Trabajos Originales

  • Aislamiento de Mycoplasma equigenitalium a partir de yeguas

Resumen

Hasta el momento, la patogenicidad de Mycoplasmas encontrados en los aparatos genitales de equinos, no ha sido confirmada. El objetivo de este trabajo es comunicar el aislamiento de Mycoplasma equigenitalium de útero de yeguas con problemas reproductivos. Se tomaron muestras de 16 yeguas destinadas a la reproducción en haras, que se encontraban en etapa de anestro y presentaban problemas reproductivos. Seis fueron extraídas de animales normales que actuaron como testigos. De las 16 yeguas estudiadas, se observó colonias típicas del género Mycoplasma, en una sola de ellas (6,25%). En las muestras de animales testigos no se observó desarrollo de Mycoplasmas. Luego de su donado y forma paralela con la cepa de referencia T-37 se realizaron las siguientes pruebas: Fermentación de la glucosa. Hidrólisis de la arginina. Reducción del 2,3,5 thiphenil tetrazolium, actividad de fosfatasa, observación de la producción de 'Film and Spot', técnica de inmunofluorescencia directa en bloques de agar y electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS. En todas las técnicas realizadas, la cepa de referencia T-37 y la aislada, mostraron idénticos resultados por lo que esta última fue caracterizada como Mycoplasma equigenitalium. La posibilidad de implicar al M. equigenitalium como responsable de infertilidad en equinos a partir de este hallazgo sólo es presuntiva debido a su baja incidencia con respecto a animales sin patología (diferencia no significativa: chi cuadrado > 0,05), quizá este microorganismo sea un patógeno oportunista o sólo produzca manifestaciones de subfertilidad en casos esporádicos.

Palabras claves: Mycoplasma equigenitalium, subfertilidad, equinos

Abstract

Up to now, the pathogenic effect of equine Mycoplasmas in genital tracts has not been confirmed yet. The purpose of this study is to report the isolation of Mycoplasrna equigenitaliurn from mares with reproductive problems. Out of a total number of 16 samples tit, were taken from mares with subfertility. On the other hand six samples were taken from normal animals (control group). Mycoplasma was recovered in only one occasion from one mare with subfertility, meanwhile no growth was observed in a control group. Isolated strain was cloned and several tests were performed glucose fermentation, arginine hydrolysis. Reduction of 2.3.5 thipenil tetrazolium, phosphatase activity. 'Film and Spot' production, direct immunofluorescence in agar blocks and electrophoresis in polyacrylamide gel with SDS. Results show that isolated strain and reference strain of Mycoplasma equigenitalium T 37 were identical. The consideration of this microorganism as responsible of infertility in mares is only presumptive (no significant statistical difference (p > 0,05) with the control group). Perhaps this microorganism may be opportunistic or may produce infertility in sporadic cases.

Key words: Mycoplasma equigenitalium, horse, subfertility.

Abstract

Hasta el momento, la patogenicidad de Mycoplasmas encontrados en los aparatos genitales de equinos, no ha sido confirmada. El objetivo de este trabajo es comunicar el aislamiento de Mycoplasma equigenitalium de útero de yeguas con problemas reproductivos. Se tomaron muestras de 16 yeguas destinadas a la reproducción en haras, que se encontraban en etapa de anestro y presentaban problemas reproductivos. Seis fueron extraídas de animales normales que actuaron como testigos. De las 16 yeguas estudiadas, se observó colonias típicas del género Mycoplasma, en una sola de ellas (6,25%). En las muestras de animales testigos no se observó desarrollo de Mycoplasmas. Luego de su donado y forma paralela con la cepa de referencia T-37 se realizaron las siguientes pruebas: Fermentación de la glucosa. Hidrólisis de la arginina. Reducción del 2,3,5 thiphenil tetrazolium, actividad de fosfatasa, observación de la producción de 'Film and Spot', técnica de inmunofluorescencia directa en bloques de agar y electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS. En todas las técnicas realizadas, la cepa de referencia T-37 y la aislada, mostraron idénticos resultados por lo que esta última fue caracterizada como Mycoplasma equigenitalium. La posibilidad de implicar al M. equigenitalium como responsable de infertilidad en equinos a partir de este hallazgo sólo es presuntiva debido a su baja incidencia con respecto a animales sin patología (diferencia no significativa: chi cuadrado > 0,05), quizá este microorganismo sea un patógeno oportunista o sólo produzca manifestaciones de subfertilidad en casos esporádicos.

Palabras claves: Mycoplasma equigenitalium, subfertilidad, equinos

Abstract

Up to now, the pathogenic effect of equine Mycoplasmas in genital tracts has not been confirmed yet. The purpose of this study is to report the isolation of Mycoplasrna equigenitaliurn from mares with reproductive problems. Out of a total number of 16 samples tit, were taken from mares with subfertility. On the other hand six samples were taken from normal animals (control group). Mycoplasma was recovered in only one occasion from one mare with subfertility, meanwhile no growth was observed in a control group. Isolated strain was cloned and several tests were performed glucose fermentation, arginine hydrolysis. Reduction of 2.3.5 thipenil tetrazolium, phosphatase activity. 'Film and Spot' production, direct immunofluorescence in agar blocks and electrophoresis in polyacrylamide gel with SDS. Results show that isolated strain and reference strain of Mycoplasma equigenitalium T 37 were identical. The consideration of this microorganism as responsible of infertility in mares is only presumptive (no significant statistical difference (p > 0,05) with the control group). Perhaps this microorganism may be opportunistic or may produce infertility in sporadic cases.

Key words: Mycoplasma equigenitalium, horse, subfertility.

Introducción

Mycoplasma equigenitalium ha sido aislado del aparato genital de la yegua (vagina, cuello uterino y rara vez de útero) y de padrillos (prepucio, pene, uretra y semen) (Lenke 1979, Krabisch y col., 1973, Ogata y col., 1974, Mani P. y col. 1986, Moorthy y col., 1977) sin sintomatología. Se ha aislado también de fetos equinos abortados (Lencke 1979) y muy raramente de aparato respiratorio (Moorthy y Spradbow, 1976).

Hasta el momento, la patogenicidad de Mycoplasmas encontrados en los aparatos genitales de equinos, no ha sido confirmada. Moorthy y col. (1977) aislaron 10 cepas de Mycoplasmas de 12 hembras con problemas de fertilidad, por otro lado Poland J. (1979) obtuvo 9 aislamientos de un total de 10 yeguas con endometritis. En la bibliografía consultada no se han obtenido datos de aislamiento de M. equigenitalium en la República Argentina.

El objetivo de este trabajo es comunicar el aislamiento de M. equigenitalium de útero de yegua con problemas reproductivos.

Materiales y métodos

Animales estudiados. Se tomaron muestras de 16 yeguas pura sangre, destinadas a la reproducción, que se encontraban en etapa de anestro y presentaban problemas reproductivos (fertilidad reducida). Seis muestras fueron extraídas de animales normales que actuaron como testigos.

Toma de muestra y medios de cultivos. Las muestras fueron extraídas por medio de la técnica de lavado uterino descrita por Hall y col. (1900). Las muestras se centrifugaron a 3.500 rpm (1.410 kg) durante 15 minutos y se procedió a la siembra del sedimento obtenido en el medio de cultivo Hayflick modificado (HM) (Tully y col., 1983), incubándose a 37°C por 72 horas en atmósfera con 15% de CO2. De los cultivos positivos se seleccionaron colonias que fueron resembradas 3 veces, luego se inoculó en HM con y sin suero equino (Berger's Manual, 1984).

Caracterización bioquímica. Se realizaron las siguientes pruebas: Fermentación de la glucosa (Razin y Cirilo, 1983). Hidrólisis de la arginina (Barile, 1903). Reducción del cloruro de 2.3.5 triphenil tetrazolium (Senterfit, 1983), actividad Fosfatasa (Bradbury, 1983) y la observación de la producción de 'Film and Spot' (Freund, 1983).

Prueba de Referencia. Se utilizó la cepa T-37, de M. equigenitalium, cedida gentilmente por el First Laboratory of Bacteriology. National Institute of Animal Health, Tsukuba, Japón.

Prueba de Inmunofluorescencia. Fue realizada en bloques de agar, según la técnica descrita por Gardella y col. (1983).

Producción de suero hiperinmune

El antisuero fue obtenido con la cepa de referencia de Mycoplasma equigenitalium, cultivada en medio HM líquido. Se recolectó el sedimento y se lavó dos veces con solución salina de fosfatos (PBS) pH 7.2 a 10.000 rpm (11.500 kg) durante 15 minutos, seguidamente el sedimento se diluyó con PBS a un valor similar a 4 en la escala de Mc Farland. El plan de inoculación (Tabla 1) se realizó en ratas adultas SPF cepa F344/N. La extraccion de sangre se realizó por el método de punción cardíaca. El suero obtenido fue diluido 1/10, 1/50 y 1/100 en PBS. Para la observación se usó un microscopio con epi fluorescencia marca Olympus BH-2 (Japón). El conjugado usado antirrata /Zymed, California. USA) se diluyó 1/100. Se usó como testigos las cepas M. equigenitalium T-37, M. rnustelae X9, M. hyosynoviae S. 16, y M. hyorhinis DTS 7.

TABLA 1 PLAN DE INOCULACIÓN PARA LA OBTENCIÓN DE SUERO ANTI M. EQUIGENITALIUM

 Nro de inoculación

Día

Vía

Cantidad

Tipo de inóculo

1er

IA

0,25 ml

Me + FC*

2da

15 

IA

0,25 ml

Me + FC*

3er

25 

IA

0,50 ml

Me + PBS+

4ta

35 

IA

0,50 ml

Me + PBS+

Extracción de suero

40

IC

5,00 ml

 

(IA)Intra abdominal. (*) M. equigenitalium Me Farland 4 en PBS en partes iguales con adyuvante Freund completo. (+) M. equigenitalium PBS Me Farland 4. (IC) Intracardíaca.

Electroforesis en geles de poliacrilamida con Dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). Se realizó según la técnica de Laemmli (16) con una concentración de poliacrilamida del 12.5% y un gel concentrador al 4%. El buffer de muestra se realizó según la técnica de Mouches y Bové (1983). La corrida se realizó con 200 w durante 60 min. Se utilizó, como método de coloración proteica, azul de Coomasie. La cepa T-37 se usó como testigo.

Producción de suero hiperinmune

El antisuero fue obtenido con la cepa de referencia de Mycoplasma equigenitalium, cultivada en medio HM líquido. Se recolectó el sedimento y se lavó dos veces con solución salina de fosfatos (PBS) pH 7.2 a 10.000 rpm (11.500 kg) durante 15 minutos, seguidamente el sedimento se diluyó con PBS a un valor similar a 4 en la escala de Mc Farland. El plan de inoculación (Tabla 1) se realizó en ratas adultas SPF cepa F344/N. La extraccion de sangre se realizó por el método de punción cardíaca. El suero obtenido fue diluido 1/10, 1/50 y 1/100 en PBS. Para la observación se usó un microscopio con epi fluorescencia marca Olympus BH-2 (Japón). El conjugado usado antirrata /Zymed, California. USA) se diluyó 1/100. Se usó como testigos las cepas M. equigenitalium T-37, M. rnustelae X9, M. hyosynoviae S. 16, y M. hyorhinis DTS 7.

Electroforesis en geles de poliacrilamida con Dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). Se realizó según la técnica de Laemmli (16) con una concentración de poliacrilamida del 12.5% y un gel concentrador al 4%. El buffer de muestra se realizó según la técnica de Mouches y Bové (1983). La corrida se realizó con 200 w durante 60 min. Se utilizó, como método de coloración proteica, azul de Coomasie. La cepa T-37 se usó como testigo.

Resultados

De las 16 yeguas estudiadas, se observó la presencia de colonias típicas del género Mycoplasma en una sola de ellas (6,25%). La cepa aislada desarrolló solamente en medio HM con suero equino. En medio líquido, desarrolló sin la adición de CO2, mientras que en medio sólido, sólo creció con la adición de 15% de CO2, el período de crecimiento en ambos casos fue de 72 horas. En las muestras provenientes de animales testigos no se observó desarrollo de Mycoplasmas. A partir de la tercer resiembra se inoculó en HM sin suero equino (Freundt, 1984).

Los resultados correspondientes a la caracterización bioquímica están representados en la tabla 2.Los patrones proteicos en SDS-PAGE de las cepas analizadas (T-37 y aislada) mostraron una gran similitud en casi la totalidad de las bandas (Foto 1).

TABLA 2 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA

Cepa

 Glucosa (1)

Arginina (2)

TTC (3)

Fosfatasa (4)

F&S (5)

Cepa T 37

M. Equigenitalium

 +

 -

 -

 +

 -

Cepa aislada

 +

 -

 -

 +

 -

(1) Fermentación. (2) Hidrólisis. (3) Reducción del Tetrazolium. (4) Medición de la actividad de la fosfatasa. (5) Producción de 'Film and Spot'.

MPM Cepa T37 Cepa aislada

Foto 1. Electroforesis en gel de Poliacrilamida con SDS.

Referencias

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Recibido el 28 de mayo de 1995. Aprobado el 13 de junio de 1995.