Ha sido de especial interés para los investigadores la obtención de métodos que reflejen en mejor medida la capacidad fertilizante de los espermatozoides en las diversas especies. Para ello, se han ideado una serie de técnicas in vitro, cuyo objetivo principal es determinar cuántas y/o cuáles células espermáticas son funcionalmente competentes para llevar a cabo el proceso de fecundación (Garner, 1984). Estos métodos pueden ser físicos, bioquímicos o biológicos. Dentro de estos últimos resulta de gran importancia evaluar la interacción entre los espermatozoides y el mucus cervical.
Las pruebas de migración espermática en mucus cervical han sido consideradas de gran valor como medio para evaluar la capacidad fertilizante de los espermatozoides. Una alternativa al mucus cervical es el empleo de un medio sintético, el gel de poliacrilamida para los ensayos de migración en tubos capilares (Kummerfeld y col., 1981) ya que es posible elaborarlo en grandes cantidades; b) es uniforme; c) es posible almacenarlo por varios meses a bajas temperaturas sin variaciones en la penetración de los espermatozoides (Lorton y col., 1981).
El objetivo del presente trabajo fue estudiar el comportamiento de la penetración espermática en gel de poliacrilamida, como método de estimación de la fertilidad potencial en los reproductores caprinos.
Se utilizaron 6 caprinos criollos (Capra hircus), clínicamente sanos, a los que se les extrajo semen dos veces por semana por medio de estimulación eléctrica (electroeyaculación), durante el período invierno-primavera, obteniéndose un total de 54 eyaculados.
Luego de la recolección, cada muestra fue evaluada inmediatamente a través del espermiograma convencional según las metodologías propuestas por Díaz y Arancibia (1971), determinándose las siguientes características: volumen, color, pH, concentración, motilidad progresiva y anormalidades espermáticas.
La prueba de penetración espermática se realizó con semen fresco diluido y semen descongelado, en ambos casos los diluyentes estaban compuestos por solución buffer más yema de huevo y además glicerol (5%) para el semen descongelado.
Se realizaron dos repeticiones en la migración en cada tipo de muestra. Para tal efecto, se empleó la cámara de doble penetración espermática descrita por Kremer (1965). Como medio de migración se utilizó el gel de poliacrilamida (Lorton y col., 1981; Kummerfeld y col., 1981) con una concentración de acrilamida de 1,8%. Este medio sintético se depositó dentro de tubos capilares para microhematocrito (7,0 cm de longitud y 1,1 mm de diámetro interior), luego se selló en uno de sus extremos con masilla. El extremo opuesto con una pequeña protrusión de gel, se puso en contacto con el semen ubicado en los receptáculos de la cámara. Posteriormente esta cámara se incubó horizontalmente a 37°C en un ambiente húmedo (Kremer, 1965; Arzumendi, 1985). La penetración espermática se determinó a los 15, 30 y 45 minutos de incubación, midiéndose así la distancia de migración (Lorton ,y col., 1981); para este fin se utilizó un microscopio de fase contrastada con aumento menor (10x).
El análisis estadístico de los datos se realizó mediante análisis de varianza y prueba de los rangos múltiples (procedimiento de Scheffe) para cada variable cuantitativa y para la prueba de penetración espermática en los diferentes tiempos. Se efectuó también la prueba de t de Student para estimar las diferencias en la migración espermática entre el semen fresco y descongelado. Además se hicieron correlaciones y regresiones entre algunas variables en estudio (Sokal y Rohlf, 1969).
Los valores de las variables seminales medidas a través del espermiograma convencional (cuadro 1), se encontraron dentro de los rangos normales para la especie caprina (Foote, 1980; Mann, 1980; Dundar y col., 1983; Rubio, 1986).
CUADRO 1 VALORES DE LAS CARACTERISTICAS CUANTITATIVAS EN SEMEN FRESCO DE CAPRINO CRIOLLO ( ± DE)Caracteristicas | ------- Chivato N° ------ | ||||||
1 n=5 | 2 n=10 | 3 n=10 | 4 n=10 | 5 n=10 | 6 n=9 | ± D.E. n=54 | |
Volumen (ml) | 0,84±0,05a | 0,98±0,47a | 1,29±0,31ab | 1,01±0,08a | 1,82 ±0,59b | 2,01± 0,69b | 1,35±0,61 |
pH | 7,00±0,07 | 6,90±0,34 | 6,94±0,31 | 6,75± 0,34 | 6,65 ± 0,31 | 7,00 ± 0,30 | 6,85±0,32 |
Concentración 109 esp/ml | 2,37±0,70ab | 4,07±2,13a | 3,42±1,87ab | 2,96±2,21ab | 5,72± 2,88b | 2,06±1,82a | 3,59±2,36 |
N°espermatozoides totales/eyaculado | 2,28±0,55a | 4,38±3,08 | 4,45±2,93a | 2,94±2,05a | 10,84±7,65b | 3,62±2,83a | 5,00±4,83 |
Nº espermatozoides móviles/eyaculado | 2,17±0,51a | 4,11±3,09a | 4,26±3,01a | 2,87±2,01a | 10,82±7,66b | 3,35±2,74a | 4,84±4,86 |
Motilidad progresiva (%) | 95,0±3,53ab | 89,5±7,24a | 92,5±7,54ab | 96,5±3,37ab | 99,00±1,58b | 90,55±5,27a | 93,88±,26 |
Anormalidades espermáticas ------------------------------------------------------------------------------------------ | |||||||
Cabeza acrosoma (%) | 0,8±0,75 | 0,40±0,45 | 0,35±0,52 | 0,25±0,35 | 0,35 ± 0,41 | 0,33±0,35 | 0,37±0,46 |
Cuello T. intermedio (%) | 0,7±0,57 | 0,55±0,59 | 0,55±0,36 | 0,55±0,49 | 0,55 ± 0,49 | 0,44±0,39 | 0,54±0,46 |
Cola (%) | 3,0±0,61ab | 4,00±2,05b | 1,45±0,68a | 1,75±1,29a | 2,05±1,23ab | 2,61±0.92ab | 2,42±1,51 |
Totales (%) | 4,5±0,61ab | 4,95±2,14b | 2,35±1,37a | 2,55±1,62ab | 2,95±1,53ab | 3,38±1,21ab | 3,35±1,77 |
* No existen diferencias significativas entre individuos para esta caracteristica (p 0.05) abLetras distintas indican diferencias significativas entre individuos (p < 0,05) |
Se observó que la penetración espermática, en ambos tipos de muestras presentó un comportamiento acelerado durante los primeros 15 minutos, disminuyendo gradualmente su velocidad hasta los 30 minutos, y estabilizándose entre los 35 y 45 minutos de incubación (figura 1). Este comportamiento es similar al observado por Beltrán (1983), Vidal (1983) y Arzumendi (1985), pudiendo ser explicado porque la aceleración espermática inicial causa una disminución en el contenido de ATP mitocondrial, ya que el espermatozoide requiere de energía para realizar el movimiento flagelar y para vencer la resistencia que opone el mucus (Mann, 1973); de esta forma, al cabo de un tiempo de migración, el contenido de ATP se hace insuficien..te para mantener la velocidad espermática inicial. Al respecto, Rubio (1986), encontró una correlación positiva (r = 0,41) entre la motilidad de masa y el contenido de ATP para semen caprino fresco, lo que confirma el hecho de que la motilidad espermática es dependiente del contenido energético que posean los espermatozoides.
Figura 1. Curva de regrsión de la penetración espermática según tiempo en semen fresco y descongelado. |
Kesseru (1973), trabajando con semen humano fresco y mucus cervical humano, encontró una penetración de 21 ± 1 mm a los 10 minutos de incubación. Mediante la función de regresión para semen fresco calculada en este trabajo (figura 1), se pudo estimar que la penetración espermática a los 10 minutos de incubación promedió 23 mm, valor similar al encontrado por este autor; sin embargo, a los 30 minutos de incubación, el valor señalado por el autor antes citado es superior al que se observó en este estudio (51 ± 2 vs 38,1 ± 7,2 mm), lo que podría indicar que el espermatozoide humano posee una reserva energética mayor a la del caprino, hecho que es confirmado por Rubio (1986), quien obtuvo una concentración media de ATP de 39,17 x 10-7 mM/ 106 espermatozoides para semen caprino, comparado con 87,0 x 10-7 mM/106 espermatozoides en semen humano (Comhaide y col., 1983).
La migración espermática en los tres tiempos de medición mostró una diferencia significativa (P < 0,05) entre el semen fresco y el descongelado (cuadro 2). Los valores obtenidos con semen descongelado (cuadro 2), son inferiores a los que se indican para la especie bovina, cuando ésta se realiza con mucus cervical bovino (Kummerfeld y col., 1981; Beltrán, 1983; Vidal, 1983) o con el gel de poliacrilamida (Lorton y col., 1981; Arzumendi, 1985), pudiendo atribuirse esta diferencia a un efecto de la especie en que se realiza la prueba.
CUADRO 2 PENETRACION ESPERMATICA (mm) A LOS 15, 30 y 45 MINUTOS EN GEL DE POLIACRILAMIDA ( D E)Penetracion espermática(mm) | ---- Chivato N° -------- | |||||||
1 n=5 | 2 n= 10 | 3 n= 10 | 4 n= 10 | 5 n= 10 | 6 n=9 | ± D. E. n=54 | ||
Semen Descongelado | 15 Minutos | 30,6±4,8ab | 28,8±6,3ab | 33,0±5,7ab | 35,3±6,8ab | 37,4±4,6b | 28,0±3,9a | 32,44±6,38 |
30 Minutos | 37,1±8.7ab | 34,3±6,6ab | 38,7±6,8ab | 41,4±7,5ab | 43,3± 5.3b | 32,8±3,8a | 38,14±7,26 | |
45 Minutos | 38,8±9,4ab | 36,2±7,4ab | 40,7±7,4ab | 43,3±7.7ab | 45,6±6,3b | 33,8±3.8a | 39,97±7,89 | |
Semen fresco | 15 Minutos | 11,7±1,3a | 15,5±5.6ab | 20,9±4,7ab | 25,0±8,7b | 24,8±8.0b | 16,3±6.56ab | 19,82±7,85 |
30 Minutos | 13,4±1,9a | 18,3±6,4ab | 25,3±6,0ab | 29,2±10.7b | 30,1±1.4b | 19,2±7,29ab | 23,5±9,84 | |
45 Minutos | 13,5±2,0a | 19,1±6.4ab | 26,7±65ab | 30,7±10.7b | 31,4±12,2b | 19,9± 7,2ab | 24,6±10,27 | |
abLetras distintas indican diferencias significativas entre individuos(p < 0.05) |
La morfología espermática es otro factor importante que determina la capacidad de penetración de los espermatozoides, encontrándose correlaciones negativas entre la penetración espermática y el porcentaje de anormalidades (David y col., 1979). Sin embargo, Alexander (1981), señala que esta característica no sería un factor relevante para la penetración espermática, a menos que los eyaculados posean un alto porcentaje de teratospermia. En este estudio, no se observó una correlación significativa entre las anormalidades espermáticas y los resultados de la prueba de penetración en semen fresco, pero éstas sí tuvieron influencia cuando se realizó con semen descongelado (cuadro 3). Esto se debió al bajo porcentaje de anormalidades totales presentes en el semen fresco (3,35 ± 1,7%), las cuales aumentaron luego del proceso de congelación (6,39 ± 2,4%).
La motilidad progresiva es el factor más relevante en la capacidad de penetración espermática, cuando la morfología y concentración espermática se encuentran dentro de los rangos normales (David y col., 1979). Según Goldstein y col. (1982), la motilidad es la característica seminal que presenta la mayor correlación con la penetración espermática (r = 0,62), pudiendo verse disminuida a causa del fenómeno de inmunidad antiespermática. En este trabajo, la motilidad inicial se correlaciona significativamente (p < 0,05) con la penetración espermática en semen fresco y descongelado (cuadro 3).
Por su parte, Amit y col. (1982), señalan que en el humano la velocidad espermática medida por el método de exposición múltiple (M E P) está altamente correlacionada con la motilidad progresiva, morfología espermática y penetrabilidad en mucus cervical; sin embargo, Rubio (1986), no encontró una asociación significativa para el caprino entre las variables medidas por M E P (velocidad y motilidad objetiva) y las obtenidas mediante evaluación convencional, posiblemente a causa de la alta concentración espermática, propia de esta especie, la cual alteraría de una u otra forma los resultados del método M E P.
Al comparar las curvas de regresión para la penetración espermática (figura 1) entre semen fresco y descongelado, se observa que este último presenta una tendencia semejante al obtenido en semen fresco, pero de menor magnitud (p < 0,05); esta disminución también es evidente en la motilidad progresiva. El descenso en ambas características seminales puede explicarse por los cambios bioquímicos y morfológicos que ocurren durante el proceso de congelación y descongelación (Goldstein y col., 1982). Al cuantificar este descenso, es posible evidenciar una disminución mayor en la motilidad (de inicial a postdescongelación) que en la penetración espermática; este fenómeno no ocurre si se considera como valor inicial la motilidad obtenida al diluir el semen en 'buffer' donde el descenso de la motilidad es proporcional al descenso de la penetración espermática.
CUADRO 3 COEFICIENTE DE CORRELACION PARA VARIABLES CUANTITATIVAS MEDIDAS EN SEMEN FRESCO Y DESCONGELADO
Variables correlacionadas |
r* |
Anormalidades totales postdescongelación Penetración espermática (PE) postdescongelación 15 minutos |
- 0,3556 |
Anormalidades totales postdescongelación PE postdescongelación 30 minutos |
- 0,3339 |
Anormalidades totales postdescongelación PE postdescongelación 45 minutos |
- 0,3437 |
Motilidad progresiva inicial (MPI) PE 15 minutos |
0,3829 |
MPI PE 30 minutos |
0,4134 |
MPI PE 45 minutos |
0,4140 |
MPI PE postdescongelación 15 minutos |
0,3244 |
MPI PE postdescongelación 30 minutos |
0,3498 |
MPI PE postdescongelación 45 minutos |
0,3662 |
*/p < 0.05 |
Este hecho confirma nuevamente que la motilidad progresiva medida en semen fresco sin diluir no es un buen indicador de la fertilidad potencial del semen caprino, dado que está altamente influenciado por la concentración espermática del eyaculado.
La curva de regresión para la penetración espermática, tanto en semen fresco como descongelado (figura 1), permite observar que más allá de los 30 minutos de incubación, la distancia de penetración no aumenta significativamente (p < 0,05), por lo que no sería necesario realizar mediciones luego de este tiempo de incubación; esta observación puede proporcionar antecedentes para investigaciones futuras sobre la prueba de penetración espermática enla especie caprina
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Recibido el 18 de agosto de 1989; aprobado el 1 ° de diciembre de 1989. |