Trabajos Originales

  • Aislamiento de Escherichia coli enteroadsiva (K99) en terneros con sindrome diarreico.

Resumen

El principal factor de adhesión de Escherichia coli (E. coli) enteropatógena en el ternero es el antígeno K99. Este antígeno es codificado por plásmidos que además pueden portar factores de resistencia múltiple a antibióticos. Con el fin de evidenciar la presencia de antígeno K99 en el país y estudiar la antibiorresistencia de estas cepas, se analizaron 300 cepas de E. coli aisladas desde 77 terneros neonatos con diarrea, utilizándose entre 3 a 5 colonias de E. coli por cada ternero.

Treinta y dos cepas reaccionarón positivamente a una prueba de aglutinación (10,6%); 34 autoaglu­tinaron (11,3%) y 234 resultaron negativas (78,1%). Diecinueve terneros resultaron positivos con al menos una cepa de E. coli K99. Se encontró resistencia múltiple a los antibióticos en 74,9% de estas cepas. Se discute la eficiencia del método empleado en la detección del antígeno K99 y la asociación entre la presencia de este antígeno y la multirresistencia a antibióticos.

Abstract

The main attachment factor of enteropathogenic Escherichia coli (E. coli) in calves is the K99 antigen. This antigen is codified by means of plasmids which can carry in addition multiple resistance factors to antibiotics. In order to determine the ocurrence of the K99 antigen in the country and to study the antibiotic resistance of those strains, 300 E. coli strains viere analysed. These viere isolated from feces of 77 newborn calves affected with diarrhoea. Three to five E. coli colonies viere studied for each calf

Thirty two strains reacted positively to the agglutination test (10,6% K99+), 34 agglutinated by themselves (11,3% K99?) and 234 proved to be negative (78,1 % K99-). 19 calves proved positive with at least one strain of K99 E. coli. Multiple resistance to antibiotics was found in 74,9% of these strains. The efficiency of the method employed in detecting the K99 antigen is discussed as well as the association between the antigen occurrence and multiresistance to antibiotics.

Abstract

El principal factor de adhesión de Escherichia coli (E. coli) enteropatógena en el ternero es el antígeno K99. Este antígeno es codificado por plásmidos que además pueden portar factores de resistencia múltiple a antibióticos. Con el fin de evidenciar la presencia de antígeno K99 en el país y estudiar la antibiorresistencia de estas cepas, se analizaron 300 cepas de E. coli aisladas desde 77 terneros neonatos con diarrea, utilizándose entre 3 a 5 colonias de E. coli por cada ternero.

Treinta y dos cepas reaccionarón positivamente a una prueba de aglutinación (10,6%); 34 autoaglu­tinaron (11,3%) y 234 resultaron negativas (78,1%). Diecinueve terneros resultaron positivos con al menos una cepa de E. coli K99. Se encontró resistencia múltiple a los antibióticos en 74,9% de estas cepas. Se discute la eficiencia del método empleado en la detección del antígeno K99 y la asociación entre la presencia de este antígeno y la multirresistencia a antibióticos.

Abstract

The main attachment factor of enteropathogenic Escherichia coli (E. coli) in calves is the K99 antigen. This antigen is codified by means of plasmids which can carry in addition multiple resistance factors to antibiotics. In order to determine the ocurrence of the K99 antigen in the country and to study the antibiotic resistance of those strains, 300 E. coli strains viere analysed. These viere isolated from feces of 77 newborn calves affected with diarrhoea. Three to five E. coli colonies viere studied for each calf

Thirty two strains reacted positively to the agglutination test (10,6% K99+), 34 agglutinated by themselves (11,3% K99?) and 234 proved to be negative (78,1 % K99-). 19 calves proved positive with at least one strain of K99 E. coli. Multiple resistance to antibiotics was found in 74,9% of these strains. The efficiency of the method employed in detecting the K99 antigen is discussed as well as the association between the antigen occurrence and multiresistance to antibiotics.

Contenido

La diarrea del ternero es un síndrome en el cual se describen múltiples factores que inciden directa o indirectamente en su presentación. Sin embargo, en los primeros días de vida del ternero, Escherichia coli (E. coli) es el principal agente infeccioso involucrado en esta enfermedad (Acres y Cols., 1977; Vallet, 1983). Para actuar como enteropatógeno E. coli requiere adherirse al epitelio de la mucosa intestinal para lo cual utiliza un pili o fimbria especifica que cumple esta función. En el bovino el principal antígeno de adhesión es el K99, predominando ampliamente sobre otros factores de adherencia (Tzipori, 1981).

La codificación del antígeno K99 es mediada por plasmidos y se encuentra altamente correlacionada con la presencia de cepas enterotoxigénicas, las que presentan además resistencia múltiple a antibióticos. Debido a lo anterior, el antígeno K99 es un excelente marcador de las cepas de E. coli enterotoxigénicas para el bovino (Dobourgier y Cols., 1980; Bywater, 1983).

Recientemente, se han desarrollado vacunas que tienen como principal elemento inmunoprotector al antígeno K99, ya sea purificado o mediante bacterianas completas (Snodgrass, 1986; Lacheretz y Cols., 1987).

En razón a la importancia que se le asigna a la presencia de cepas poseedoras de fimbria K99 como agente causal de la diarrea neonatal del ternero, el presente trabajo se planteo como objetivo determinar la presencia de este agente en casos de diarrea neonatal de terneros de lecherías del Área Metropolitana y estudiar la sensibilidad a antimicrobianos de estas cepas luego de su identificación.

Material y métodos

Los animales utilizados en la experiencia, correspondieron a 77 terneros de 1 a 10 días de edad provenientes de lecherías de la Región Metropolitana. Para la obtención de muestras se selecciono a aquellos animales que al momento de ser examinados presentaban signos clínicos de diarrea. Cada animal fue muestreado en una sola oportunidad. Las muestras se obtuvieron mediante torulas estériles de 15 cm. introducidas profundamente en el recto del animal; luego fueron depositadas en el interior de una caja isotérmica a temperatura inferior a 8º C y transportadas al laboratorio dentro de un periodo de 7 horas.

Cada torula rectal fue suspendida en 1 ml de solución de NaCI al 0,85%. A partir de esta suspensión se sembraron con asa de platino placas con agar sangre y agar Mac Conkey, con el objetivo de aislar E. coli y tener una estimación del tipo y cantidad de bacterias presentes en la muestra. Asimismo, se empleo agar Minca/Polyvitex (M/P) para favorecer la expresión del antigeno K99 en las cepas de E. coli aisladas. Las placas se incubaron a 37ºC por 18 a 24 horas (Guinee y Cols., 1977). Cumplido este lapso, de cada muestra, se tomaron cinco colonias sospechosas de ser E. coli desde la placa de agar M/P, cada una de estas colonias fue suspendida en solución de NaCI al 0,85%, sembrándose nuevamente en Agar M/P y en una batería de medios diferenciales e indicadores que incluía agar citrato de Simons, tubos Durham para detección de fermentación de glucosa y lactosa, caldo urea, agar Kligler, agua peptonada y caldo Voges Proskahuer; la técnica se realizo en la forma clásica descrita para la familia Enterobacteriaceae (Edwards y Ewing, 1968). Las lecturas de las pruebas relativas a la presencia de ureasa, desarrollo en agar citrato, fermentación de glucosa, lactosa y producción de hidrogeno sulfurado, fueron leídas a las 24 horas de incubación.

Las cepas que según estas pruebas presentaron características bioquímicas de E. coolí se repicaron desde la placa de M/P y fueron sometidas a una prueba de aglutinación en placa para el diagnostico del antigeno K99. Las colonias que no presentaron dichas características bioquímicas fueron eliminadas del experimento, al igual que las colonias que en las pruebas de producción de indos, prueba del rojo de metilo y reacción de Voges Proskahuer entregaron resultados no compatibles con E. coli. Todas las cepas de E. coli fueron conservadas en agar común a 4ºC, las cepas con resultados dudosos en la prueba de aglutinación (autoaglutinantes o aglutinación débil) fueron posteriormente sembradas, dos veces consecutivas, en caldo M/P y luego pasadas a agar M/P e incubadas a 37ºC por 18 a 24 horas, a partir de este ultimo cultivo se realizo una nueva prueba de aglutinación con cada cepa (Guinee y Cols., 1976).

En la prueba de aglutinación se utilizaron antisueros específicos preparados en conejos (Laboratorio Iffa Merieux, Francia). La lectura se realizo a los 4 minutos sobre una caja de fondo oscuro con luz indirecta, con la ayuda de una lupa. Los resultados obtenidos se interpretaron como: positivo, cuando hubo aglutinación solo con el suero anti K99; negativo, cuando no se observo aglutinación en ninguna de las suspensiones y auto aglutinantes al observarse aglutinación en ambas suspensiones.

Las cepas de E. coli que resultaron positivas a la prueba de aglutinación (K99+), fueron sometidas a un estudio de sensibilidad a antimicrobianos mediante la técnica de difusión en agar Mueller Hinton. Para este objeto se utilizaron discos impregnados de ampicilina, gentamicina, cloranfenicol, estreptomicina, espiramicina, sulfametoxazol adicionado de trimetoprim y neomicina. La lectura se realizo a las 18 horas de incubación.

Resultados

Las 77 muestras de fecas presentaron desarrollo bacteriano en los tres medios de cultivo; a partir del medio M/P se seleccionaron cinco colonias por cada animal, logrando obtener 385 cepas, de éstas, 300 correspondieron a E. coli  y 84 a otras enterobacterias. Una cepa fue accidentalmente eliminada.

De las 300 cepas de E. coli sometidas a la prueba de aglutinación en placa para la detección del antígeno K99, 32 fueron positivas (K99+, 10,6%), 34 autoaglutinaron (K99+ , 11,3%) y 234 resultaron negativas (K99+, 78,1 %).

Las 32 cepas de E. coli K99+ provenían de 19 (24,7%) animales. Se consideró como positivo un animal que al menos tenía una colonia K99+.

Los resultados de los antibiogramas y presentación de resistencia múltiple de las cepas de E. coli K99+ se entregan en los cuadros 1 y 2.

CUADRO 1 SUSTENTABILIDAD A ANTIMICROBIANOS DE 32 CEPAS DE E. COLI  99 + AISLADAS DE TERNEROS DIARRETICOS 

Quimioterápico

Sensible

Intermedia

Resistente

Gentamicina

32/32

0/32

0/32

Neomicina

26/32

0/32

6/32

Ampicilina

21/32

1/32

10/32

Sulfa/Trim.*

21/32

0/32

11/32

Cloranfenicol

12/32

0/32

20/32

Tetraciclina

4/32

1/32

27/32

Estreptomicina

3/32

5/32

24/32

Espiramicina

0/32

7/32

25/32

* Sulfametoxazol + Trimetoprin.   

CUADRO 2 FRECUENCIA DE MULTIRESISTENCIA ANTIMICROBIANOS EN 32 CEPAS DE E. COLI K99 + AISLADAS DE TERNEROS DIARRETICOS

 

Número de cepas

Porcentajes

Grados de multirresistencia

Parcial

Acum. *

Parcial

Acum.*

Resistencia a 5 antimicrobianos

14

14

43,8

43,8

Resistencia a 4 antimicrobianos

10

24

31,2

75,0

Resistencia a 3 antimicrobianos

4

28

12,5

87,5

Resistencia a 2 antimicrobianos

2

30

6,3

93,8

Resistencia a 1 antimicrobiano

0

30

0,0

93,8

Resistencia a 0 antimicrobiano

2

32

6,3

100,1

* Acumulado.

 

Discusión y agradecimientos

E. coli K99+ ha sido descrito como agente etiológico de diarrea neonatal del ternero en Europa (Pohl y Cols., 1984; Martel y Perrin, 1981; Renault, 1981); América del Norte (Moon y Cols., 1976; Moon y Cols., 1978). En América del Sur el único reporte corresponde a Barrandeguy y Cols., 1985, quien describe este enteropatógeno en Ar­gentina.

Los diversos resultados obtenidos en trabajos sobre E. coli K99+ como agente causal de diarrea en el ternero, varían en un amplio margen de prevalecía, desde un 18,2% descrito por Martel y Perrin (1981) en Francia, al 56% descrito por House (1978) en Estados Unidos de Norteamérica. El presente estudio entrega un 24,7% de positivi­dad a E. coli K99+, el cual se ubica en el rango intermedio de las estimaciones de los reportes citados.

La detección del antígeno K99 en cepas de E. coli aisladas desde fecas de terneros diarreicos, mediante el cultivo de la bacteria en medios especiales para su expresión como Minca/Polyvitex y la posterior reacción de aglutinación, constitu­yen el sistema más empleado para el diagnóstico etiológico de las diarreas neonatales del ternero causadas por este agente (Tzipori, 1981; Pohl y Cols., 1984); sin embargo, es importante conside­rar que esta técnica río aporta información sobre la presencia del antígeno K99, del tipo glucosa-de­pendiente ni, obviamente, sobre otros antígenos de adhesión como el F41 y el Att25, entre otros (Pohl y Cols., 1984; Acres, 1985). Además, tiene el inconveniente de la ocurrencia de reacciones de autoaglutinación, que se presentaron en 34 (11,3% de las 300 cepas de E. coli estudiadas en este trabajo, lo cual impide concluir un diagnóstico final sobre algunas de las cepas estudiadas (De Rycke y Cols., 1981).

La atribución de la etiología de los casos de diarrea estudiados a las cepas E. coli, mediante la determinación del antígeno K99, es una estima­ción bastante segura, ya que la virulencia de la bacteria se basa en la presencia simultánea de este antígeno y la capacidad enterotoxigénica de las cepas que lo portan, existiendo una estrecha correlación entre ambas características (Tzipori, 1981; Pohl y Cols., 1984; Acres, 1985); sin embargo, no es una estimación definitiva del poder patógeno de la bacteria; para ello se deben combinar las técnicas para la detección del antí­geno K99 y la producción de enterotoxinas (Acres, 1985).

Por otra parte, es conocido que la capacidad enterotoxigénica se asocia estrechamente a la antibiorresistencia múltiple (De López y Cols., 1980; De Rycke y Cols., 1981; Guillot y Lafont, 1983), consecuentemente, en este estudio se deter­minó una alta frecuencia de multirresistencia a quimioterápicos, detectándose que el 75% de las cepas E. coli K99+ presentaban resistencia a cuatro o más de los antibióticos empleados.

El antibiotipo descrito por la literatura para las cepas enteropatógenas de E. coli, es decir, resis­tencia a tetraciclina y estreptomicina y sensibilidad a gentamicina y neomicina (Guillot y Lafont, 1983; Moulin y Cols., 1983), fue detectado en la mayoría de las cepas de E. coli K99+ aisladas. La presentación de multirresistencia es un anteceden­te de interés en la elección de los antimicrobianos a utilizar en el tratamiento de esta enfermedad en los terneros. Estos resultados originan, además, inquietudes respecto al uso extensivo de antibióti­cos como medida terapéutica y/o como aditivo en las raciones para animales, ya que mediante este proceso se podría estar seleccionando genética­mente a enteropatógenos altamente resistentes a los antibióticos, lo cual complica la solución clínica y epidemiológica de esta enfermedad.

La descripción realizada en este estudio de infecciones por E. coli K99+ asociado a diarrea neonatal en terneros es un aporte de interés al conocimiento del síndrome diarreico en nuestro medio y plantea además un amplio horizonte de investigación, especialmente orientado a determi­nar la importancia epidemiológica de la enferme­dad, características clínicas y las medidas de control y tratamiento de ella.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Laboratorio Rhodia Merieux por su valioso aporte en materiales y reactivos empleados en este trabajo.

Referencias

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Recibido en abril de 1988, aceptado en junio de 1988.