Trabajos Originales

  • Aplicación de la técnica de hemólisis radial simple para el diagnóstico serológico del virus herpes equino tipo 1

Resumen

La técnica de hemólisis radial simple (HRS) fue estandarizada para determinar anticuerpos específicos contra VHE–1.

El antígeno se desarrolló de acuerdo con la metodología señalada por Klingeborn y Dinter; en el resto de la técnica el procedimiento seguido se basó en la adsorción del antígeno a eritrocitos equinos mediante enlace químico con Cl3 y Cr.

Se analizaron 32 sueros por HRS y seroneutralización (SN). Se determinó el coeficiente de correlación entre los diámetros de áreas de hemólisis y títulos de anticuerpos seroneutralizantes encontrán dose que el mismo sé comporta con un valor significativo de p < 0,01. Se realizó la recta de regresión.

Debido a que la sensibilidad y especificidad de HRS y SN son comparables, se confirma la utilidad de la HRS como una técnica de diagnóstico rápido alternativa.

Palabras claves: virus, equino, serología, hemólisis radial simple.

Abstract

The single radial hemolysis technique (SRH) was standarized in order to demostrate specific antibodies against equine herpes–virus type 1 (EHV–1). Antigen was prepared according with Klingeborn and Dinter. Additionaly the antigen was adsorbed to red blood cells with C13 Cr.

A total of 32 serum samples were analysed with both SRH and seroneutralization (SN). A correlation coefficient was determined between values of hemolysic zone diameters and serum neutralization antibody titers. The value p < 0.01 was significative. The corresponding regression line was graphicated. Single radial hemolysis demostrated to be an useful technique for rapid diagnosis. Beside, specificity and sensitivity were equivalent that those SN. As a consequence SRH could be a reliable alternative to SN.

Key words: virus, equine, serology, single radial hemolysis.

Abstract

La técnica de hemólisis radial simple (HRS) fue estandarizada para determinar anticuerpos específicos contra VHE–1.

El antígeno se desarrolló de acuerdo con la metodología señalada por Klingeborn y Dinter; en el resto de la técnica el procedimiento seguido se basó en la adsorción del antígeno a eritrocitos equinos mediante enlace químico con Cl3 y Cr.

Se analizaron 32 sueros por HRS y seroneutralización (SN). Se determinó el coeficiente de correlación entre los diámetros de áreas de hemólisis y títulos de anticuerpos seroneutralizantes encontrán dose que el mismo sé comporta con un valor significativo de p < 0,01. Se realizó la recta de regresión.

Debido a que la sensibilidad y especificidad de HRS y SN son comparables, se confirma la utilidad de la HRS como una técnica de diagnóstico rápido alternativa.

Palabras claves: virus, equino, serología, hemólisis radial simple.

Abstract

The single radial hemolysis technique (SRH) was standarized in order to demostrate specific antibodies against equine herpes–virus type 1 (EHV–1). Antigen was prepared according with Klingeborn and Dinter. Additionaly the antigen was adsorbed to red blood cells with C13 Cr.

A total of 32 serum samples were analysed with both SRH and seroneutralization (SN). A correlation coefficient was determined between values of hemolysic zone diameters and serum neutralization antibody titers. The value p < 0.01 was significative. The corresponding regression line was graphicated. Single radial hemolysis demostrated to be an useful technique for rapid diagnosis. Beside, specificity and sensitivity were equivalent that those SN. As a consequence SRH could be a reliable alternative to SN.

Key words: virus, equine, serology, single radial hemolysis.

Introducción

El virus herpes equino tipo 1 (VHE–1) posee como elemento constitutivó de su envoltura, un antígeno hemoaglutinante que se encuentra inuy pobremente representado. Por lo tanto, su poder inmunogénico es escaso, o sea que los anticuerpos (Ac) inhibidores de la hemoaglutinación (IH), están en títulos muy bajos en los sueros de los animales infectados, siendo como consecuencia la reacción de IH de poca aplicación para el diagnóstico o los estudios epidemiológicos (Klingeborn y Dinter, 1973).

La técnica de inmunodifusión (ID), si bien es de utilidad para la detección de animales seropositivos y se la puede incluir dentro de las técnicas de diagnóstico rápido dado que a las 48 horas se obtiene un resultado, presenta el inconveniente de ser poco sensible y por lo tanto, escapan a ella animales positivos pero con bajos títulos de anticuerpos seroneutralizantes (SN) (Nosetto y col., 1985).

La hemólisis radial simple (HRS) es una técnica rápida de laboratorio que se utiliza para la detección de Ac y se fundamenta en la adsorción del antígeno vírico a los eritrocitos de manera natural (mezclando é incubando) o mediante enlace químico (con adición de cloruro de cromo) (Hierholzer y Tannock, 1977; Organización Mundial de la Salud, 1981). Fue previamente descripta para la detección de Ac contra diversas virosis tales como rubeola, paperas y parainfluenza (Calow y Beare, 1980; Hamilton, 1978; Mitchell Hoskins, 1967; Probet y Russell, 1975; Skang y col., 1975). También se utilizó para clamidias y toxoplasma (Jackson y col., 1974; Lycke y Peterson, 1976).

En 1978, Klingeborn y Dinter aplican la técnica de HRS para el diagnóstico de Ac contra VHE–1 en un estudio comparativo con la técnica de SN y la IH (Klingeborn y Dinter, 1978).

Tomando como referencia estos estudios establecimos el objetivo del presente trabajo, que fue comparar la sensibilidad y la correlación existente entre sueros positivos a la prueba de SN con la HRS.

 

Trabajo subsidiado por la Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires (CIC) y el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas (CONICET). Argentina.

 

 

Material y métodos

Virus. Se utilizó la cepa SP 1 de VHE–1 (Laboratorio de Virología FCV–UNLP) de título 107 DICT50 / ml cultivada en células de línea PK 15. Para la elaboración del antígeno (Ag), se empleó el sobrenadante de los cultivos que fue centrifugado, resuspendido y concentrado de acuerdo a la metodología descripta por Klingebom y Dinter (1978).

Antisueros. Se emplearon sueros positivos y negativos de referencia a VHE–1 (Universidad de Kentucky–USA) y 31 sueros de animales de distintas zonas del país que fueron positivos a VHE–1 por la técnica de SN.

Se analizaron además, sueros de referencia positivos a virus herpes equino tipo 2 y 3 (VHE–2 y 3), anemia infecciosa equina (AIE), influenza equina (IE) y adenovirus equino (AdE).

Los sueros se descomplementaron a 60°C durante 30 minutos y se adsorbieron con glóbulos rojos equinos (GRE) por 60 minutos a 37°C.

Técnica de hemólisis radial simple

Solución de cloruro de cromo (Cl3 Cr):

Se preparó una solución 'stock' de Cl3 Cr. 6 H2O al 1 % en solución fisiológica (SF). Se ajustó a pH 5,0 durante 8 semanas con hidróxido de sodio (Na OH) y 1 N y se dejó a temperatura ambiente (TA). Esta solución se mantiene estable por 9 meses, en el momento de usar se ajusta a una concentración de 0,003%.

Glóbulos rojos equinos:

Se recogieron en solución de Alsever, se lavaron con SF tres veces y luego se ajustaron al 50% en SF. Se llevó 0,5 ml de esta suspensión a 5 ml con SF y se mezcló con 0,15 ml de glutaraldehído (Lab. Fluka) al 0,25% en SF. Se dejaron 15 minutos a TA y luego se ajustaron al 25% en SF.

Se mezclaron 0,2 ml de esta suspensión de GRE con 0,6 ml de SF, 0,1 ml de Ag y 1 ml de la solución de C13 Cr al 0,003%. Se incubó 20 minutos a 23°C y luego se detuvo la reacción con solución tampón Veronal sódico (STVS).

Estos GRE adsorbidos con Ag (GRAg) se pueden mantener hasta 24 horas a 4°C.

Placas de agar:

Se agregó a 6,8 ml de agar al 1 % en STVS y con 0,1 % de Azida sódica, 0,2 ml de GRAg y 0,3 ml de complemento fresco de cobayo. Se colocaron 3 ml de esta mezcla en portaobjetos de 75 mm por 25 mm y se dejaron gelificar. Posteriormente se practicaron 10 orificios de 2,8 mm de diámetro.

Análisis de los sueros:

Se sembraron las muestras y se incubaron las placas en cámara húmeda por 20 horas a 4°C y luego a 37°C por 24 horas. Pasado este tiempo se realizó la lectura de los resultados los que fueron corroborados por 12 horas.

Técnica de seroneutralización

Se empleó el método virus fijo–suero viable (Mitchell y col., 1978; Mitchell Hoskins, 1967).

Cultivos celulares:

Se utilizaron células de la línea PK 15 desarrolladas en microplacas (Lab. Nunc) en una concentración de 1,5 x 105 cel/ml. El medio de crecimiento celular (MC) se preparó con medio mínimo esencial (MME) con 0,3% de cáldo triptosa fosfato, 200 UI/ml de penicilina, 0,5 mg/ml de estreptomicina y 10% de suero fetal bovino (SFB). El medio de mantenimiento (MM) fue el mismo pero con 2% de SFB.

Virus:

Se usaron 100 dosis infectivas de la cepa SP 1 de título 107 DICT50/ml.

Mezclas suero–virus

Se mezclaron partes iguales de la suspensión viral con diluciones a base dos de cada suero desde la dilución 1/4 a 1/1024. Se llevaron una hora a 37°C durante 30 minutos para favorecer la neutralización del virus por Ac.

Monocapas celulares de 24 horas de desarrollo fueron inoculadas con 50 μl de cada una de las mezclas suero–virus, utilizándose cuatro pocillos por cada dilución de suero. Se dejaron cavidades controles de células sin inocular en las que se reemplazó el inóculo por MM y se realizó además una titulación paralela del virus. Se llevaron las placas durante una hora a 37°C y en atmósfera de 2% de CO2, posteriormente se retiró el inóculo, se colocaron 150 μl de MM en cada pocillo y se incubaron en las mismas condiciones descriptas anteriormente. Se realizó la lectura de los resultados al 6° día y el título neutralizante se expresó como la dilución de suero que neutralizó la infectividad de la dosis de virus empleada (Mitchell y col., 1978; Mitchell Hoskins, 1967).

Resultados

HRS: Los 31 sueros positivos formaron halo de hemólisis cuyos diámetros variaron entre valores de 3,1 mm a 8,4 mm (cuadro 1). El suero de referencia positivo a VHE–1 formó un área de hemólisis de 7 mm y el suero negativo patrón así como los sueros de referencia positivos a VHE–2 y 3, AIE, IE, AdE no produjeron zona hemolítica.

SN: Los títulos de Ac SN de los sueros analizados variaron en un rango de valores de 1/8 a 1/256. El suero positivo control dio un título de 1/256 (cuadro 1).

CUADRO 1 RESULTADOS COMPARATIVOS ENTRE TÍTULOS DE ANTICUERPOS SERONEUTRALIZANTES Y DIÁMETROS DE LAS ZONAS DE HEMOLISIS

Suero N°

Diámetro en mm zonas de hemólisis

Títulos seroneutralizantes

1

3,1

1/8

2

3,1

1/8

3

3,1

1/8

4

3,2

1/16

5

3,2

1/16

6

3,2

1/16

7

3,2

1/16

8

3,1

1/16

9

3,7

1/32

10

3,7

1/32

11

3,5

1/32

12

3,5

1/32

13

3,7

1/32

14

3,5

1/32

15

3,7

1/32

16

3,8

1/32

17

3,6

1/32

18

4,5

1/64

19

4,8

1/64

20

5,0

1/64

21

5,2

1/64

22

4,5

1/64

23

5,0

1/64

24

5,0

1/64

25

6,5

1/128

26

6,2

1/128

27

6,0

1/128

28

6,5

1/128

29

8,4

1/256

30

7,5

1/256

31

8,0

1/256

32(x)

7,0

1/256

(x) = suero control positivo.

Análisis estadístico de los resultados

Se calculó el coeficiente de correlación entre los títulos de Ac Sn y los diámetros en mm de las áreas de hemólisis obteniéndose n0,963 el que se comporta porta con un valor significativo de p < 0,01. Con los valores se realizó un gráfico de dispersión y se calculó la recta de regresión (gráfico 1).

X: Títulos de anticuerpos seroneutralizantes (inversa de la dilución de los sueros) Y: Diámetro en mm de áreas de hemólisis.

Discusión y agradecimientos

Para la técnica de HRS existen dos metodologías básicas, una de ellas es aplicable a los virus que poseen hemaglutininas y otra para los virus que no la poseen (Gaidamovich y Melnikova, 1980; Hierholzer y Tannock, 1977; Russell y col., 1975). En el caso del VHE–1 que posee en su constitución un Ag hemoaglutinante pobremente representado y con un bajo poder antigénico, optamos por emplear el método que utiliza una sustancia química como enlace entre los glóbulos rojos y el Ag.

Para la obtención del Ag se empleó la metodología descripta por Klingeborn y Dinter (1978) y para el resto del desarrollo de la técnica se siguió la metodología de Hierholzer y Tannock (1977) para virus no hemaglutinantes.

Para estandarizar la técnica se realizaron diversas experiencias tales como: a) obtención de una temperatura apropiada del agar de manera que no se inactivara el complemento pero que permitiera una formación adecuada de la placa; b) volumen óptimo de agar para obtener perforaciones con una capacidad constante de suero; c) estudios comparativos respecto al uso del complemento: incorporado en el agar o colocado sobre éste una vez gelificado y d) ajuste en los tiempos de incubación. Con estas modificaciones se lograron resultados más sensibles y reproductibles.

Para el análisis de los resultados debemos considerar que refiriéndonos a SN, los valores obtenidos en los distintos laboratorios no son estrictamente extrapolables en cuanto a la determinación del título mínimo de Ac SN que brinda protección (Bryans, 1969; Gleeson y Coggins, 1980). Bryans (1981) sugiere que títulos de Ac SN de 1/8 o mayores se correlacionan con resistencia de los animales a una infección experimental. Sin embargo, Burrows y Goodridge (1972) demuestran esta correlación con títulos mayores de 1/25. Así también, Gleeson y Coggins (1980) encontraron que hembras preñadas con títulos de Ac SN menores de 1/16 no fueron protegidas contra una infección experimental.

Klingeborn y Dinter (1978) realizaron experiencias en las cuales demuestran que los títulos de Ac obtenidos por SN y HRS son equivalentes y mucho más altos que los detectados por IH.

Teniendo en cuenta los datos aportados por las investigaciones anteriormente expuestas, nosotros evaluamos nuestros resultados y tomamos la dilución 1/8 como referencia a partir de la cual los sueros son considerados positivos. Además si obvservamos que en nuestras experiencias, con HRS detectamos títulos de Ac a partir de 1/8, por extrapolación de lo anteriormente expuesto por otros autores, podemos considerar que la sensibilidad de ambas técnicas son comparables como así también que la HRS es altamente específica ya que los sueros de referencia positivos a VHE–2 y 3, AlE, IE y AdE resultaron negativos por esta prueba.

En nuestro trabajo estudiamos 31 sueros positivos por ambas técnicas además de los sueros controles. De acuerdo al cuadro 1, para cada título SN corresponde un diámetro de la zona de hemólisis en la prueba de HRS. Estos resultados fueron analizados estadísticamente, se realizó un gráfico de dispersión y se trazó la curva de regresión. Para nosotros, la utilidad de estandarizar la técnica de HRS, de establecer la correlación entre la HRS y la SN y trazar la recta patrón, reside en el hecho de poder aplicar una técnica de diagnóstico rápido (HRS) de modo tal que llegado sueros problemas al laboratorio en 48 horas obtendríamos un resultado que luego transportado a la recta nos indicaría el título aproximado de Ac SN. Pensamos que esta técnica puede ser de gran utilidad debido a que su desarrollo no exige el manejo constante de cultivos celulares pudiendo ser empleada por laboratorios que no cuentan con la infraestructura necesaria para los mismos y requerirían solamente la obtención del Ag por parte de otro centro especializado.

Tal como ocurre con el resto de los virus herpes que infectan otras especies animales, los Ac contra el VHE–1 no juega un rol protectivo una vez establecida la infección debido a la capacidad de persistencia vira] asociada a células. Además, se observa una rápida disminución de los títulos de Ac, lo que puede llevar a una reinfección (Allen y Bryans, 1986). Sin embargo, la detección de estos Ac es de suma importancia para establecer la existencia de infección o su evolución en un brote de enfermedad, como también para evaluar la respuesta inmune en caso de utilización de medidas de vacunación.

Agradecimientos

Al Dr. Reynaldo Fonrouge de la Cátedra de Higiene, Epidemiología y Salud Pública de la Facultad de Ciencias Veterinarias por su eficiente colaboración en el análisis estadístico de los resultados.

Referencias

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Recibido el 27 de junio de 1988.