La leptospirosis es una zoonosis de alta morbilidad, producida por microorganismos pertenecientes al género Leptospira. Los animales silvestres cumplen un importante papel en esta enfermedad (Alston, 1958; Gesell, 1952; Michna, 1970; Reilly y col., 1970; Roth y Knierrem, 1958; Roth, 1961; Stanchi y col., 1987; Szyfres, 1964), actuando como reservorios y/o diseminadores de leptospiras. La mayoría de las investigaciones en animales silvestres se han centrado en el intento de aislamiento de leptospiras o en muestreos serológicos; pero continúan por esclarecerse aspectos tales como la susceptibilidad de algunas especies animales a infectarse y enfermarse con cepas patógenas.
El objetivo de la presente comunicación es el estudio de los efectos clínicos producidos por la inoculación experimental de sarigüeyas (Didelphis albiventris) procedentes de captura, con una cepa de Leptospira interrogans serovar pomona.
Animales: Tomando como parámetro de uniformidad la igualdad de tamaño, de estado físico y edad (todos jóvenes), se eligieron 9 sarigüeyas a partir de capturas realizadas a campo. Los animales fueron mantenidos en cuarentena previa inoculación, verificando ausencia de síntomas clínicos, ingesta de alimento, seronegatividad por la prueba de aglutinación microscópica (MAT) a las cepas de Leptospiras representativas de 11 serogrupos (L. interrogans serovares autumnalis, Akiyami A; canicola, Hond Utrech IV; cynopteri, 3522C; grippolyphosa, Moskva V; hebdomadis, Hebdomadis; copenhageni, Batan 14; pomona, Pomona; pyrogenes, Salinem; wolffi, 3705; tarassovi, Perepelicin; y L. biflexa sv patoc, Patoc l), todas cepas de referencia internacional excepto la cepa Batan 14 que fue aislada por los autores en un trabajo anterior (Stanchi y col., 1987). También fueron negativos los hemocultivos realizados en medio Fletcher y Stuar. Durante el experimento se las alimentó con balanceado comercial para caninos, el que fue suministrado ad libitum.
Cepa: Se trabajó con una cepa de L. interrogans sv pomona, Marcos Paz; patógena para animales de laboratorio. De las 9 sarigüeyas, seis fueron inoculadas con 0,5 ml cada una, partiendo de un cultivo puro de esta cepa en medio Fletcher, por vía intraperitoneal, mientras que tres fueron mantenidas como testigo. Paralelamente y afectos de controlar la patogenicidad de la cepa, 3 cobayos (Cavis porcelus) se inocularon partiendo del mismo cultivo con 0,5 ml cada uno por la misma vía.
Estudios: A los 7, 11, y 16 días postinoculación (p.i.) se realizó bajo anestesia con éter, la extracción de sangre por punción cardíaca. Posteriormente se enfrentaron los sueros por la prueba de MAT partiendo de la dilución 1/10 y continuándose en base 2 hasta título final (Faine, 1982). Se utilizó como antígeno un cultivo en medio Stuar de la cepa inoculada.
En esas mismas fechas se realizaron estudios hematológicos y serológicos que comprendieron: recuento de hematíes, hematocrito (micrométodo), concentración de hemoglobina (método colorimétrico para detectar hemoglobina como cianuro de hemoglobina-540 nm-), recuento de leucocitos, fórmula leucocitaria, fosfatasa alcalina (método colorimétrico de Reitman y Frankel-505 nm-) alanina amino transferasa (ALT) (Transaminasa glutámico Pirúvica-TGP-) (método optimizado con sustrato de p-nitrofenil fosfato-405 nm-), colesterol total (método enzimático de Trinder-505 nm-), y proteínas totales /método de Biuret-540 nm-)* (Davidson I., 1981).
El sacrificio de los animales se realizó bajo el mismo tipo de anestesia y por sangría a blanco; 2 a los 7 días p.i., 2 a los 11 días p.i., y otros dos a los 16 días p.i. Los animales fueron sometidos a una exhaustiva necropsia. Se tomaron muestras de hígado, riñón, bazo y pulmón para estudios histológicos, para los cuales fueron conservados y procesados de acuerdo a las técnicas de rutina y teñidas con hematoxilina eosina. Asimismo, a partir de los mismos órganos y de sangre, se sembraron muestras en medio Fletcher y Stuart. Idéntico procedimiento se realizó con los cobayos.
Por otro lado, cuando fue posible obtener orina, se valoró: pH, presencia de glucosa, cetonas, bilirrubina, sangre y urobilinógeno por el método de tiras comerciales**. Los datos fueron comparados por el estadístico de análisis de varianza (Ledesma, 1980).
__________
Notas
* | Wiener Lab. Argentina volver | ||
** | Mulistix Ames; USA. volver |
Ninguna de las sarigüeyas inoculadas murió a causa de la enfermedad, tampoco fueron aparentes alteraciones del comportamiento o disminución de la ingesta de alimento. Por el contrario, los cobayos utilizados como testigos de patogenicidad de cepa murieron todos al cabo de 5-6 días p.i.
Debido a que no se poseen valores normales para la especie, se tomaron los estudios realizados en el período de cuarentena y del grupo testigo, sin inocular, como valores de referencia.
No se logró el aislamiento de la cepa inoculada a partir de las sarigüeyas, por el contrario, se recuperó de todos los cobayos a partir de distintos órganos sembrados en los medios antes mencionados. La serología practicada en las sarigüeyas se describe en la tabla 1.
TABLA 1 TÍTULOS DE ANTICUERPOS ANTI LEPTOSPIRA INTERROGANS SV POMONA EN SARIGÜEYAS
Animal |
Preinoculación |
7 días* |
11 días* |
16 días* |
1 |
neg |
1/80 |
1/20 |
neg |
2 |
neg |
1/10 |
neg |
neg |
3 |
neg |
1/10 |
neg |
neg |
4 |
neg |
1/80 |
1/40 |
neg |
5 |
neg |
1/40 |
neg |
neg |
6 |
neg |
1/40 |
neg |
neg |
*Postinoculación neg: negativo |
Los estudios anatomopatológicos realizados indicaron ausencia de lesiones macroscópicas a la necropsia, tampoco se encontraron lesiones observables microscópicamente.
Sólo pudieron analizarse las orinas de 4 sarigüeyas (animales sacrificados), dos de ellas a los 7 días p.¡., una a los 11 días p.¡., y otra a los 16 días p.i.; en esta última a la necropsia se encontró la vejiga dilatada conteniendo orina y ocupando la mitad de la cavidad abdominal. Estos datos se encuentran representados en la tabla 2.
TABLA 2 VALORES OBSERVADOS EN ORINAS DE 4 SARIGÜEYAS INOCULADAS CON LEPTOSPIRA INTERROGANS SV POMONA
-- |
7 días p.i. (sarigüeya 1) |
7 días p.i. (sarigüeya 2) |
11 días p.i. |
16 días p.i. |
pH |
6 |
6 |
6 |
5 |
proteínas |
+ + |
trazas |
trazas |
+ |
glucosa |
+ + + |
+ |
- |
- |
urobilinógeno |
6 UE/dl* |
4 UE/dl |
4 UE/dl |
4 UE/dl |
cetonas |
- |
- |
- |
- |
bilirrubina |
- |
- |
- |
- |
sangre |
- |
- |
- |
- |
*Unidades Erlich/dl. |
Los valores hallados en sangre se muestran en la tabla 3. Tanto los valores del hematocrito, recuento de hematíes y hemoglobina descendieron comparados con los testigos; el número de leucocitos por el contrario aumentó (valores éstos de significación estadística P < 0.05). No se observó variación en la fórmula leucocitaria. La fosfatasa alcalina presentó una elevación en todos los animales pero al compararlo con los valores presentes en los testigos, estos parámetros no fueron de significación estadística.
TABLA 3 VALORES HEMATOLÓGICOS ENCONTRADOS EN SARIGÜEYAS (DIDELPHIS ALBIVENTRIS) INOCULADAS CON L. INTERROGANS SV POMONA, MARCOS PAZ
-- | Preinoculación* | 7 días | 11 días | 16 días | Signific. estadist. | ||||||||||
Prom. | D.S | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | ||
Hematíes** | 4,74 | 0,35 | 3,52 | 4,56 | 4,50 | 3,80 | 4,20 | 3,55 | 4,10 | 4,24 | 4,10 | 3,90 | 3,63 | 3,90 | SI |
Hematocrito (%) | 43,0 | 3,0 | 32,0 | 41,5 | 41,0 | 34,5 | 38,0 | 32,0 | 37,0 | 39,0 | 37,0 | 36,0 | 33,0 | 35,5 | SI |
Hemoglobina (g-dl) | 13,1 | 0,95 | 9,92 | 12,2 | 12,4 | 10,4 | 10,5 | 9,70 | 10,9 | 11,1 | 10,9 | 11,0 | 8,2 | 9,3 | SI |
Leucocitos*** | 9,72 | 0,96 | 13,0 | 23,5 | 14,0 | 15,7 | 16,8 | 12,0 | 11,3 | 12,3 | 13,3 | 14,0 | 14,5 | 14,7 | SI |
Neutrófilos (%) | 52 | 8 | 38 | 62 | 60 | 53 | 60 | 56 | 52 | 60 | 54 | 57 | 58 | 52 | NO |
Eosinófilos (%) | 7 | 2,3 | 5 | 2 | 5 | 3 | 4 | 6 | 4 | 6 | 6 | 4 | 2 | 14 | NO |
Basófilos (%) | 2 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 2 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | NO |
Linfocitos (%) | 35 | 7,5 | 53 | 32 | 33 | 42 | 32 | 35 | 40 | 32 | 37 | 35 | 34 | 32 | NO |
Monocitos (%) | 4 | 3,5 | 3 | 4 | 2 | 1 | 4 | 3 | 2 | 2 | 2 | 4 | 6 | 2 | NO |
F. alcalina**** | 227,8 | 210,0 | 238 | 447 | 460 | 620 | 440 | 360 | 331 | 667 | 620 | 628 | 298 | 815 | NO |
Colesterol (g/%) | 2,18 | 0,26 | 1,23 | 1,50 | 1,92 | 1,70 | 2,10 | 1,40 | 2,10 | 1,44 | 1,23 | 1,70 | 1,02 | 0,59 | NO |
GPT (ALT) (mU/ml) | 12,7 | 1,0 | 15 | 21 | 13 | 14 | 21 | 25 | 9 | 11 | 17 | 8 | 7 | 7 | NO |
Prot-totales (g/%) | 6,3 | 0,3 | 6,44 | 5,75 | 5,95 | 5,57 | 6,2 | 6,27 | NR | NR | NR | NR | 5,52 | 5,75 | NO |
**** Valores de 6 animales en cuarentena y 3 controles **** En millones por mm 3 **** Miles por ul **** mU/ml NR: No realizado |
Se ha reconocido que la causa más común de muerte en leptospirosis es la falla renal, habiendo en casi todas las formas de esta enfermedad, evidencia de efectos tóxicos en el riñón (Alston, 1958); es más, algunos autores (Hathaway, 1981; Hutchison, 1946) han enfatizado que la nefritis intersticial es la lesión fundamental que es encontrada en pacientes que han sobrevivido hasta que la inflamación haya tenido oportunidad de desarrollarse (Brito y col., 1979). Los cambios inflamatorios, según Sitprija (1968) representan un hallazgo que ocurre tardíamente en la enfermedad. Más aún, Van Der Hoeden (1946) encontró este tipo de nefritis en roedores infectados sólo en forma ocasional. En las sarigüeyas inoculadas no se observaron lesiones en los estudios renales tanto macro como microscópicamente, aunque las orinas presentaron positividad a las pruebas de proteínas y/o glucosa. Esta proteinuria según Feijin y Anderson (1975) es una anormalidad muy frencuente y de características leves, pudiendo ser el reflejo de un estado febril. Estos mismos autores mencionan que los animales que recuperan su función renal, lo hacen con una marcada diuresis, a lo que puede deberse el hallazgo de un animal a los 16 días p.i. con la vejiga totalmente dilatada.
La presencia de urobilinógeno levemente elevado en todas las orinas analizadas puede deberse a una posible insuficiencia hepática o un síndrome hemolítico; el compromiso del hígado no pudo ser observado ni microscópica ni macroscópicamente, hecho que concuerda con lo reportado por otros autores (Arean, 1962; Feijin y Anderson, 1975).Si se consideran los datos observados en sangre, se produce una disminución estadísticamente significativa (P < 0,05) tanto en los valores del recuento de glóbulos rojos, hematocrito y también en la concentración de hemoglobina, aunque no se buscó hemoglobina libre en el plasma. Las razones de la anemia no son claras, según Faine (1982) la hemólisis es producida por algunas serovares, principalmente pomona, pero no por otras. La ALT, se eleva levemente llegando en tres animales a superar las 20 mU/ml (Feijin y Anderson, 1975), mientras que la fosfatasa alcalína se eleva en un caso hasta 815 mU/ml. No se observan variaciones importantes en la concentración de colesterol y de proteínas totales entre los animales testigos y los inoculados.
La patogénesis de la nefritis inducida por leptospiras ha sido atribuida a la hipovolemia causada por daño celular, daño vascular y hemorragia (Brito y col., 1979). Una severa disminución del número de glóbulos rojos, puede brindar lesiones a los tejidos debido a hipoxia, y la presencia de hemoglobinemia puede causar nefrosis hemoglobinémica (Flink, 1947). Por otro lado, Thompson y col. (Thompson y Manktelow, 1986; Thompson y Marshall, 1986; Thompson y Manktelow, 1989) afirman que pomona no produce destrucción de células rojas y consecuentemente anemia.
La leucopenia indicada por algunos autores (Alston, 1958; Turner, 1973) previa a la leucocitosis, no fue observada en sarigüeyas, produciéndose un marcado aumento en el número de células blancas, pero sin variación en las fórmulas leucocitarias. Estas observaciones coinciden con las de Nicodemo y col. (1989) en humanos; y otros autores (Feijin y Anderson, 1975; Russell, 1959) observan que el conteo total y diferencial de células blancas es usualmente normal en los casos anictéricos.
Se observó seroconversión a los 7 días p.i. en todos los animales, valores que se negativizaron a los 16 días p.i. La imposibilidad de recuperar la cepa inoculada a partir de riñón, pudo ser debido a la no utilización de animales de laboratorio para su reaislamiento, ya que factores inhibidores presentes en los tejidos (Hathaway, 1981) de las sarigüeyas impedirían su desarrollo. Por otro lado, la posible exposición previa con leptospiras, con producción de anticuerpos neutralizantes del microorganismo pudo impedir el crecimiento en los medios de cultivo. Las sarigüeyas procedían de una zona donde previamente se aisló la serovar copenhageni (Stanchi y col., 1987) a partir de ratas que frecuentaban el mismo ecosistema. Si bien estos animales resultaron negativos previo a la inoculación, se partió para la técnica de MAT de la dilusión 1/10, que no excluye que títulos inferiores pudieran haber estado presentes.
La inoculación de una cepa patógena de L. interrogans sv pomona, Marcos Paz, en sarigüeyas, puede interpretarse de diversas formas de acuerdo a la posibilidad de una exposición a leptospiras previa al experimento. Las reinfecciones con la misma serovar son muy poco frecuentes, pero sí es posible con distintas serovares (Alston, J., 1958). La escasa sintomatología clínica especialmente en el comportamiento o ingesta de alimento, puede ser debida a esta circunstancia; al mismo motivo podría deberse la dificultad de aislamiento de la cepa inoculada. Por otro lado, también sería posible que esta especie animal posea resistencia natural a L. interrogans sv pomona, hecho no estudiado en este experimento.
Si bien las sarigüeyas no han mostrado sintomatología clínica, se observó disminución del número de hematíes, del hematocrito, y en los valores de hemoglobina, con una elevación de la cifra de leucocitos, todos con significación estadística (P < 0,05). Por otro lado, al cabo de 16 días p.i. ya no se encuentran niveles de anticuerpos superiores a la dilución 1/10, lo que es observable frecuentemente en aislamientos a partir de animales silvestres, de cepas de leptospiras en animales seronegativos.
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Recibido el 10 de octubre de 1990, aprobado el 19 de marzo de 1991. |