Comunicaciones

  • Aislamiento de Yersinia Ruckeri en salmónidos de cultivo

Resumen

En este trabajo se informa del hallazgo y caracterización de cepas de Y. ruckeri aisladas de peces salmónidos provenientes de pisciculturas de la X y XI regiones de Chile. El estudio se llevó a cabo entre noviembre de 1991 y julio de 1992 y permitió el aislamiento de este agente en peces enfermos de 10 y 15 meses de edad. Las principales características clínicas patológicas de los peces afectados incluyeron letargia, exoftalmia bilateral, palidez de órganos, inflamación de bazo e hígado, exudado amarillento intestinal, obscurecimiento de la piel y lesiones externas dorsales en los peces mayores. En la totalidad de los casos Y. ruckeri fue aislado como único agente infeccioso bacteriano en muestras de riñón, músculo y exudado de las lesiones externas de los peces afectados. La caracterización bioquímica y serológica así como el patrón de susceptibilidad a los antibióticos y perfil de proteínas totales permiten sugerir que los aislados corresponden a un clon común de Y. ruckeri diseminado en la zona sur de nuestro país. El agente resultó resistente a penicilina y eritromicina. En 2 cepas se detectó además la presencia de un plasmidio de 20-26 MDa compatible con el descrito para el serotipo 2 de O'Leary.

Palabras claves: Salmónidos, Yersinia ruckeri.

Abstract

This study informs on the isolation and characterization of Y. ruckeri isolates recovered, between November 1991 and Jady 1992, frorn diseased salmons reared in 10th and 11th Regions of Chile. The clinical illness induced by this pathogen affected 10 to 15 months old salmons. The relevant clinical symptoms included lethargy, bilateral exophtalmia, pale tissues, spleen and liver infamation, the presence of a yelowish exudate in. the gut, skin darkening and dorsal lesions in adults fishes. Y.ruckeri was always isolated as a sole pathogen either frorn kidney, muscle or skin lesions. Biochemical and antibiotic susceptibility tests as well as total protein profiles were similar in all the isolates tested suggesting this Y. ruckeri strain represent a unique clon disseminated in a variety of aquatic systems in our setting. All Y. ruckeri, isolates were resistant to penicilin and erithomycin. Genetic studies revealed the presence of a single plasmid in some strains, its molecular weight, ca. 20-26 mDa, is fully compatible with that reported by O'Leary ira strains frorn serotype 2.

Key words: Salmonids, Yersinia ruckeri

Abstract

En este trabajo se informa del hallazgo y caracterización de cepas de Y. ruckeri aisladas de peces salmónidos provenientes de pisciculturas de la X y XI regiones de Chile. El estudio se llevó a cabo entre noviembre de 1991 y julio de 1992 y permitió el aislamiento de este agente en peces enfermos de 10 y 15 meses de edad. Las principales características clínicas patológicas de los peces afectados incluyeron letargia, exoftalmia bilateral, palidez de órganos, inflamación de bazo e hígado, exudado amarillento intestinal, obscurecimiento de la piel y lesiones externas dorsales en los peces mayores. En la totalidad de los casos Y. ruckeri fue aislado como único agente infeccioso bacteriano en muestras de riñón, músculo y exudado de las lesiones externas de los peces afectados. La caracterización bioquímica y serológica así como el patrón de susceptibilidad a los antibióticos y perfil de proteínas totales permiten sugerir que los aislados corresponden a un clon común de Y. ruckeri diseminado en la zona sur de nuestro país. El agente resultó resistente a penicilina y eritromicina. En 2 cepas se detectó además la presencia de un plasmidio de 20-26 MDa compatible con el descrito para el serotipo 2 de O'Leary.

Palabras claves: Salmónidos, Yersinia ruckeri.

Abstract

This study informs on the isolation and characterization of Y. ruckeri isolates recovered, between November 1991 and Jady 1992, frorn diseased salmons reared in 10th and 11th Regions of Chile. The clinical illness induced by this pathogen affected 10 to 15 months old salmons. The relevant clinical symptoms included lethargy, bilateral exophtalmia, pale tissues, spleen and liver infamation, the presence of a yelowish exudate in. the gut, skin darkening and dorsal lesions in adults fishes. Y.ruckeri was always isolated as a sole pathogen either frorn kidney, muscle or skin lesions. Biochemical and antibiotic susceptibility tests as well as total protein profiles were similar in all the isolates tested suggesting this Y. ruckeri strain represent a unique clon disseminated in a variety of aquatic systems in our setting. All Y. ruckeri, isolates were resistant to penicilin and erithomycin. Genetic studies revealed the presence of a single plasmid in some strains, its molecular weight, ca. 20-26 mDa, is fully compatible with that reported by O'Leary ira strains frorn serotype 2.

Key words: Salmonids, Yersinia ruckeri

Introducción

La enteritis de la boca roja (EBR) es una importante enfermedad infecciosa que afecta a los salmonideos y que tiene como agente etiológico a Y. ruckeri. Desde que Rucker (1966) describió la enfermedad en Idaho (USA), se han reportado numerosos brotes en piscifactorías de Estados Unidos, Canadá y Europa con ingentes pérdidas para la salmonicultura (Austin & Austin, 1987, Rodgers; 1991 a).

Y. ruckeri afecta preferentemente a peces salmónidos, pero se pueden aislar de otras especies silvestres (McArdle y Dooley-Martin, 1985). La transmisión de la enfermedad en salmónidos sucede principalmente por la vía horizontal durante su fase de desarrollo en agua dulce. No obstante, la infectividad del agente puede perpetuarse al alcanzar otros hospederos tales como peces o crustáceos silvestres. Estos vectores pueden, a su vez, transmitir al agente infeccioso a salmones y truchas posteriormente durante su cultivo en agua salada (Rodgers, 1991 b). La fase aguda de la enfermedad se caracteriza por su alta letalidad debido a la aparición de septicemia, las tasas de mortalidad son proporcionalmente mayores cuando menor es la edad (tamaño) de los peces (Rodgers, 1991 b). En los peces adultos, en cambio, el cuadro cursa como una infección crónica y sus principales signos clínicos son la congestión capilar y venosa del cerebro y los vasos oculares. Asimismo, se observan lesiones hemorrágicas en órganos internos, músculos e intestino y en la superficie corporal. El enrojecimiento de la boca del pez, de donde deriva el nombre de esta patología, es un signo observado con relativa baja frecuencia ya que parece manifestarse tardíamente en los últimos estadios de la fase crónica de la enfermedad.

Chile se ha transformado en uno de los principales productores de salmón y trucha del mundo, no obstante, a nivel local disponemos de escasa información sobre el impacto que causan las enfermedades infecciosas en esta importante industria nacional. El objetivo del presente trabajo fue demostrar la presencia de Y. ruckeri, patógeno bacteriano de alta prevalencia en otras regiones del mundo, en planteles piscícolas nacionales. Este trabajo se pudo realizar aprovechando la infraestructura de un estudio mayor destinado a identificar patógenos bacterianos y virales en salmones de cultivo, investigación efectuada entre 1991 y 1992. El diseño de este estudio involucró el análisis bacteriológico de peces provenientes de distintos planteles salmonícolas nacionales. En la ejecución del trabajo participó la Fundación Andes, que otorgó el financiamiento, y la Asociación de Productores de Salmón y Trucha de Chile A.G., que coordinó la acción de los patólogos encargados de cada plantel y dio el apoyo logístico para recepción y envío de muestras a través de su oficina regional de Puerto Montt.

 Proyecto financiado por Grant C-1 1001 de Fundación Andes, 1991.

Materiales y métodos

1. Muestras:

En total, se analizó 12 lotes de entre 3 y 7 salmones cada uno, provenientes de 4 piscifactorías localizadas en la X y XI regiones de Chile. De éstos, 10 lotes correspondieron a peces jóvenes (10 meses) y los 2 restantes a peces mayores (15 meses). Los envíos de estos lotes fueron seleccionados por los patólogos de las distintas pisciculturas en base a presencia de signos sugerentes de patología infecciosa. Los peces fueron enviados al INTA en Santiago en bolsas de agua refrigeradas y oxidenadas.

2. Estudio bacteriológico:

a) Obtención de muestras bacteriológicas:

De acuerdo al tamaño de los peces, estos fueron analizados como una sola muestra (lote), o como peces por separado (peces de mayor tamaño). Inmediatamente después de recibirlos se realizó un examen físico de los peces para detectar lesiones externas visibles, en branquias, ojos, piel, boca, abdómen, etc. Posteriormente los peces fueron lavados en agua estéril, etapa previa para efectuar la necropsia. Con los peces pequeños se preparó un macerado (en suero fisiológico) del pez completo, mientras que en aquellos de mayor tamaño se extirpó el riñón y tejido muscular que fueron analizados por separado. En total se analizó 10 muestras de homogenizados de peces (10 lotes) y 6 muestras de tejido renal y muscular (2 lotes de 3 peces cada uno). Cuando se observó lesiones externas se tomaron muestras adicionales de las zonas afectadas.

b) Examen microscópico:

El estudio microscópico incluyó la observación directa por tinción de Gram de cuatro frotis por cada lote o muestra de tejido respectivamente.

c) Cultivo y aislamiento:

Cada una de las muestras fue sembrada separadamente en placas de agar soya tripticasa (TSA) y agar McConkey las que fueron incubadas en paralelo a 20° y 37° y observadasa las 24, 48 hrs y a los 7 días.

La identificación de las colonias aisladas se realizó mediante pruebas bioquímicas convencionales (Ewing, 1986) a 20° y 37°C. Los resultados de estas pruebas fueron registrados a las 48 y 72 hrs con la excepción de las pruebas de Voges Proskauer y Rojo de metilo, que requirieron de 4 días de incubación. Para las pruebas de fermentación se utilizó caldo base rojo fenol, incubado hasta por 15 días.

d) Susceptibilidad a los antibióticos:

La susceptibilidad a los antibióticos fue determinado por el método de difusión en agar (Bauer y col., 1966) a 20°C. Las cepas resistentes fueron sometidas a ensayos de concentración inhibitoria mínima (CIM) por el método de dilución seriada en placa (Sham y Washington, 1991). La producción de B-lactamasas fue determinada mediante el ensayo iodométrico (Alvial y col., 1985-1986).

e) Estudios moleculares:

- Análisis de proteínas totales: El perfil de proteínas totales de las cepas de Y. ruckeri fue determinado por electroforésis en geles de poliacrilamida (15% y 4% geles separador y concentrador respectivamente) de acuerdo a lo propuesto por Laemmli (1970). Las bandas proteicas fueron visualizadas por tinción argéntica (Morissey, 1981). Las masas moleculares de las bandas proteicas observadas fueron calculadas en base a un curva construida con marcadores de referencia (Sigma).

- Detección de plasmidios: La presencia de ADN extracromosomal fue investigada mediante el método descrito por Kado y Liu (1981) para plasmidios grandes, y el desarrollado por Birnboim y Doly (1979) para plasmidios pequeños. Las bandas plasmidiales fueron visualizadas por electroforesis en geles de agarosa 0,7% y tinción con bromuro de ethidio.

3. Estudio serológico:

La confirmación serológica de las cepas bioquímicamente compatibles con Y. ruckeri se realizó con un antisuero polivalente preparado en nuestro propio laboratorio en base a una cepa de Y. ruckeri estándar proporcionada gentilmente por el Dr. J. Fryer (Oregon, USA). Posteriormente las cepas aisladas fueron enviadas a Oregon para confirmar los resultados obtenidos.

Resultados y discusión

El estudio prospectivo realizado entre noviembre de 1991 y julio de 1992 en pisciculturas de la X y XI regiones de Chile demostró la presencia de Y. ruckeri en 5/12 (42%) lotes de peces enfermos provenientes de 3 de las piscifactorías que colaboraron en el proyecto. Las especies afectadas correspondieron a salmón del Atlántico (Salmo salar salar) y salmón coho (Oncorhyrichuss kisutch). La edad de los salmones afectados fluctuó entre 10 y 15 meses. Desde el punto de vista clínico los peces más pequeños usualmente presentaron letargia y alteraciones externas tales como: obscurecimiento de la piel, exoftalmia bilateral, aletas hinchadas y branquias pálidas. Los peces mayores en cambio, presentaron sólo lesiones expuestas en la cabeza y en el dorso. Al realizar la necropsia las principales alteraciones anatomopatológicas observadas en los peces menores fueron: espleno y hepatomegalia, riñones de aspecto granuloso y presencia de exudado amarillo a nivel intestinal. En los peces mayores la única alteración interna observada fue el aspecto granuloso del riñón.

Estudio bacteriológico:

El examen microscópico de preparaciones al fresco de los homogenizados de peces y de las lesiones externas o tejidos internos mostró la presencia de bacterias en abundante cantidad. La tinción de Gram de frotis de estas mismas muestras reveló que estas correspondían a bacilos Gram negativos de forma cocobacilar o alargados.

Los cultivos de 3 de las 10 muestras de homogenizados de peces originaron abundantes colonias pequeñas, circulares de borde definido, translúcidas y no pigmentadas. Cultivo de similares características aunque en menor cantidad, fueron obtenidos de 2 de las 6 muestras de tejidos (una en cada lote analizado). Las muestras positivas provinieron de los tres tipos de tejidos analizados: riñón, músculo y piel.

La morfología microscópica de las colonias de Y. ruckeri correspondió a bacilos Gram negativos pleomórficos. En preparaciones al fresco de los cultivos realizados a 20°C se observó además activa motilidad bacteriana, al estudiar este carácter se demostró que los bacilos tenían flagelación perítrica en la tinción de Clark (Clark, 1976).

Los resultados de los estudios de actividad metabólica de estos aislados bacterianos fueron compatibles con Y. ruckeri biotipo 2 (motilidad e hidrólisis de Tween 80 positivas) (Davies y Frerichs, 1989). Para confirmar el diagnóstico bioquímico presuntivo, las cepas fueron ensayadas con el antisuero específico preparado para Y. ruckeri. Todas las cepas compatibles originaron una fuerte reacción de aglutinación. El antisuero empleado en esta reacción fue probado paralelamente con otros cultivos puros relacionados (enterobacteriaceae) y contra otros patógenos bacterianos de peces (Aeromonas hydrophila, Pseudomonas spp., Vibrio anguillarum). En ningún caso se detectaron reacciones cruzadas. Finalmente, para comprobar el diagnóstico bioquímico y serológico las cepas fueron enviadas posteriormente al laboratorio del Dr. Fryer en USA. El informe recibido desde Oregon confirmó la identificación de estos aislados como Y. ruckeri.

Los ensayos de susceptibilidad a los antibióticos mostraron que las cepas de Y. ruckeri recuperadas durante este estudio eran sensibles a 14 antimicrobianos. Entre ellos a: gentamicina (10 μg), estreptomicina (10 μg), neomicina (30μg), kanamicina (30 μ g), ampicilina (100μg), cloramfenicol (34 μg), carbenicilina (100 μg), tetraciclina (30 μg), ácido nalidíxico (30 μg), lincomicinalespectinomicina (50/100 μg) y trimetoprim/sulfametazol (1.25/23.75 μg); medianamente sensibles a cefalotina (30 μg) y resistentes a penicilina (10 UI) y eritromicina (15 μg).

La CIM para penicilina fue de 40 UI/ml y 125150 μ g/ml para eritromicina. Todos los aislados resistentes a la penicilina resultaron ser productores de B-lactamasa.

La presencia de plasmidios fue evidenciada en 3 de las cepas de Y. ruckeri. Dos de ella portaban un plasmidio de 20-26 MDa, compatible con el asociado a virulencia en cepas del serotipo 2 de O'Leary (Bullock y col., .1983, Austin, 1987). La cepa restante alberga un plasmidio de 50 MDa, compatible con el descrito para el serotipo 1 de Hagerman (Austin, 1987). Al caracterizar el perfil de proteínas totales mediante SDS-PAGE se observó que todas las cepas estudiadas poseían un patrón similar (Figura 1).

 

Figura 1. Perfil de proteínas totales de Y. ruckeri (tinción de plata) A: Marcadores de referencia, B Y C: cepas S - 15 y S - 18 respectivamente

De acuerdo a las estadísticas mundiales, Chile se ha convertido en el segundo productor de salmones a nivel mundial. Esta industria generó divisas en cifras cercanas a los US$ 300 millones en 1993. En este contexto parece imperioso contar con información científica que permita detectar, corregir e incluso prevenir las pérdidas ocasionadas por las patologías transmisibles que puedan afectar al desarrollo de esta importante actividad económica.

La necesidad de obtener esta información motivó el presente estudio orientado a identificar y caracterizar el eventual rol de las patologías infecciosas de origen bacteriano en la morbimortalidad de salmones cultivados en varios planteles de las regiones X y XI de Chile. La EBR, es una infección bacteriana importante que afecta a la industria salmonícola a nivel mundial. Esta patología, cuyo agente etiológico es Y. ruckeri, origina pérdidas masivas (entre 30 a 70% de los peces afectados) durante su fase aguda (Rodgers y col., 1991).

En la literatura nacional existe sólo un par de informes sobre aislamiento de esta bacteria en peces, el primero de Enriquez y Zamora (1987) en carpas (C. carpio) sanas y el segundo en un artículo de difusión relacionado con otras especies silvestres y salmones enfermos. El presente informe confirma dichos hallazgos preliminares en relación a que Y. ruckeri se encuentra en nuestro medio y permite además asociar a este agente con una de las patologías de alta prevalencia, la EBR en salmones en la X y XI regiones de nuestro territorio. En base a los datos presentados la EBR se presenta en nuestro medio en los dos cuadros típicos descritos en la literatura. El primero con compromiso sistémico en peces menores, caracterizado por exoftalmia, hemorragia en tejidos y presencia de exudado amarillo a nivel intestinal, y el segundo de tipo crónico observado en peces mayores con presencia de lesiones en la piel (Rodgers y col., 1991).

Los datos de éste y otros estudios dejan de manifiesto que tanto la caracterización clínica como los análisis anatomopatológico son de ayuda relevante en el estudio de las patologías infecciosas de origen bacteriano en peces, pero ni uno ni otro permiten dilucidar con certeza la etiología particular de un proceso de este tipo, en estos huéspedes. Por ejemplo, si se hubiese utilizado el enrojecimiento de la boca como signo marcador para definir la presencia de yersiniosis, los casos reportados en este estudio no hubieran sido detectados, pues este signo no fue observado en ninguno de los peces afectados de esta serie. Por otra parte, es de todos conocido que la respuesta del salmón a la infección bacteriana es esterotipada, es decir cualquiera sea su etiología los cambios patológicos son muy semejantes y a menudo indistinguibles entre sí. Por lo expuesto, este estudio avala la necesidad de contar con métodos microbiológicos para confirmar la presencia de el(los) agente(s) responsable(s) de los cuadros infecciosos de los salmónidos.

Afortunadamente, Y. ruckeri como especie perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, es poco exigente por lo que su aislamiento es fácil de realizar. En general esta bacteria crece sin dificultad en la mayoría de los medios de cultivo y con un mínimo de pruebas bioquímicas se puede llegar a un diagnóstico presuntivo confiable (Tabla 1). El mayor problema que se vislumbra en el diagnóstico confirmativo de la yersiniosis en el salmón es la falta de métodos serológicos en base a antisueros específicos. Esta área deberá ser cubierta pronto ya que la disponibilidad de sistemas de diagnóstico confirmativo de esta patología, que sean aplicables en terreno, es un imperativo para la industria piscícola nacional.

TABLA 1 REACCIONES BIOQUÍMICAS DE LAS CEPAS DE YERSINIA RUCKERI (N = 5)

PRUEBA O SUSTRATO

22°C

    37°C

Motilidad, indol y citrato

+

-

Ureasa, H2S (TSI)

-

-

Descarboxilación y desaminación de lisina

-

-

Descarboxilación de ornitnina

+

+

Glucosa: ácido/gas

+/-

+/-

Lactosa, trehalosa, salicina, sacarosa

-

-

Manitol

+

+

DNAsa, gelatina

+

-

Hidrólisis de Tween 80

+

+ (débil)

El empleo de métodos como el descrito en este trabajo, así como el desarrollo de sistemas de diagnóstico rápido, implica que a futuro se podrá contar con datos epidemiológicos de gran utilidad para orientar el diagnóstico temprano de ésta y otras enfermedades bacterianas o virales del salmón. Ello permitirá implementar las medidas de manejo profilácticas adecuadas y oportunas que impidan la sangría económica que ellas significan para la industria salmonícola nacional.

En conclusión el aislamiento de un agente bacteriano único en las muestras estudiadas, así como, los resultados de caracterización bioquímica y serológica confirma la presencia de Y. ruckeri en varias psicifactorías de las X y XI regiones de Chile. A su vez, la información bacteriológica y molecular presentada en este trabajo, así como otras previas de nuestro laboratorio (Toledo y col., 1993; Portell y col., 1993) sugieren que los aislados de Y. ruckeri de nuestro medio tienen un origen clonal común. Parece lógico por tanto pensar que ellas provienen de una fuente común de contaminación, lo que refuerza la necesidad de realizar estudios epidemiológicos en nuestro medio que generen información básica, imprescindible para implementar adecuadas medidas terapéuticas y profilácticas e impedir la difusión de este microorganismo, tanto en los planteles como en el ecosistema natural. Dichos estudios son ineludibles especialmente cuando parece necesario decidir el uso de alguna de las vacunas disponibles en el mercado internacional. En este caso, ello es trascendente ya que conocer mejor al agente infectante permitirá escoger adecuadamente una de las formulaciones de vacunas que otorgue mayor protección.

El crecimiento generado por este trabajo constituye un reto no sólo para que los productores incluyan el estudio rutinario de la EBR en peces enfermos, sino que también para que los investigadores nacionales generen información en el área que permita conocer la patogenia, tratamiento y diseminación Y. ruckeri en los establecimiento industriales y eventualmente su impacto sobre ecosistemas naturales.

Referencias

ALVIAL E., C. JUILLET, M.E. PINTO. 1985-1986. Estudio comparativo del método acidométrico y yodométrico en la determinación de la betalactamasa en cepas de Haemophillus influenzae y Neisseria gonorrhoae. Boletín del Instituto de Salud Pública de Chile XXVI: 16-22.

AUSTIN B. 1987. In bacterial fish pathogens. Disease in farmed and wild fish, 207-223.

BAUER A., J. KIRBY. 1966. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45:493496.

BIRNBOIM H.C., J. Doly. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nuclei Acids. Res. 7:1513-1523.

BULLOCK G.L., G. MAESTRONE, C. STARLIPER, B. SCHILL. 1983. Potentiated sulfonamide theraphy of enteric redmouth disease. Can. J. Fish. Aquat. Se. 40: 101-102.

CLARK  W.A. 1976. A simplified Leifson flagella stain. J. Clin. Microbiol. 3:632-634.

ENRIQUEZ R., J. ZAMORA 1987. Aislamiento de Yersinia ruckeri de carpas (Cyprinus Carpio) en Valdivia. Arch. Med. Vet. 19 (1):33-36.

EWING W.H. 1986. The genus Yersinia. In: Ewing W.H. (Ed.) Edwards and Ewing's. Identification of Enterobacteriaceae. 4th edn. Elservier Science Publishing Co., Inc., New York pp. 461-478.

DAVIES R.L., G.N. FRERICHS. 1989. Morphological and biochemical diferences among isolates of Yersinia ruckeri obtained from wide geographical creas. J. Fish. Dis. 12: 357-365.

KADO C., S. Liu 1981. Rapid procedure for detection of large and small plasmids. J. Bacteriol. 145: 1365-1373.

LAEMMLI. U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London) 227:680-685.

MCARDLE J.F., C. DOOLEY-MARTIN. 1985. Isolation of Yersinia ruckeri type 1 (Hagerman strain) from golsdfish Carassius auratus (L). Bull. Assoc. Fish. Pathol. 5: 10-11.

MORISSEY J.H. 1981. Silver stain for proteins in polyacrylamide gels: A modified with enhanced uniform sensitivity. Anal. Biochem. 117:307.

PORTELL D.P., G. FIGUEROA, M. TRONCOSO, M.S. TOLEDO, V. SOTO. 1993. Patogenicidad de Yersinia ruckeri en salmonídeos. Anal. Microbiol. 1:41-44.

RUCKER R.R. 1966. Redmouth disease of rainbow trout (Salmo gairdneri) Bull. Inter. Epizoo. 65:825-830.

RODGERS C.J. 1991 a. The usage of vaccination and antimicrobial agents for control of Yersinia ruckeri. J. Fish. Dis. 14:291-301.

RODGERS C.J. 1991b. The control of enteric redmouth disease in fish. Maff, fish Diseases Laboratory, Weymouth, Dorset. DT4 8UB In: Trouts News N° 12:27-30.

SHAM D.F., Il J.A. WASHINGTON. 1991. Antibacterial susceptibility test: dilution methods. In: Balows A., Hausler Jr. W.J.Herrmann K.J. Isemberg H.D., Shadomy H.J. (Eds). Manual of Clinical Microbiology, 4th edn. American Society for Microbiology, Washington D.C. pp. 1105-1125.

TOLEDO M.S., M. TRONCOSO, D.P. PORTELL, G. FIGUEROA. 1993. Brote causado por Yersinia ruckeri en salmonideos en cultivo. Anal. Microbiol. 1:59-62.

Recibido el 5 de enero de 1994, aprobado el 26 de septiembre de 1994.