invierno-primavera, obteniéndose un total de 54 eyaculados.

Luego de la recolección, cada muestra fue eva­luada inmediatamente a través del espermiograma convencional según las metodologías propuestas por Díaz y Arancibia (1971), determinándose las siguientes características: volumen, color, pH, concentración, motilidad progresiva y anormalidades espermáticas.

La prueba de penetración espermática se realizó con semen fresco diluido y semen descongelado, en ambos casos los diluyentes estaban compuestos por solución buffer más yema de huevo y además glice­rol (5%) para el semen descongelado.

Se realizaron dos repeticiones en la migración en cada tipo de muestra. Para tal efecto, se empleó la cámara de doble penetración espermática descrita por Kremer (1965). Como medio de migración se utilizó el gel de poliacrilamida (Lorton y col., 1981; Kummerfeld y col., 1981) con una concentración de acrilamida de 1,8%. Este medio sintético se depositó dentro de tubos capilares para microhema­tocrito (7,0 cm de longitud y 1,1 mm de diámetro interior), luego se selló en uno de sus extremos con masilla. El extremo opuesto con una pequeña pro­trusión de gel, se puso en contacto con el semen ubicado en los receptáculos de la cámara. Posterior­mente esta cámara se incubó horizontalmente a 37°C en un ambiente húmedo (Kremer, 1965; Arzu­mendi, 1985). La penetración espermática se deter­minó a los 15, 30 y 45 minutos de incubación, midiéndose así la distancia de migración (Lorton ,y col., 1981); para este fin se utilizó un microscopio de fase contrastada con aumento menor (10x).

El análisis estadístico de los datos se realizó mediante análisis de varianza y prueba de los rangos múltiples (procedimiento de Scheffe) para cada va­riable cuantitativa y para la prueba de penetración espermática en los diferentes tiempos. Se efectuó también la prueba de t de Student para estimar las diferencias en la migración espermática entre el semen fresco y descongelado. Además se hicieron correlaciones y regresiones entre algunas variables en estudio (Sokal y Rohlf, 1969).

Resultado y discusión

Los valores de las variables seminales medidas a través del espermiograma convencional (cuadro 1), se encontraron dentro de los rangos normales para la especie caprina (Foote, 1980; Mann, 1980; Dun­dar y col., 1983; Rubio, 1986).

CUADRO 1 VALORES DE LAS CARACTERISTICAS CUANTITATIVAS EN SEMEN FRESCO DE CAPRINO CRIOLLO ( ± DE)
Caracteristicas -------         Chivato N°         ------
1 n=5 2 n=10 3 n=10 4 n=10 5 n=10 6 n=9  ± D.E. n=54
Volumen (ml) 0,84±0,05a 0,98±0,47a 1,29±0,31ab 1,01±0,08a 1,82 ±0,59b 2,01± 0,69b 1,35±0,61
pH 7,00±0,07 6,90±0,34 6,94±0,31 6,75± 0,34 6,65 ± 0,31 7,00 ± 0,30 6,85±0,32
Concentración 109 esp/ml 2,37±0,70ab 4,07±2,13a 3,42±1,87ab 2,96±2,21ab 5,72± 2,88b 2,06±1,82a 3,59±2,36
N°espermatozoides totales/eyaculado 2,28±0,55a 4,38±3,08 4,45±2,93a 2,94±2,05a 10,84±7,65b 3,62±2,83a 5,00±4,83
Nº espermatozoides móviles/eyaculado 2,17±0,51a 4,11±3,09a 4,26±3,01a 2,87±2,01a 10,82±7,66b 3,35±2,74a 4,84±4,86
Motilidad progresiva (%) 95,0±3,53ab 89,5±7,24a 92,5±7,54ab 96,5±3,37ab 99,00±1,58b 90,55±5,27a 93,88±,26
Anormalidades espermáticas ------------------------------------------------------------------------------------------
Cabeza acrosoma (%) 0,8±0,75 0,40±0,45 0,35±0,52 0,25±0,35 0,35 ± 0,41 0,33±0,35 0,37±0,46
Cuello T. intermedio (%) 0,7±0,57 0,55±0,59 0,55±0,36 0,55±0,49 0,55 ± 0,49 0,44±0,39 0,54±0,46
Cola (%) 3,0±0,61ab 4,00±2,05b 1,45±0,68a 1,75±1,29a 2,05±1,23ab 2,61±0.92ab 2,42±1,51
Totales (%) 4,5±0,61ab 4,95±2,14b 2,35±1,37a 2,55±1,62ab 2,95±1,53ab 3,38±1,21ab 3,35±1,77
* No existen diferencias significativas entre individuos para esta caracteristica (p  0.05) abLetras distintas indican diferencias significativas entre individuos (p < 0,05)
Las características seminales presentaron varia­ción individual significativa (P   0,05) con excep­ción del pH y las anormalidades de la cabeza y el acrosoma, del cuello y segmento intermedio, tanto para semen fresco como descongelado.

Se observó que la penetración espermática, en ambos tipos de muestras presentó un comporta­miento acelerado durante los primeros 15 minutos, disminuyendo gradualmente su velocidad hasta los 30 minutos, y estabilizándose entre los 35 y 45 minutos de incubación (figura 1). Este comporta­miento es similar al observado por Beltrán (1983), Vidal (1983) y Arzumendi (1985), pudiendo ser explicado porque la aceleración espermática inicial causa una disminución en el contenido de ATP mitocondrial, ya que el espermatozoide requiere de energía para realizar el movimiento flagelar y para vencer la resistencia que opone el mucus (Mann, 1973); de esta forma, al cabo de un tiempo de migración, el contenido de ATP se hace insuficien­..te para mantener la velocidad espermática inicial. Al respecto, Rubio (1986), encontró una correla­ción positiva (r = 0,41) entre la motilidad de masa y el contenido de ATP para semen caprino fresco, lo que confirma el hecho de que la motilidad espermá­tica es dependiente del contenido energético que posean los espermatozoides.

Figura 1.  Curva de regrsión de la penetración espermática según tiempo en semen fresco y descongelado.

Kesseru (1973), trabajando con semen humano fresco y mucus cervical humano, encontró una pe­netración de 21 ± 1 mm a los 10 minutos de incuba­ción. Mediante la función de regresión para semen fresco calculada en este trabajo (figura 1), se pudo estimar que la penetración espermática a los 10 minutos de incubación promedió 23 mm, valor si­milar al encontrado por este autor; sin embargo, a los 30 minutos de incubación, el valor señalado por el autor antes citado es superior al que se observó en este estudio (51 ± 2 vs 38,1 ± 7,2 mm), lo que podría indicar que el espermatozoide humano posee una reserva energética mayor a la del caprino, he­cho que es confirmado por Rubio (1986), quien obtuvo una concentración media de ATP de 39,17 x 10-7 mM/ 106 espermatozoides para semen caprino, comparado con 87,0 x 10-7 mM/106 espermatozoi­des en semen humano (Comhaide y col., 1983).

La migración espermática en los tres tiempos de medición mostró una diferencia significativa (P < 0,05) entre el semen fresco y el descongelado (cuadro 2). Los valores obtenidos con semen descongelado (cuadro 2), son inferiores a los que se indican para la especie bovina, cuando ésta se reali­za con mucus cervical bovino (Kummerfeld y col., 1981; Beltrán, 1983; Vidal, 1983) o con el gel de poliacrilamida (Lorton y col., 1981; Arzumendi, 1985), pudiendo atribuirse esta diferencia a un efec­to de la especie en que se realiza la prueba.

CUADRO 2  PENETRACION ESPERMATICA (mm) A LOS 15, 30 y 45 MINUTOS EN GEL DE POLIACRILAMIDA (  D E)
 Penetracion espermática(mm) ----        Chivato N°    --------
1 n=5 2 n= 10 3 n= 10 4 n= 10 5 n= 10 6 n=9   ± D. E. n=54
Semen Descongelado 15 Minutos 30,6±4,8ab 28,8±6,3ab 33,0±5,7ab 35,3±6,8ab 37,4±4,6b 28,0±3,9a 32,44±6,38
30 Minutos 37,1±8.7ab 34,3±6,6ab 38,7±6,8ab 41,4±7,5ab 43,3± 5.3b 32,8±3,8a 38,14±7,26
45 Minutos 38,8±9,4ab 36,2±7,4ab 40,7±7,4ab 43,3±7.7ab 45,6±6,3b 33,8±3.8a 39,97±7,89
Semen fresco 15 Minutos 11,7±1,3a 15,5±5.6ab 20,9±4,7ab 25,0±8,7b 24,8±8.0b 16,3±6.56ab 19,82±7,85
30 Minutos 13,4±1,9a 18,3±6,4ab 25,3±6,0ab 29,2±10.7b 30,1±1.4b 19,2±7,29ab 23,5±9,84
45 Minutos 13,5±2,0a 19,1±6.4ab 26,7±65ab 30,7±10.7b 31,4±12,2b 19,9± 7,2ab 24,6±10,27
abLetras distintas indican diferencias significativas entre individuos(p < 0.05)
Los resultados de la prueba de penetración esper­mática están influidos por tres factores interrelacio­nados entre sí, como son la motilidad, morfología y concentración espermática (Alexander, 1981; Goldstein y col., 1982). La concentración presenta una correlación baja con esta prueba (David y col., 1979; Goldstein y col., 1982) a pesar de que en eyaculados con una concentración inferior a los valores mínimos propios de cada especie, ésta tiene un efecto negativo sobre los resultados de la prueba (David y col., 1979). En el presente trabajo, el efecto de la concentración no fue medido, ya que la prueba de penetración espermática se realizó con semen diluido a una concentración establecida con anterioridad, la cual fue de 200 x 106 esp/ml.

La morfología espermática es otro factor impor­tante que determina la capacidad de penetración de los espermatozoides, encontrándose correlaciones negativas entre la penetración espermática y el por­centaje de anormalidades (David y col., 1979). Sin embargo, Alexander (1981), señala que esta carac­terística no sería un factor relevante para la penetra­ción espermática, a menos que los eyaculados po­sean un alto porcentaje de teratospermia. En este estudio, no se observó una correlación significativa entre las anormalidades espermáticas y los resulta­dos de la prueba de penetración en semen fresco, pero éstas sí tuvieron influencia cuando se realizó con semen descongelado (cuadro 3). Esto se debió al bajo porcentaje de anormalidades totales presen­tes en el semen fresco (3,35 ± 1,7%), las cuales aumentaron luego del proceso de congelación (6,39 ± 2,4%).

La motilidad progresiva es el factor más relevan­te en la capacidad de penetración espermática, cuando la morfología y concentración espermática se encuentran dentro de los rangos normales (David y col., 1979). Según Goldstein y col. (1982), la motilidad es la característica seminal que presenta la mayor correlación con la penetración espermáti­ca (r = 0,62), pudiendo verse disminuida a causa del fenómeno de inmunidad antiespermática. En este trabajo, la motilidad inicial se correlaciona significativamente (p < 0,05) con la penetración espermática en semen fresco y descongelado (cuadro 3).

Por su parte, Amit y col. (1982), señalan que en el humano la velocidad espermática medida por el método de exposición múltiple (M E P) está alta­mente correlacionada con la motilidad progresiva, morfología espermática y penetrabilidad en mucus cervical; sin embargo, Rubio (1986), no encontró una asociación significativa para el caprino entre las variables medidas por M E P (velocidad y motilidad objetiva) y las obtenidas mediante evaluación con­vencional, posiblemente a causa de la alta concen­tración espermática, propia de esta especie, la cual alteraría de una u otra forma los resultados del método M E P.

Al comparar las curvas de regresión para la pe­netración espermática (figura 1) entre semen fresco y descongelado, se observa que este último presenta una tendencia semejante al obtenido en semen fres­co, pero de menor magnitud (p < 0,05); esta dismi­nución también es evidente en la motilidad progre­siva. El descenso en ambas características semina­les puede explicarse por los cambios bioquímicos y morfológicos que ocurren durante el proceso de congelación y descongelación (Goldstein y col., 1982). Al cuantificar este descenso, es posible evi­denciar una disminución mayor en la motilidad (de inicial a postdescongelación) que en la penetración espermática; este fenómeno no ocurre si se conside­ra como valor inicial la motilidad obtenida al diluir el semen en 'buffer' donde el descenso de la motili­dad es proporcional al descenso de la penetración espermática.

CUADRO 3 COEFICIENTE DE CORRELACION PARA VARIABLES CUANTITATIVAS MEDIDAS EN SEMEN FRESCO Y DESCONGELADO

Variables correlacionadas

r*

Anormalidades totales postdescongelación   Penetración espermática (PE) postdescongelación 15 minutos

- 0,3556

Anormalidades totales postdescongelación   PE postdescongelación 30 minutos

- 0,3339

Anormalidades totales postdescongelación   PE postdescongelación 45 minutos

- 0,3437

Motilidad progresiva inicial (MPI)                   PE 15 minutos

0,3829

MPI PE 30 minutos

0,4134

MPI PE 45 minutos

0,4140

MPI PE postdescongelación 15 minutos

0,3244

MPI PE postdescongelación 30 minutos

0,3498

MPI PE postdescongelación 45 minutos

0,3662

*/p < 0.05

Este hecho confirma nuevamente que la motili­dad progresiva medida en semen fresco sin diluir no es un buen indicador de la fertilidad potencial del semen caprino, dado que está altamente influencia­do por la concentración espermática del eyaculado.

La curva de regresión para la penetración esper­mática, tanto en semen fresco como descongelado (figura 1), permite observar que más allá de los 30 minutos de incubación, la distancia de penetración no aumenta significativamente (p < 0,05), por lo que no sería necesario realizar mediciones luego de este tiempo de incubación; esta observación puede proporcionar antecedentes para investigaciones fu­turas sobre la prueba de penetración espermática enla especie caprina

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Recibido el 18 de agosto de 1989; aprobado el 1 ° de diciembre de 1989.