La rinotraqueítis infecciosa bovina (RIB) es una enfermedad causada por el virus herpes bovino tipo 1 (VHB-1), agente que se asocia con numerosos cuadros clínicos del bovino (Kahrs, 1977; Gibbs y Rweyemamu, 1977). Los antecedentes generales y nacionales sobre la enfermedad han sido revisados por Berríos, 1982; Moraga, 1982, destacándose para el país altos valores de prevalencia y una probable presentación de cuadros clínicos de baja intensidad (Moraga, 1982; Hochstein-Mintzel y col., 1986), lo cual concuerda con antecedentes obtenidos al inocular experimentalmente 14 terneros, con tres cepas del VHB-1 aisladas en Chile (Moraga y col., 1987; Zurita y col., 1988).
Dentro de las complicaciones de RIB destaca, por su impacto económico, el aborto, que puede ser consecuencia de la infección natural o de la vacunación con cepas de VHB-1 modificadas, al utilizar la vía intramuscular (McKercher y Wada, 1964). Luego de la infección primaria puede establecerse viremia pasajera, antes que aparezcan anticuerpos específicos (Van Der Matten y Miller, 1985) o bien el virus es transportado por los monocitos y luego adsorbidos a poli morfonucleares (Nyaga y McKercher, 1979); también existen evidencias de que el virus puede usar puentes intercelulares para propagarse de célula en célula, lo cual explicaría su diseminación en presencia de altos títulos de anticuerpos específicos (Pastoret y col., 1982). Cualquiera que sea el mecanismo de diseminación, el VHB-1 llegaría a las vellosidades cotiledonares, donde se localiza inicialmente para luego infectar el epitelio trofoblástico (Dellers, 1975), desde donde pasa el feto por su sistema digestivo y respiratorio (Chow y col., 1964).
El tiempo transcurrido entre la infección materna y la fetal es variable, pudiendo fluctuar entre 8 días (Wilson, 1974) y varios meses (Dellers, 1975). El aborto por VHB-1 puede producirse en cualquier estado de gestación, siendo más común entre el 4° y 7° mes de preñez (Kahrs, 1977). Los fetos pueden permanecer en el útero por varios días, expulsándose un animal autolítico (Kahrs, 1977). En el feto abortado se observa necrosis focal en casi todos los tejidos, siendo el hígado el órgano donde se evidencia mejor y con mayor frecuencia (Kennedy y Richards, 1964; Straub y col., 1982). Cuerpos de inclusión intranucleares son visibles fácilmente en el hígado de fetos recién muertos, aunque también pueden observarse en glándulas adrenales, aun después de la autólisis (Kahrs, 1977).
Dependiendo del estado de los fetos abortados, el virus puede ser aislado de órganos fetales y de tejido placentario, obteniéndose, en general, concentraciones mayores en este último (Kendrick y col., 1971); de igual modo se pueden pesquisar antígenos virales mediante la técnica de inmunofluorescencia directa (Reed y col., 1971; Kirkbride y col., 1973).
Los antecedentes sobre la infección natural y los obtenidos luego de inoculaciones experimentales con cepas del VHB-1, demuestran claramente que este agente causa aborto; sin embargo, para que éste se produzca deben coexistir varios factores, algunos derivados del huésped y su estado inmunitario y probablemente otros relacionados con la virulencia y patogenicidad de cada cepa en particular. Considerando lo anterior, el objetivo principal de este estudio es reunir más información sobre el efecto de cepas de VHB-1 aisladas en Chile, en bovinos susceptibles, especialmente en cuanto a su potencialidad abortígena.
Financiado por proyecto FONDECYT 369-87. |
Animales experimentales
Se seleccionaron 8 vaquillas overo negro de 2 a 3 años de edad, con gestación entre 2 y 8 meses y serológicamente negativas a VHB-1, brucelosis y leptospirosis. Los animales se mantuvieron en cuarentena por 20 días, durante los cuales se vacunaron contra carbunclo sintomático, edema maligno, hemoglobinuria infecciosa y enterotoxemia, además fueron desparasitados contra parásitos gastrointestinales y distomatosis hepática.
Controles previos al desafio viral
Se realizaron dos exámenes serológicos con un intervalo de 15 días, para controlar RIB, brucelosis y leptospirosis; Además, el día 0 se extrajo muestras de exudado nasal para examen virológico y bacteriológico. Durante 4 días preinoculación se registró temperatura rectal, frecuencia respiratoria, frecuencia cardiaca, frecuencia ruminal, características de mucosas, exudado nasal y ocular, el comportamiento y la actitud de los animales; este control clínico se realizó una vez al la a las 9 hrs.
Cepa viral
Para reproducir la rinotraqueítis infecciosa bovina se utilizó la cepa del VHB-1, FAF-82, proveniente de un neonato muerto a las 2 horas del nacimiento (Berríos y col., 1985) y luego de reaislarlo desde terneros inoculados experimentalmente (Moraga y col., 1987). Para la preparación de la suspensión viral y los exámenes virológicos correspondientes se empleó una línea celular de riñón fetal equino.
Diseño experimental
Los animales se dividieron en dos grupos, el grupo I fue inoculado por vía intramuscular, y el grupo II por vía endonasal. Tres meses después de finalizar el experimento con el grupo I se inoculó a las vaquillas del grupo II. Las vaquillas del grupo I (1-M, 40-M, 2-M y 42-M) con gestación aproximadamente de 2, 3, 4 y 8 meses, respectivamente, se inocularon con 5 ml de suspensión vira] (título 106,5/ml DICT50); Las vaquillas del grupo II (1019 N, 1038-N y 1042-N) con gestación de 6,5; 6,5; y 5,5 meses, respectivamente, se inocularon por vía endonasal con 5 ml por ollar de una suspensión viral con título 10 7,1/ml DICT50. La vaca 38-M con gestación de 5 meses se dejó como control, inoculándose por vía intramuscular con 5 ml de sobrenadante de un cultivo celular no infectado. Los animales infectados se mantuvieron en un pabellón aislado, y el control en el hospital de animales mayores del Departamento de Ciencias Clínicas.
Controles postinoculación
Se continuó con el examen clínico, iniciado 4 días previos a la inoculación, hasta 14 días postinoculación (pi). Cada 2 ó 3 días, desde el día 10 hasta el día 23 pi, se tomaron muestras de secreción nasal, ocular y vaginal, para aislamiento viral. Cada 3 ó 4 días hasta el día 14 pi y una vez por semana, hasta 15 días postparto, se tomaron muestras de sangre para estudio serológico. El día 7 pi se hizo un control bacteriológico en muestras de exudado nasal.
Muestras de órganos de los terneros del grupo I (pulmón, riñón, bazo, hígado, cerebro y ganglios) fueron procesados en los laboratorios de virología, histología y bacteriología.
El virus aislado de vaquillas y de los fetos expuestos fue identificado por su efecto citopático e índice neutralizante, según técnicas convencionales (Jenney y Wessman, 1976).
Los exámenes de inmunofluorescencia directa fueron realizados con muestras de tejidos de terneros y placenta, con los cuales se hizo impresiones en un portaobjetos, fijadas en acetona fría y tratadas con suero anti-VHB-1 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (Maturana, 1981); la observación se realizó en un microscopio de fluorescencia Leitz Ortholux.
Las 7 vaquillas inoculadas con el VHB-1 cepa FAF-82 cursaron con un cuadro respiratorio leve de corta duración, observándose mayor intensidad de los signos clínicos en las vaquillas infectadas por vía endonasal (grupo II).
La temperatura rectal aumentó levemente en los 7 animales inoculados y los valores promedio fueron ligeramente mayores en el grupo II (cuadro 1).
CUADRO 1. RINOTRAQUEITIS INFECCIOSA BOVINA. VARIACIONES EN LA TEMPERATURA RECTAL Y FRECUENCIA RESPIRATORIA DE 7 VAQUILLAS INOCULADAS CON VHB-1
Días pre y post- inoculación |
Temperatura rectal (C°) |
Frecuencia respiratoria (Movimientos por minuto) |
||||||
Grupo I |
Grupo ll |
Grupo l |
Grupo II |
|||||
S |
S |
|
S |
S |
||||
-4 |
38,6 |
0,2 |
38,8 |
0,1 |
32 |
5 |
40 |
9 |
-3 |
38,6 |
0,1 |
38,8 |
0,2 |
30 |
6 |
35 |
5 |
-2 |
38,5 |
0,2 |
38,8 |
0,1 |
30 |
5 |
30 |
2 |
-1 |
38,6 |
0,1 |
38,6 |
0,2 |
30 |
4 |
34 |
9 |
0 |
38,6 |
0,1 |
38,5 |
0,1 |
30 |
2 |
37 |
9 |
1 |
39,5 |
0,7 |
38,5 |
0,1 |
37 |
11 |
31 |
5 |
2 |
39,0 |
0,8 |
39,9 |
0,7 |
35 |
8 |
43 |
7 |
3 |
39,4 |
0,9 |
39,8 |
0,9 |
39 |
7 |
35 |
6 |
4 |
38,8 |
0,6 |
39,6 |
0,5 |
38 |
7 |
37 |
4 |
5 |
38,7 |
0,5 |
39,0 |
0,4 |
33 |
6 |
36 |
3 |
6 |
38,7 |
0,4 |
38,5 |
0,2 |
31 |
6 |
23 |
1 |
7 |
38,7 |
0,5 |
38,6 |
0,1 |
31 |
4 |
22 |
0 |
8 |
38,6 |
0,3 |
38,4 |
0,2 |
31 |
6 |
27 |
3 |
9 |
38,5 |
0,1 |
38,5 |
0,3 |
30 |
7 |
28 |
2 |
10 |
38,4 |
0,2 |
38,6 |
0,2 |
31 |
6 |
30 |
2 |
11 |
38,6 |
0,3 |
38,7 |
0,2 |
29 |
3 |
29 |
2 |
12 |
38,5 |
0,2 |
38,5 |
0,1 |
27 |
3 |
31 |
4 |
13 |
38,5 |
0,1 |
38,6 |
0,1 |
28 |
3 |
30 |
3 |
14 |
38,7 |
0,1 |
38,5 |
0,2 |
28 |
1 |
26 |
2 |
Los signos respiratorios fueron inespecíficos y poco evidentes. La tos fue seca y esporádica, en accesos de corta duración, detectándose desde el día 3 ó 4 hasta el 7 ó 12 pi en el grupo I y desde el día 2 hasta el 10 ó 12 pi en el grupo II. La intensidad de los movimientos respiratorios y del soplo laringotraqueal, aumentó en todos los animales, desde el día 2 ó 3 hasta el 8 u 11 pi. En las vaquillas de ambos grupos hubo variaciones, poco significativas, en la frecuencia respiratoria, observándose un leve aumento sobre los rangos normales, al considerar los valores promedio de cada grupo (cuadro l). Dos animales del grupo I (2-M y 40-M) cursaron con rinitis leve, caracterizada por congestión y presencia de pústulas de pequeño tamaño en la mucosa de una o ambas fosas nasales, las cuales permanecieron desde el día 2 ó 3 hasta el 6 ó 7 pi; En las vaquillas 2-M, 40-M y 42-M se apreció secreción nasal bilateral de tipo seromucoso durante el día 5 y 6 pi, tornándose mucopurulenta en la 42-M desde el día 7 al 10 pi. Los 3 animales del grupo II cursaron con hiperemia moderada de la mucosa nasal y pequeñas pústulas blanquecinas, más evidentes que las del grupo I, las cuales se observaron desde el día 2 ó 3 hasta el 5 u 8 pi; el exudado nasal fue mucoso o mucopurulento en los 3 animales desde el día 2 ó 3 hasta el 7 ó 10 pi. Mediante el cultivo bacteriológico de exudado nasal, extraído el día 7 pi, no se detectó desarrollo de bacterias patógenas.
En los animales desafiados con VHB- 1, no hubo alteraciones significativas en conjuntiva y mucosa vaginal. Dentro de las constantes fisiológicas controladas, la frecuencia cardiaca y ruminal se mantuvieron dentro de los rangos normales para la especie y edad de los animales durante todo el período de control clínico. La observación diaria de las vaquillas no indicó cambios en el comportamiento y actitud atribuibles al VHB-1 durante el período que duró el ensayo.
En 3 de las 4 vaquillas inoculadas por vía intramuscular y las 3 del grupo II inoculadas por vía endonasal, se aisló e identificó el VHB-l, a partir de muestras obtenidas de secreción nasal (cuadro 2). No se aisló el VHB-1 de muestras de mucosa vaginal de las 4 vaquillas del grupo I; en el grupo 11 hubo aislamiento viral el día 7 pi. De secreciones oculares hubo aislamiento viral el día 7 y 14 en la vaquilla 1-M y el día 14 pi en la 2-M; en el grupo II los días 2, 4, 9 en la vaquilla 1042N, 1038N y 1019N, respectivamente.
CUADRO 2. RINOTRAQUEÍTIS INFECCIOSA BOVINA. AISLAMIENTO DEL VHB-1 EN SECRECIONES NASALES OBTENIDAS ENTRE LOS DÍAS 0 Y 23
Identificación vaquillas |
Días postinoculación |
|||||||||||
0 |
1 |
2 |
4 |
7 |
9 |
11 |
14 |
16 |
18 |
21 |
23 |
|
1-M |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
1-M |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
40-M |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
42-M |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
1042 N |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
1038 N |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
1019 N |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
o Día en que se inoculó a los animales - Muestra negativa + Muestra positiva |
En todos los animales inoculados se comprobó, mediante seroneutralización, seroconversión para VHB-1, la cual se manifestó a partir del día 7 pi en el grupo I y del día 9 pi en el grupo II. Los títulos máximos se obtuvieron desde el día 11 a 14 pi, fluctuando entre 45 y 64 y se mantuvieron hasta el día 42 ó 49 en el grupo I y hasta el día 21 pi en el grupo II; bajando posteriormente con o sin fluctuaciones (cuadro 3).
CUADRO 3. RESPUESTA SEROLÓGICA DE 7 VAQUILLAS INOCULADAS CON VHB-1
Días posti- noculación |
Identificación de vaquillas y títulos serológicos1 |
||||||
I-M |
2-M |
40-M |
42-M |
1042-N |
1038-N |
1019-N |
|
02 |
< 2 |
< 2 |
< 2 |
< 2 |
< 2 |
< 2 |
< 2 |
4 |
< 2 |
< 2 |
< 2 |
< 2 |
< 2 |
< 2 |
< 2 |
7 |
3 |
6 |
3 |
16 |
< 2 |
< 2 |
< 2 |
9 |
16 |
22 |
16 |
22 |
11 |
8 |
6 |
11 |
32 |
64 |
32 |
32 |
32 |
16 |
32 |
14 |
45 |
64 |
45 |
64 |
45 |
45 |
45 |
21 |
45 |
64 |
45 |
64 |
45 |
45 |
45 |
28 |
45 |
64 |
45 |
64 |
22 |
22 |
16 |
35 |
45 |
64 |
45 |
643 |
16 |
22 |
22 |
42 |
45 |
64 |
45 |
|
22 |
16 |
22 |
49 |
32 |
64 |
16 |
|
22 |
16 |
22 |
56 |
32 |
32 |
16 |
|
11 |
22 |
11 |
70 |
22 |
32 |
16 |
|
16 |
16 |
11 |
77 |
22 |
32 |
16 |
|
11 |
16 |
11 |
84 |
22 |
32 |
16 |
|
16 |
223 |
163 |
91 |
6 |
11 |
16 |
|
113 |
|
|
98 |
6 |
11 |
16 |
|
|
|
|
105 |
6 |
11 |
16 |
|
|
|
|
112 |
6 |
11 |
16 |
|
|
|
|
119 |
6 |
11 |
11 |
|
|
|
|
126 |
6 |
11 |
11 |
|
|
|
|
133 |
6 |
11 |
11 |
|
|
|
|
140 |
6 |
11 |
11 |
|
|
|
|
147 |
6 |
113 |
11 |
|
|
|
|
154 |
3 |
|
11 |
|
|
|
|
161 |
3 |
|
11 |
|
|
|
|
168 |
3 |
|
11 |
|
|
|
|
175 |
2 |
|
6 |
|
|
|
|
182 |
2 |
|
63 |
|
|
|
|
189 |
2 |
|
|
|
|
|
|
194 |
2 |
|
|
|
|
|
|
201 |
23 |
|
|
|
|
|
|
1 Valor recíproco de la mayor dilución de suero que neutraliza 100 DICT50 de virus. 2 Día en que se inoculó a los animales. 3 Día en que se tomó la última muestra de cada vaquilla. |
La vaquilla 38-M, utilizada como testigo, parió un ternero clínicamente sano y no presentó signos clínicos, seroconversión y eliminación de VHB-1. No hubo aborto en ninguna de las vaquillas inoculadas con VHB-1; sin embargo, la 2-M y 42-M tuvieron parto prematuro cercano a la fecha de término, el día 146 y 11 pi, respectivamente. Ambos terneros murieron dentro de las primeras 6 horas postparto, sin observarse lesiones macroscópicas en la necropsia. En los dos casos, mediante el empleo de pruebas bacteriológicas estándar, se aisló Brucella abortus de muestras de contenido estomacal.
Las vaquillas l -M y 4-M tuvieron parto a término, la 1-M el día 199 pi, un ternero con malformaciones en el miembro anterior derecho; y la 40-M el día 175 pi, un ternero normal que fue sacrificado a las 24 horas de vida.
El VHB-1 se aisló a partir de todas las muestras, obtenidas de diversos tejidos, del ternero de la vaca 2-M y enfrentado a un suero de referencia anti -VHB-1 se obtuvo un título seroneutralizante de 16. En las muestras de los tres terneros restantes no se logró aislar el VHB-1.
La prueba de inmunofluorescencia directa, indicó fluorescencia específica para el VHB-1, con una intensidad de 1 ó 2+, en todas las muestras de los cuatro terneros de las vaquillas inoculadas por vía intramuscular.
En los órganos estudiados no se encontraron lesiones histológicas, exceptuando muestras de pulmón, del ternero de la vaquilla 2-M, en el cual se detectó alteraciones correspondientes a neumonitis atípica; sin embargo, se observaron cuerpos de inclusión intranucleares en muestras de placenta de las cuatro vaquillas del grupo I y en hígado, riñón y pulmón de los terneros respectivos.
Las tres vaquillas inoculadas por vía endonasal tuvieron parto a término de terneros clínicamente normales.
La respuesta clínica que se indujo experimentalmente en las 7 vaquillas fue leve, con signos respiratorios inespecíficos, cursando algunos animales con rinitis y pequeñas pústulas blanquecinas, lesiones que son más características de rinotraqueítis infecciosa bovina; Sin embargo, fueron poco evidentes como para atribuirlas con certeza a esta enfermedad. En general, el cuadro clínico fue más marcado en las vaquillas inoculadas por vía endonasal, lo cual concuerda con los antecedentes aportados por Chow y col. (1964) y Kendrick y Straub (1967); situándose en una posición intermedia entre las vaquillas inoculadas por vía intramuscular (cuadro clínico más leve) y la respuesta obtenida en terneros inoculados con la misma cepa del VHB-1 (Moraga y col., 1987). Por lo tanto, influiría en la intensidad de los signos clínicos, la vía de infección, la edad de los animales y probablemente la patogenicidad y virulencia de la cepa de VHB-1.
De los antecedentes clínicos obtenidos en este estudio, el período durante el cual se aisló VHB-1 de exudado nasal (cuadro 2) y las variaciones en los títulos de anticuerpos seroneutralizantes anti-VHB1 (cuadro 3), se infiere que el diagnóstico de RIB, en casos de la enfermedad natural, podría establecerse mediante el aislamiento viral de muestras de exudado nasal durante los primeros 6 a 8 días de iniciados los signos clínicos, concordando con lo descrito por McKercher (1963), o bien, mediante el estudio serológico de muestras tomadas durante el cuadro clínico y 7 a 10 días después, período en el cual habría seroconversión o un aumento en los títulos seroneutralizantes. El diagnóstico de un brote de RIB, en un rebaño, será fundamental para sospechar del VHB-1 como agente causal de abortos, el cual puede producirse durante el cuadro clínico o hasta 100 días después (Wilson, 1974; Dellers, 1975; Kahrs, 1977).
La cepa FAF-82 del VHB-1 no produjo aborto en las vaquillas inoculadas. No obstante, dos de ellas tuvieron un parto prematuro con muerte de los terneros en las primeras horas de vida. En ambos casos se aisló Brucella abortus de muestras de contenido abomasal y las vacas resultaron positivas a las pruebas serológicas correspondientes que se efectuaron postparto; estos dos animales pudieron infectarse en su lugar de origen previo a la obtención de la primera muestra, o bien entre las dos muestras obtenidas, con un intervalo de 15 días, para el control serológico de brucelosis, al cual resultaron negativas posiblemente por estar incubando la enfermedad. La otra alternativa es que la infección ocurriera en el lugar de experimentación, antes o después del segundo control serológico, efectuado 5 días después de la llegada, esta posibilidad es menos probable que la anterior, dado que los animales se mantuvieron en un lugar aislado donde previamente no se estabularon vacas.
Considerando los antecedentes recién expuestos, no puede atribuirse con certeza el nacimiento prematuro y muerte posterior de los dos terneros al efecto del VHB-1; Sino más bien, podría estar determinado por el efecto de Brucella abortus, agente reconocidamente patógeno. Es consistente con este planteamiento el que las dos vacas restantes, inoculadas con VHB-1 por vía intramuscular, tuvieran parto a término y que en los terneros sacrificados no se aisló Brucella abortus y sí, como se discute posteriormente, hubo evidencias de infección con VHB-1; de igual manera, las tres vacas inoculadas por vía endonasal resultaron negativas a Brucella abortus y cursaron con signos que corresponden al efecto de VHB-1, sin aborto y con nacimiento de terneros normales; sin embargo, tampoco puede descartarse que, en estos dos casos, el VHB-1 y Brucella abortus actuaran sinérgicamente y, si así fuere, llama aún más la atención que estas vacas no abortaran.
Las referencias obtenidas de la enfermedad natural y el resultado de inoculaciones experimentales con cepas de VHB-1 e incluso del logrado con cepas vacunales modificadas, inoculadas por vía intramuscular o endovenosa, indican que la probabilidad de producir aborto es alta (McKercher y Wada, 1964; Kendrick y col., 1971; Kendrick, 1973; Miller y col., 1989); Sin embargo, la cepa FAF-82 del VHB-1 no causó aborto en ninguna de las 7 vaquillas, aislándose el agente viral en las muestras de los tejidos provenientes de un ternero y detectándose cuerpos de inclusión intranucleares y positividad en las pruebas de inmunofluorescencia directa en las muestras de los 4 terneros nacidos de las vaquillas inoculadas por vía intramuscular. Estos antecedentes indican que hubo infección fetal aunque sin encontrar las lesiones histológicas señaladas como frecuentes y características para la infección por VHB-1 (Kennedy y Richards, 1964; Straub y col., 1982; Muñoz y col., 1989). El paso del V1413-1 al feto, la ausencia de lesiones y aborto, sugiere que la cepa FAF-82 del VHB-1 tiene baja potencialidad abortígena.
En países donde predominan las explotaciones bovinas extensivas, las tasas de prevalencia tienden a ser altas, con pocos antecedentes clínicos de RIB y sus consecuencias como el aborto (Moraga, 1982). Referencias provenientes de países que reúnen esta característica como Nueva Zelanda y Australia, indican que tampoco se ha logrado provocar aborto con cepas del VHB-1 (Alían y col., 1975; Durham y col., 1975).
Evidencias más recientes, que surgen del análisis genómico con enzimas de restricción y antigénico con anticuerpos monoclonales, han permitido clasificar al VHB-1 en varios subtipos, que estarían asociados con efectos diferentes sobre el bovino (Friedli y Metzler, 1987; Miller y col., 1988; Studdert, 1989). De acuerdo con estos antecedentes, es posible que algunas cepas del VHB-1 causen aborto, y otras, como podría ser la FAF-82, no tienen esta potencialidad; en este sentido, es sugerente la detección de diferencias antigénicas recíprocas, por cinética de neutralización, entre esta cepa y la de referencia Los Angeles de origen respiratorio (Celedón, 1987).
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Recibido el 21 de agosto de 1990, aprobado el 31 de octubre de 1990. |