Contenido

  • Anticuerpos Anti-Pili de Escherichia Coli Enteropatógena en suero, calostro, leche y heces de cerdos clínicamente sanos

Resumen

A partir de la cepa de Escherichia coli OC: K87: 987P se purificó el antígeno pili 987P, que media la adherencia del bacilo al epitelio intestinal. La pure­za de la solución de pili obtenida se evaluó mediante microscopía electrónica. Además se purificó inmu­noglobulinas de clase IgG e IgA secretora de cerdo, con las que se produjo suero hiperinmune en co­nejos, los que se utilizaron para preparar conjuga­dos anti-IgG de cerdo -fosfatasa alcalina y anti­IgA secretora de cerdo- fosfatasa alcalina.

Se determinó, mediante la técnica de enzimoin­muno-análisis (ELISA), niveles de anticuerpos de clase IgG anti-pili 987P en suero, calostro y leche de cerdas lactantes, y en suero y heces de lechones; y anticuerpos de clase IgA secretora anti-pili 987P en calostro y leche de hembras lactantes y en heces de lechones.

Los resultados indican un alto nivel de anticuer­pos, tanto en madres como en lechones clínicamen­te sanos, lo que aseguraría una adecuada protección contra las diarreas causadas por esta bacteria. Los niveles de anticuerpos obtenidos en los lechones son un fiel reflejo del nivel inmunológico que pre­senta la madre y que traspasa pasivamente al lechón a través del calostro y la leche.

Abstract

Pili antigen 987P that adhere bacteria to the intestinal epithelia was isolated from Escherichia coli OC:K87:987P and analyzed by electronic microscopy. Immunoglobulin G and secretory IgA was purified to immunize rabbits in order to obtain hiperimmune serum and alkaline phosphatase conjugates anti-IgG and anti-secretory IgA. The presence of specific IgG antibodies against pili antigen 987P was determined by an enzymoimmu­noassay in calostrum, milk and serum of dams and in the serum and depositions of suckling pigs. Similarly specific secretory IgA antibodies were studied in calostrum and milk of dams and depositions of suckling pigs. The results showed a high level of antibodies in clinically normal mothers and suckling pigs. The level of antibodies in suckling pigs is dependent on the degree of immunity of the mothers and is a measure of passive transference of antibodies through calostrum and milk.

Abstract

A partir de la cepa de Escherichia coli OC: K87: 987P se purificó el antígeno pili 987P, que media la adherencia del bacilo al epitelio intestinal. La pure­za de la solución de pili obtenida se evaluó mediante microscopía electrónica. Además se purificó inmu­noglobulinas de clase IgG e IgA secretora de cerdo, con las que se produjo suero hiperinmune en co­nejos, los que se utilizaron para preparar conjuga­dos anti-IgG de cerdo -fosfatasa alcalina y anti­IgA secretora de cerdo- fosfatasa alcalina.

Se determinó, mediante la técnica de enzimoin­muno-análisis (ELISA), niveles de anticuerpos de clase IgG anti-pili 987P en suero, calostro y leche de cerdas lactantes, y en suero y heces de lechones; y anticuerpos de clase IgA secretora anti-pili 987P en calostro y leche de hembras lactantes y en heces de lechones.

Los resultados indican un alto nivel de anticuer­pos, tanto en madres como en lechones clínicamen­te sanos, lo que aseguraría una adecuada protección contra las diarreas causadas por esta bacteria. Los niveles de anticuerpos obtenidos en los lechones son un fiel reflejo del nivel inmunológico que pre­senta la madre y que traspasa pasivamente al lechón a través del calostro y la leche.

Abstract

Pili antigen 987P that adhere bacteria to the intestinal epithelia was isolated from Escherichia coli OC:K87:987P and analyzed by electronic microscopy. Immunoglobulin G and secretory IgA was purified to immunize rabbits in order to obtain hiperimmune serum and alkaline phosphatase conjugates anti-IgG and anti-secretory IgA. The presence of specific IgG antibodies against pili antigen 987P was determined by an enzymoimmu­noassay in calostrum, milk and serum of dams and in the serum and depositions of suckling pigs. Similarly specific secretory IgA antibodies were studied in calostrum and milk of dams and depositions of suckling pigs. The results showed a high level of antibodies in clinically normal mothers and suckling pigs. The level of antibodies in suckling pigs is dependent on the degree of immunity of the mothers and is a measure of passive transference of antibodies through calostrum and milk.

Contenido

La colibacilosis porcina es una enfermedad infec­ciosa causada por Escherichia coli, que causa gran­des pérdidas económicas en las explotaciones por­cinas debido a disminución de peso, retraso en el desarrollo, menor conversión alimenticia y muerte en muchos casos.

A esta enfermedad se le atribuyen valores desde un 40 y hasta un 80% de las diarreas porcinas antes del destete (Vanhuyse y Smedt, 1977; Márquez, 1982; Freixes, 1983). Aunque existen valores bas­tante diferentes en investigaciones nacionales y ex­tranjeras respecto de la presencia de este bacilo en diarreas porcinas, es indicutible el importante rol que juega la enfermedad en la especie porcina.

La enfermedad se presenta comúnmente como una gastroenteritis aguda, con deshidratación, de­presión general y muerte en muchos casos. Los cerditos más afectados son aquéllos de 2 a 3 horas de nacidos y hasta el destete. Después del destete la enfermedad disminuye su incidencia.

La E. coli basa su patogenicidad en dos mecanis­mos ampliamente conocidos: la capacidad para ad­herirse a las células epiteliales del intestino delgado (colonización) y la producción de enterotoxinas que llevan al intestino delgado a secretar fluidos.

La capacidad del bacilo de adherirse a los entero­citos y luego colonizar el epitelio intestinal, está mediada por estructuras presentes en las cepas ente­ropatógenas, que protruyen de la superficie bacte­riana y se han denominado 'pili' o 'fimbrias' (Gaastra, 1982).

Los 'pili' corresponden a apéndices filamento­sos no flagelares, distribuidos en la periferia de la célula bacteriana, y que sólo son visibles al micros­copio electrónico. Su largo varía entre 0,2 y 1 µ y su ancho es de aproximadamente 7 nm. Se distinguen de las flagelas por ser numerosos (entre 100 a 400 por célula), cortos y muy rectos (Duguid y Cols., 1955; Duguid, 1964).

Estos 'pili' además de ser importantes elemen­tos de colonización bacteriana, son excelentes in­munógenos. Se sabe que la inmunidad a la infec­ción por E. coli, se adquiere primariamente a través de anticuerpos que impiden la multiplicación del bacilo en el intestino y su adhesión a la superficie epitelial, y que neutralizan las enterotoxinas produ­cidas por la bacteria (Wilson, 1981). Por tanto, los anticuerpos que inhiban la adhesión bacteriana pue­den ser uno de los mecanismos de defensa de mayor relevancia contra la enfermedad (Gaastra, 1982). Debido a esta capacidad inmunogénica, diversos autores han realizado estudios con el fin de utilizar pili purificado en inmunizaciones de hembras pre­ñadas, de modo que éstas confieran un buen nivel de protección a sus lechones a través del calostro y la leche.

Los tipos de 'pili' más estudiados en el cerdo son el 987P y el K88, por ser éstos los que se encuentran con mayor frecuencia asociados a cepas enteropatógenas de E. coli, tanto a nivel nacional (Pinochet, 1985) como extranjero (Brinton y Cols., 1983).

Los resultados con el uso de vacunas a base de 'pili' han sido muy buenos hasta el momento, con­firiendo protecciones sobre un 90% en la mayoría de los casos (Nagy y Cols., 1978; Morgan y Cols., 1978; Isaacson y Cols., 1980; Brinton y Cols., 1983; To, 1984).

Con el fin de estimar niveles de anticuerpos anti-pili 987P de una cepa de E. coli aislada en la Región Metropolitana, se utilizó una técnica de enzimoinmunoanálisis para determinar títulos de anticuerpos en el suero, calostro y leche de hem­bras, y en el suero y fecas de sus lechones, en cerdos clínicamente sanos. Estos niveles de anticuerpos pueden servir para establecer una base inmunológi­ca a considerar en la selección de hembras destina­das a la masa reproductora de un plantel. Además, no puede descartarse la importancia de utilizar va­cunas a base de 'pili' purificado, para prevenir la presentación de la enfermedad.

 Proyecto A-2216-8512. DIB. U. de Chile.

Material y métodos

Material biológico:

El material biológico se recolectó en un plantel porcino ubicado en la sexta región del país. El muestreo se dividió en dos grupos: doce hembras lactantes y doce lechones, de acuerdo al siguiente esquema:

Se analizó un total de 72 muestras de hembras (36 de suero, 12 de calostro y 24 de leche) y 72 muestras de lechones (36 de suero y 36 de heces).

El calostro fue descaseinado con ácido acético 1M y reajustado al pH original. Las heces se diluye­ron en tampón fosfato salino (PBS) O,OIM pH: 7,2.

A todas las muestras se les agregó azida de sodio lmg/ml como preservante, luego se separaron en alícuotas y se mantuvieron a -20°C hasta su uso.

Cepa bacteriana:

Se utilizó la cepa de Escherichia coli OC: K87: 987P aislada y serotipificada en la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Chile en 1985 (Pinochet, 1985).

Microscopía electrónica:

La presencia de 'pili' en la cepa utilizada se evaluó mediante microscopía electrónica por la técnica de tinción negativa de material fresco y fijado, con acetato de uranilo al 1% y ácido fosfotúngstico al 2%, en un microscopio de transmisión Siemens 1A (Laboratorio de Histología. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Católica de Chile).

Purificación de IgG e IgA secretora de cerdo:

La IgG fue purificada a partir de suero y la IgA secretora a partir de calostro de cerdo. Se utilizaron las técnicas descritas por Yabiki y Cols. (1973), y Haye y Kornegay (1979).

Las soluciones de IgG e IgA secretora obtenidas fueron controladas en su pureza y actividad por electroforesis (Grabar y Burtin, 1968) e inmunoe­lectroforesis (Ouchterlony, 1968). La concentra­ción proteica fue determinada por la técnica de Biuret (Williams y Chase, 1971). La IgG e IgA secretora purificada se utilizaron para producir en conejos suero hiperinmune anti-IgG y anti-IgA se­cretora de cerdo. Se utilizó la técnica descrita por Arriagada (1986).

 

Hembras Lactantes

días post-parto

Suero

2

4

10

Calostro

2

-

-

Leche

-

4

10

 

Lechones

días de edad

Suero

2

10

25

Heces

2

10

25

Producción de conjugados anti-IgG de cerdo fosfatasa alcalina y anti-IgA secretora de cerdo fosfatasa alcalina

Los sueros hiperinmune obtenidos de conejos fue­ron absorbidos para dejarlos monoespecíficos y se purificaron en su fracción IgG de acuerdo a la técnica de Yabiki y Cols. (1973). La IgG de conejo anti-IgG y anti-IgA secretora de cerdo, fue conjuga­da con la enzima fosfatasa alcalina de acuerdo al procedimiento descrito por Voller y Cols. (1976).

Producción y purificación de antígenos 'pili'

La producción y purificación de antígenos 'pili' se realizó basándose en la técnica descrita por Salit y Gotschlich (1977), modificada (Arriagada, 1986).

La cepa de Echerichia coli utilizada se sembró en medio C.F.A. ('Colonization Factor Antigen') especial para desarrollar 'pili', a 37°C durante 24 horas. Luego se repicó al medio Minca Isovitalex y se incubó en un agitador a 200 rpm, a 35°C durante 18 horas. Se centrifugó el cultivo a 10.000 x G a 4°C por 20 minutos y el 'pellet' obtenido se suspen­dió en tampón Tris-HC10,05M pH: 7,8. La suspen­sión se agitó en un homogenizador Sorwall Omni­mizer, a 4°C durante 2 minutos. Luego se centrifu­gó a 10.000 x G, a 4°C por 20 minutos y el sobrena­dante fue recentrifugado. El sobrenadante se dializó contra tampón acetato durante 24 horas, observán­dose un leve precipitado. Nuevamente se centrifu­gó, pero esta vez a 20.000 x G y el 'pellet' obtenido se lavó en tampón acetato, para finalmente centrifu­garlo a 20.000 x G. El sedimento se resuspendió en tampón Tris-HCI con agitación magnética lenta a 4°C durante 30 minutos.

A la solución de 'pili' purificado evaluada por microscopía electrónica se le determinó la concen­tración proteica por la técnica de Lowry-Folin Cio­calteau (Williams y Chase, 1971). Como conser­vante se le agregó azida de sodio mg/ml y se conge­ló a -20°C hasta su uso.

Enzimoinmunoanálisis (ELISA) para determinar los niveles de IgG

El, enzimoinmunoanálisis se realizó según la técnica descrita por Voller y Cols. (1976). Brevemente, se adhirió 5 mg de antígeno 'pili' purificado por pozo, diluido en tampón de recubrimiento carbonato 0,05M, pH: 9,6. La placa se dejó a 37°C por una hora y luego a 4°C por 24 horas. A continuación la placa se lavó con PBS-Tween 0,05% pH: 7,4 y se bloquearon los sitios libres con PBS Tween-BSA 1% a temperatura ambiente durante una hora. Lue­go se lavó con PBS-Tween y se agregó 0,2 m1 por pozo de las muestras en diferentes diluciones.

Las placas se incubaron a 37°C durante 2 horas y luego se lavaron con PBS-Tween-BSA 1%. A con­tinuación se agregó 0,2 ml por pozo del conjugado fosfatasa alcalina en la dilución correspondiente y se dejó a 4°C durante 12 horas. Luego se lavó con PBS-Tween y se añadió 0,2 ml por pozo de la solución de sustrato ortonotrifenilfosfato disódico a una concentración de 1 mg/ml en tampón dietanola­mina 10% pH: 9,8 con MgCI2 0,01 %. Las placas se incubaron a 37°C durante 45 minutos y la reacción se detuvo agregando 0,05 ml de NaOH 3M por pozo.

La lectura se realizó en un espectrofotómetro digital para placas de microelisa a 405 nm de longi­tud de onda, midiendo su absorbancia.

Análisis estadístico:

Para el estudio estadístico se realizó un análisis de varianza modelo tipo I o de efecto fijo, utilizando para ello las medias geométricas (MG) de cada grupo de observaciones obtenidas en los correpon­dientes períodos post-parto de las hembras o de edad de los lechones.

Resultados

Microscopía electrónica:

La cepa de Escherichia coli OC: K87: 987P 'piliada' utilizada en este estudio (Foto 1) muestra 'pili' cortos, rectos y en gran cantidad, en contraste con el escaso número y gran tamaño de los flagelos que posee la bacteria.

Foto 1. Cepa de Escherichia coli OC: K87:987P 'Piliada' observada al microscopio electrónico (20.000 X)

La suspensión de 'pili' 987P purificado adopta una distribución que asemeja a una red, mostrando un alto grado de pureza (Foto 2).

Foto 2. 'Pili' 987P purificado observado al microscipio electrónico (aumento 20.000 X)

Títulos de inmunoglobulina G 'anti-pili' 987P de E. Coli

Los títulos de IgG 'anti-pili' 987P de E. coli obteni­dos en el suero de las hembras en los tres períodos muestreados (2, 4 y 10 días post-parto) revelan que se mantienen constantes a través del tiempo. No hay diferencias significativas entre las medias geomé­tricas de los tres períodos (p = 0,314) (Figura 1). En cambio en el suero de los lechones, muestreado a los 2, 10 y 25 días de edad, se aprecia un descenso significativo a través del tiempo (p =< 0,01) (Figura 1).

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Figura 1: Distribución de los niveles de anticuerpos de clase IgD anti-pili 987P de E. Coli en suero, calostro, leche de hembras y en suero y heces de lechones, en diferentes períodos post-parto. (Expresado en Mg ± SD)

Respecto a los títulos de IgG anti-pili 987P de E. coli presentes en el calostro (2 días post-parto) y leche de hembras obtenida en dos períodos diferen­tes (4 y 10 días post-parto) muestran una fuerte disminución en la leche con respecto al calostro (p =< 0,01) (Figura 1).

Los títulos de inmunoglobulina G anti-pili 987P de E. coli en fecas de lechones no mostraron una disminución significativa (p = 0,067), en los tres períodos muestreados (Figura l).

Títulos de inmunoglobulina A secretora anti-pili 987P de E. Coli.

Los títulos de IgA secretora anti-pili 987P de E. coli obtenidos en la leche a los 4 y 10 días post-parto con respecto al calostro (2 días post-parto) muestran un aumento estadísticamente significativo (p =< 0,01) (Figura 2).

En las heces de los lechones se evidenció una alta variabilidad en los tres momentos muestreados, en cuyo caso no se recomienda hacer análisis de va­rianza, por la poca confiabilidad de los parámetros (Figura 2).

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Figura 2. Distribución de los niveles de anticuerpos de clase IgA secretora anti-pili 987P de E. coli, en calostro y leche de hembras, y en heces de lechones, en diferentes períodos post-parto. (Expresado en MG ± SD)

Discusión

La suspensión de 'pili' obtenida de la cepa de Escherichia coli OC: K87: 978P mostró por microscopía electrónica corresponder a pili, indicando que la técnica de purificación utilizada permite la obten­ción de pili de una forma simple y de una pureza adecuada. La microscopía electrónica confirma ser una técnica que permite evaluar adecuadamente la presencia de pili en las bacterias.

Los títulos de anticuerpos de clase IgG e IgA secretora anti-pili 987P de E. coli, evidenciarían que en las madres y lechones del plantel estudiado podría existir un nivel adecuado de anticuerpos anti-pili de la cepa enteropatógena de E. coli aislada en la Región Metropolitana.

Los niveles de inmunoglobulina G anti-pili 987P de E. coli presentes en el suero de la madres y lechones son inicialmente similares, pero luego hay una disminución más acentuada en los lechones, lo que es explicado por tratarse de una inmunidad pasiva que siempre posee menor duración en el tiempo que la inmunidad activa de las madres (Banks 1982).

En cuanto a los niveles de IgG anti-pili 987P en calostro y leche de hembras, nuestros resultados son concordantes con otros trabajos publicados an­teriormente (Butler, 1973; Norcross, 1982; Opde­beeck, 1982), en el sentido de que el calostro es una fuente más importante de IgG que la leche, ya que esta inmunoglobulina proviene directamente de los niveles séricos maternos, lo que se refleja por una concentración similar en el calostro y suero, que luego disminuye al transcurrir el tiempo.

Diferente es el comportamiento de los títulos de IgA secretora anti-pili 987P en el calostro y leche. Se aprecia que esta inmunoglobulina tiene una dis­tribución totalmente opuesta a la IgG, de tal modo que su mayor concentración se encuentra en la leche y no en el calostro. A1 respecto se sabe que existe una síntesis local de IgA secretora, luego que linfo­citos sensibilizados en el lumen intestinal migran hasta la glándula mamaria y ello explica el ascenso de esta inmunoglobulina en la leche (Norcross, 1982; Schoneweis y Henry, 1982).

Al revisar los títulos de IgA secretora e IgG anti-pili 987P en las heces, aparentemente hay un predominio de la IgA secretora que experimenta un aumento en el tiempo y que corresponde exacta­mente con lo que ocurre en la leche, por lo tanto es indiscutible la influencia de los niveles lácteos de IgA secretora en los niveles fecales del lechón. En cambio la presencia de IgG en las heces es práctica­mente indetectable, pero experimenta un comporta­miento muy similar a los niveles séricos de los lechones.

El alto nivel de anticuerpos de clase IgG e IgA secretora anti-pili 987P E. coli encontrado, de muestra que el plantel porcino estudiado tiene un manejo que permite tener un adecuado nivel inmu­nológico, con títulos de anticuerpos específicos que aseguran mantener a los cerdos sin indicios clínicos de problemas gastroentéricos debido a este serotipo de E. Coli.

Esos niveles promedio de anticuerpos específi­cos detectados pueden servir para éste y otros tipos de pili a futuro, para establecer un nivel inmunoló­gico basal a considerar en la selección de aquellas hembras destinadas a la masa reproductiva o como nodrizas de un plantel. Por otra parte, no debe olvidarse la importancia de obtener 'pili' purifica­do y utilizarlo como vacuna en la profilaxis de esta enfermedad. Indudablemente, ambos aspectos con­tribuirían en gran medida a controlar la colibacilosis que tantas pérdidas económicas ocasiona a la pro­ducción porcina nacional.

Referencias

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Recibido agosto 1986; aprobado octubre, 1986.