Contenido

La gran incidencia de la otitis canina, como asimis­mo su refractariedad terapéutica, ha sido atribuida a múltiples factores que favorecen el desarrollo de microorganismos en diferentes etapas del curso de la patología (Pugh y Cols., 1974; Evans y Jemmet, 1978; Matsuda y Cols., 1984). Uno de los recursos terapéuticos importantes está constituido por el uso de antimicrobianos, solos o en asociaciones, que son utilizados por vía sistémica y local y cuya eficacia depende, por una parte, de la sensibilidad de las cepas bacterianas presentes en la lesión au­ricular y, por otra, de las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) que los antimicrobianos alcan­zan en zonas de localización bacteriana (English y Prescott, 1983; Hirsch y Ruhel, 1984).

La identificación de las cepas bacterianas y el estudio de su sensibilidad mediante el antibiogra­ma, constituyen el primer paso que guía la selección de los antimicrobianos; sin embargo, por el carácter cualitativo del método parece de interés comple­mentar esta información con el estudio de las CMI in vitro de los diferentes antimicrobianos de uso en la otitis canina (Amine-Kodja y Cols., 1983). En efecto, el estudio cuantitativo puede contribuir de un modo importante a la clínica pues, desde el punto de vista cinético, permite la posibilidad de un ajuste posológico que favorezca la reproducción in vivo de las CMI (Baggot, 1977; Devriese y Dutta, 1981; Fachini, 1981).

El estudio de las CMI in vitro en patologías de curso crónico, adquiere una especial connotación en los casos que requieren el uso de asociaciones de antimicrobianos por razones relacionadas con resis­tencia microbiana, disminución de efectos adversos de uno de los componentes de la asociación o con el fin de obtener una acción sinérgica (Jawetz, 1968; Person, 1983).

En el presente trabajo se estudian las CMI in vitro sobre cepas bacterianas obtenidas de cuadros de otitis canina, de antibióticos de uso frecuente en esta patología, tales como los betalactámicos: am­picilina y cloxacilina; aminoglicósidos: amikacina, gentamicina y neomicina y el antibiótico polipépti­do polimixina B.

 Trabajo financiado por Proyecto 2422-86 DIB, Universidad de Chile y aportes del Laboratorio Chile S.A.

 

Material y método

El estudio se realizó con 85 cepas bacterianas aisla­das desde muestras obtenidas del oído externo de caninos con otitis, en diferentes estados de evolu­ción y sin antecedentes de terapia antimicrobiana previa. Se utilizaron 26 cepas de Proteus sp.; 29 de Pseudomona aeruginosa y 30 de Staphylococcus aureus. El aislamiento e identificación se hizo se­gún técnicas clásicas (Bergey, 1975). Las cepas control fueron: Staphylococcus aureus ATCC 25922; Pseudomona aeruginosa ATCC 27853 y Escherichia coli ATCC 25923.

Los antibióticos ensayados y su respectiva po­tencia, mg/mg base, fueron: amikacina sulfato 600,84; gentamicina sulfato 619,80; neomicina sul­fato 631,14; ampicilina sódica 837,99; cloxacilina sódica 984,60 y polimixina B 760,00. Todos en calidad de droga pura. Se prepararon soluciones base de cada antibiótico.

El inóculo fue preparado sembrando cada cepa en caldo Mueller Hinton (Difco), previa incubación durante 24 horas ajustando la suspensión al 0,5 del Nefelómetro de Mc Farland lo que equivale a 150.000.000 de bacterias aproximadamente, se prepararon diluciones 1:20 de cada cepa. Las dilu­ciones seriadas de antibióticos en agar Mueller Hin­ton (Difco) se realizaron a partir de la solución base ensayándose doce concentraciones desde 0,25 has­ta 128 mg/ml. Estas fueron mezcladas con el agar a 50°C en razón 1:10 y, una vez solidificado, se mantuvieron a 4°C durante 24 horas. Las diluciones de los antibióticos estudiados en asociación se reali­zaron mediante la técnica simplificada del 'Tablero de Ajedrez' (Sabath 1968; Krogstad y Moellering, 1980) y que consiste en un cuadriculado que permi­te el estudio de múltiples combinaciones de dos antibióticos en diferentes concentraciones que se expresan en múltiplos de las Concentraciones Míni­mas Inhibitorias (CMI), y utilizando diluciones en factor de 2. Esto permite ensayar diversas concen­traciones que se diluyen a lo largo de sus ejes, X e Y, y por otra parte, permite determinar la posible sinergia entre los antibióticos estudiados.

Las placas fueron inoculadas mediante el uso del aparato inóculo replicador de Steers (1959) y las determinaciones se realizaron en duplicado e incu­bándose a 37°C durante 18 horas, realizándose la lectura por evidencia macroscópica de crecimiento,

Los valores de la CMI se expresan en términos absolutos y, en el caso de las asociaciones de anti­bióticos, los resultados corresponden al cálculo del Indice de Concentración Inhibitoria Fraccionada (CIF), que se obtiene por aplicación de la siguiente fórmula (Krogstad y Moellering, 1980; Sande y Mandell, 1980);

CIF
= A CMI A + B CMI
A = Consentración de la droga A.
B = Concentración de la droga B.
CMI A = CMI de la droga A para un determinado microorganismo.
CMI B = CMI de la droga B.
CIF 0,5 = Sinergia.
CIF = 1,0 = Aditividad.
CIF > 1,0 = Antagonismo

Resultado

1.  Estudio de aminoglicósidos y polimixina B sobre cepas Gram negativas

1.1. Pseudomona aeruginosa.

En el cuadro 1 se muestran los valores de las CMI de polimixina B, amikacina y gentamicina que permiten apreciar los menores CMI requeridas por los aminoglicósidos para ejercer sus efectos sobre la cepa ensayada, polimixina B prácticamente no tuvo efectos en porcentajes superiores al 90% como se observa en el cuadro 3.

CUADRO 1 CMI DE POLIMIXINA B, GENTAMICINA Y AMIKACINA SOBRE  29 CEPAS DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Concentraciones μg/ml

Polimixina B

Gentamicina

Amikacina

0,25

-

-

-

0,5

-

-

4

1,0

-

-

9

2,0

-

-

2

4,0

1

1

4

8,0

-

11

4

16,0

-

16

3

32,0

-

1

3

64,0

1

-

-

128,0

-

-

-

> 128,0

27

-

-

1.2. Proteus sp.

En el cuadro 2 en que se presentan los valores de CMI sobre cepas de Protoeus sp. dado que requirie­ron menores CMI de los antibióticos en compara­ción a las de Pseudomonas aeruginosa.

CUADRO 2 CMI DE GENTAMICINA, AMIKACINA Y NEOMICINA SOBRE 29 CEPAS DE PROTEUS SPP

Concentraciones μg/ml

Gentamicina

Amikacina

Neomicina

0,25

-

-

2

0,5

1

1

1

1,0

2

6

-

2,0

7

4

9

4,0

3

2

7

8,0

4

1

2

16,0

6

3

2

32,0

-

5

2

64,0

3

-

-

128,0

-

-

-

> 128,0

-

4

1

CUADRO 3 RANGOS, FRECUENCIA Y DISTRIBUCIÓN PORCENTUAL DE CMI DE AMIKACINA, GENTAMICINA, NEOMICINA Y POLIMIXINA B SOBRE CEPAS DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA Y PROTEUS SP

Cepas Microbianas

N

Antibióticos

Rango μg/ml

CMI y %*

Pseudomonas aeruginosa

 

29

 

Gentamicina

4 - 32

8 - 16

(93)

Amikacina

0,5 - 32

1

(21)

Polimixina B

4 - > 128

> 128

(93)

Proteus sp.

 

 

Gentamicina

0,5 - 64

2

(26)

Amikacina

1 - > 128

2

(23)

Neomicina

0,5 - > 128

4 - 8

(61)

*CMI más frecuentes. El número entre paréntesis corresponde al porcentaje de cepas inhibidas.

2. Estudio de CMI en asociaciones de antibióti­cos sobre cepas Gram negativas

2.1 CMI de gentamicina-amikacina sobre Pseudomonas aeruginosa y Proteus sp.

Con esta asociación se ensayó sólo cepas que pre­sentaron valores de CMI iguales o menores a 128 μg/ml y que correspondieron a 29 de Pseudomona aeruginosa y 22 de Proteus sp., calculándose el índice CIF para cada una de las cepas y que, según se presenta en el cuadro 4, muestra con Pseudomo­na un efecto sinérgico en 48,2%; aditivo en el 45% y sólo se apreció antagonismo en el 6,8% de los casos considerados. En el caso de Proteus sp., los efectos sinérgicos y aditivos son algo inferiores a los observados en el caso anterior, pero predominan notablemente sobre las acciones antagónicas que alcanzan al 14% de los experimentos.

CUADRO 4 EFECTOS DE LA ASOCIACIÓN GENTAMICINA - AMIKACINA SOME CEPAS PSEUDOMONAS AERUGINOSA Y PROTEUS SP*

Cepas Microbianas

N

Efectos

Aditivos

Sinergicos

Antagonicos

Pseudomonas aeruginosa

29

13

14

2

Proteus sp

22

7

12

3

*Segun calculo del indice CIF.

2.2. CMI de neomicina-gentamicina sobre Proteus sp.

Esta asociación también fue ensayada frente a cepas de Proteus sp. que presentaron valores de CMI iguales o inferiores a 128 µg/ml en presencia de los antibióticos por separado. En 25 cepas los efectos sinérgicos se observaron en 16; la aditividad en 7 y plantean un punto importante de discusión. En el cuadro 6 se presentan los rangos de CMI y la distri­bución porcentual de los antibióticos estudiados y que complementan los resultados descritos.

2.3. CMI de ampicilina-cloxacilina y de gentamicina-cloxacilina sobre cinco cepas de Staphylococcus.

Los resultados de las acciones de los antibióticos estudiados por separado nos indujeron a realizar algunos estudios, de carácter preliminar, con las asociaciones mencionadas sobre cinco cepas de el antagonismo en 2 que equivalen a 64,28 y 8% respectivamente, demostrando el predominio de la acción inhibidora de esta asociación.

3. Estudio de CMI de antibióticos solos y y en asociación sobre cepas de Staphylococcus aureus

3.1. CMI de ampicilina, cloxacilina y gentamicina.

En el cuadro 5 se muestran las CMI de los tres antibióticos que permite apreciar un claro efecto inhibidor de cloxacilina y gentamicina aun en con­centraciones inferiores a 0,5 μg/ml. Sin embargo, es interesante destacar las acciones de la ampicilina sobre las cepas de Staphylococcus aureus y que Staphylococcus aureus. En el cuadro 7 se observa una marcada acción sinérgica de ampicilina­cloxacilina y sólo efectos aditivos y antagónicos de la asociación cloxacilina-gentamicina.

CUADRO 5 CMI DE AMPICILINA, CLOXACILINA Y GENTAMICINA SOME 30 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Concentraciones μg/ml

Ampicilina

Cloxacilina

Gentamicina

< 0,25

7

17

18

0.25

-

-

-

0.5

11

4

1

1.0

2

-

2

2.0

5

-

2

4.0

2

-

3

8.0

2

-

2

16.0

-

-

2

32.0

-

3

-

64.0

-

3

-

128.0

-

-

-

> 128,0

-

3

-

CUADRO 6 RANGO, FRECUENCIA Y DISTRIBUCIÓN PORCENTUAL DE CMI DE AMPICILINA, CLOXACILINA Y GENTACIMINA SOBRE 30 CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Antibióticos

Rango μg/ml

CMI y % μg/ml

*

Gentamicina

< 0,25     - 16

< 0,25

(60)

Ampicilina

< 0,25 - >128

0.5

(36,6)

Cloxacilina

< 0,25 - >128

< 0,25

(56,6)

*CMI Mas frecuentes,El número entre paréntesis corresponde al porcentaje de cepas inhibidas.

CUADRO 7 EFECTOS DE LAS ASOCIACIONES AMPICILINA - CLOXACILIN Y GENTAMICINA - CLOXACILINA SOBRE CEPAS DE TAPHYLOCOCCUS AUREUS*

Efectos

-

Asociación Ampicilina Cloxacilina

Asociación Gentamicina Cloxacilina

Aditivos

1

2

Sinérgicos

4

0

Antagónicos

0

3

N

5

5

* Según cálculo del índice CIF.

Discusión

Desde un punto de vista general, los resultados permiten reconocer variaciones en la sensibilidad de cepas bacterianas presentes en las otitis caninas, hecho que, agregado a la condición de cronicidad de esta patología, justifica el estudio de las CMI in vitro con el fin de favorecer la selección del antimi­crobiano con mejores posibilidades de reproducir CMI de carácter sinérgico o aditivo in vivo, con un margen de seguridad adecuado (Baggot, 1977).

El análisis en particular de las CMI de los dife­rentes antibióticos ensayados sobre cepas Gram ne­gativas demuestra que, tanto amikacina como gen­tamicina, ejercen efectos inhibitorios sobre un ele­vado porcentaje de cepas de Pseudomonas con bajas CMI y, por tanto, susceptibles de reproducir in vivo aplicando esquemas derivados de la infor­mación cinética actualizada (Conzelman, 1980; Ling, 1981; Brown y Cols., 1982; Zurich, 1983). La posología, según la literatura citada, correspon­de al uso parenteral de gentamicina en dosis de 4 ó 10 mg/kg en ritmo horario de 12 horas. Esto permite alcanzas concentraciones sanguíneas entre 1 a 5 µg/ml y que se comparan favorablemente con las CMI in vitro del presente trabajo. No tenemos ante­cedentes sobre concentraciones titulares, específi­camente auriculares, de gentamicina y amikacina aplicadas por vía sistémica, pero el uso local de preparados al 3% exceden las CMI sanguíneas aun cuando, esta modalidad de uso sólo se recomienda cuando existe integridad del tímpano, pues en caso contrario se favorece la difusión hacia el oído medio que puede provocar alteraciones del sistema acústi­co (Adler y Finland 1971; Clarck, 1977).

Respecto de neomicina, de amplio uso tópico y local en nuestro medio, los resultados permitieron verificar la elevada eficacia in vitro sobre cepas de Proteus sp. a juzgar por los efectos con CMI entre 0,5 y 8,0 μg/ml que son relativamente fáciles de alcanzar en el conducto auditivo externo con las presentaciones farmacéuticas de uso tópico.

Es interesante hacer notar, aunque escapa a los propósitos de este trabajo, que el mejor contacto entre la droga y el tejido efector se obtiene cuando se retira el exudado del conducto auditivo externo previa la aplicación del antimicrobiano (Sharma y Rhoades, 1975).

Las asociaciones de gentamicina con neomicina y amikacina presentaron CMI bajas, con efectos aditivos y sinérgicos predominantes, lo cual puede constituir un buen elemento de juicio en la selección de antimicrobianos frente a infecciones auriculares con presencia de Pseudomonas y Proteus. En todo caso, nuestros experimentos no permiten discrimi­nar entre las asociaciones ensayadas, de tal forma que cualquier indicación en este sentido debe ser obtenida a través de exámenes que contemplen el estudio de las CMI in vitro.

En relación a polimixina B, llama la atención las elevadas concentraciones necesarias para ejercer acciones inhibitorias in vitro, hecho que no con­cuerda con las indicaciones, en este tipo de infec­ciones, que aparecen en los textos clásicos (Brander y Cols., 1982; Booth y MacDonald, 1982). Este hecho parece confirmar, por una parte, la necesidad de instaurar estudios de CMI conjuntamente con los exámenes clásicos de sensibilidad bacteriana y, por otra, confrontar los resultados in vitro versus in vivo con el fin de intentar una mejor explicación de la actividad antibacteriana (English y Prescott, 1983).

Las acciones sobre cepas de Staphylococcus au­reus demostraron una elevada efectividad de los antibióticos ensayados. CMI inferiores a 0,25 μg/ ml fueron frecuentes para cloxacilina y gentamici­na. Sin embargo, fue interesante constatar la marca­da acción inhibitoria de ampicilina cuya naturaleza estructural (Acred y Cols., 1962) es sensible a las acciones de las betalactamasas liberadas por cepas de estafilococos resistentes. Esto puede hacer pen­sar que un número importante de cepas no corres­ponde, tal vez, a productoras de enzimas inactivan­tes y, por esta razón, mostraron una gran sensibili­dad frente a ampicilina. Sin duda que los trabajos futuros deben contemplar la identificación de los estafilococos presentes en la infección.

La asociación ampicilina-cloxacilina presentó un efecto sinérgico o aditivo sobre las cepas de estafilococos ensayadas en oposición a los efectos antagónicos de las asociaciones cloxacilina­gentamicina. Ambos experimentos, por el bajo nú­mero de casos ensayados, no permiten emitir con­clusiones pero, en términos farmacológicos, de­muestran la importancia de ajustarse a los princi­pios que rigen las asociaciones de antimicrobianos, las cuales presenten mejores posibilidades terapéu­ticas cuando se combinan fármacos que poseen mecanismos de acción complementarios (Jawetz, 1968; Person, 1983).

Referencias

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